免疫低下アダルトゼブラフィッシュへの正常および悪性筋細胞移植

この手順の目的は、正常および悪性筋肉の調製と移植方法を実演することです。移植は、トランスジェニックドナーゼブラフィッシュからrag2免疫不全ゼブラフィッシュ受容体に行われます。筋肉の移植では、まず背部筋肉の解剖により、蛍光標識された筋肉を単離します。

ゼブラフィッシュの筋肉をホモジナイズした後、筋細胞をろ過して単一細胞懸濁液を作成します。次に、これらの細胞をrag2変異ゼブラフィッシュの筋肉内に移植します。その後、エピ蛍光顕微鏡を用いて、移植後10日目などの早い段階からレシピエント動物における組織生着を追跡します。同様に、原発性胚性横紋筋肉腫を採取して懸濁液を作成し、rag2変異ゼブラフィッシュの腹腔内に移植することも可能です。

その後、顕微鏡を用いて組織の生着を追跡し、増殖した腫瘍細胞をダウンストリームのアプリケーションに利用することができます。免疫不全の成体ゼブラフィッシュを用いた細胞移植の主な利点は、さまざまな組織や腫瘍型の同種移植における汎用的なプラットフォームを提供できることです。これにより、レシピエント魚での免疫抑制を行うことなく、多様なドナー遺伝的背景を持つ組織を移植することが可能になります。

この手法は、前駆細胞の自己複製能など、幹細胞および再生生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、これらの手法を用いてrag2変異魚に腫瘍を移植し、例えば腫瘍の増殖を抑制するような新規化合物を同定することも可能です。正常および悪性筋細胞の調製と移植の実演は、LALラボの優秀な大学院生2名によって行われます。まず、蛍光標識された筋肉を持つドナーゼブラフィッシュを安楽死させることから開始します。

一般的な成体のalpha acting RFPドナー魚からは、500,000から200万個の筋肉細胞が得られます。今回の例示実験では、ドナー魚30匹分を用い、レシピエント魚20匹にそれぞれ100万個ずつの細胞を移植します。ドナー魚を安楽死させた後、使い捨てのペーパータオルの上に置いて動物の水分を除去します。

カミソリを使用して背部筋肉を採取します。切開は肛門領域の後方から45度の角度で行い、骨と皮膚組織も含めてください。採取した背部筋肉のセクション10個を清潔なペトリ皿に移します。その後、冷却した0.9 XPBS 5%FBS懸濁バッファーを500 µL加えます。

次に、5 mL セロロジカルピペットを用いて組織を完全に均質化し、均一な懸濁液が得られるまで組織を細切します。均質液に 2 mL の懸濁バッファーを加え、ピペットで懸濁液を20回吸い上げ、吐き出しを繰り返します。続いて、40 µm ストレーナーを用いて懸濁液をろ過し、細胞を 50 mL コニカルチューブに回収して氷上に置きます。以降の手順の間、細胞は常に低温に保ってください。

ストレイナーに残っている組織を2.5 millilitersの懸濁バッファーで洗浄し、50 milliliterコニカルチューブにろ過します。次に、トリパンブルーを用いて生存細胞の総数をカウントし、4°Cにて1000 Gで10分間遠心分離して細胞を濃縮します。その後、細胞を0.9 XPBS（5%FBS含有）に再懸濁し、濃度を333,000 cells/µLに調整します。

ドナー細胞数が限られている場合は、注入細胞数が50,000個という少量であっても、生着に成功することがあります。まず、2〜4ヶ月齢のrag2欠損魚をtricaで麻酔します。鰓蓋の動きが緩やかになり、魚が静止したら、魚の左側が上になるように湿ったタオルの上に移動させます。

次に、あらかじめ洗浄済みの10 µL、26 Gマイクロシリンジを用いて、調製した筋肉細胞懸濁液を3 µL注入します。注入は45度の角度で行い、レシピエント魚の背外側筋に直接注入してください。筋内移植を行う際は、レシピエント魚に注入する総量が3 µLを超えないようにすることが重要です。その後、レシピエント魚を、清浄な魚類飼育水が入ったリカバリータンクに慎重に移動させます。

残りの魚に注射を続け、それらを1つの回復タンクに入れます。その後、移植後10日、20日、30日の時点で、明視野顕微鏡およびエピ蛍光顕微鏡を用いて生着率を評価します。各腫瘍は個別に処理します。

胚性横紋筋肉腫を患っている魚を安楽死させます。魚を清潔なペトリ皿に移し、カミソリと微細ピンセットを用いて、腫瘍を非悪性組織から切り出します。腫瘍周囲を慎重に解剖することで、周囲の筋肉組織の混入を最小限に抑え、より純度の高い細胞懸濁液を得ることができます。切り出した腫瘍を新しい皿に移し、あらかじめ冷却しておいた0.9 XPBS 5%FBS懸濁緩衝液を100 µL加えます。

次に、均一な懸濁液が得られるまで、カミソリの刃で組織を細かく刻みます。その後、1 mLピペットを用いてバッファーをさらに900 µL加え、トリチュレーションを行います。細胞を解離させるため、ピペットで懸濁液を数回的に吸い上げ、吐き出します。

次に、細胞を40 micronのセルストレーナーでろ過します。さらに2〜4 mLの懸濁液とバッファーを加えてプレートを洗浄し、同じセルストレーナーでろ過します。前述の方法で細胞を濃縮します。

細胞を氷上に保持します。次に、細胞を100 µLのバッファーで再懸濁し、トリパンブルーを用いて生存細胞数をカウントします。細胞懸濁液の濃度を5,000 cells/µLに調整します。

次に、免疫不全のレシピエントゼブラフィッシュを麻酔し、腹側を上にして清潔なペーパータオルの上に置きます。洗浄済みの26 Gシリンジ針を使用し、レシピエントゼブラフィッシュの腹腔内へ目的の容量を注入します。

5 µLで25,000個の細胞を注入します。ただし、最大10 µLまで注入可能です。注入後の魚は、メインシステムに戻す前にリカバリータンクで回復させてください。

その後、エピ蛍光顕微鏡を用いてレシピエント魚の生着を確認し、ダウンストリーム解析のために細胞を回収します。上述の手順に従い、$\alpha$-actin RFP 転遺伝性ドナー由来の骨格筋細胞を、免疫不全の homozygous rag2 変異ゼブラフィッシュに移植しました。回収した骨格筋組織から調製した単細胞懸濁液において、DPI 除外法による評価で 84.3% の生存細胞が確認されました。

フローサイトメトリー解析の結果、このドナー細胞懸濁液においてRFP陽性細胞は35.3%を占めていた。RAG2ホモ接合体変異レシピエント魚の背側骨格筋に細胞を移植したところ、一貫して強力な移植片の形成が認められた。これは、レシピエント魚における多核の蛍光筋繊維の形成によって確認された。一方、野生型レシピエント魚では筋繊維の生着は認められなかった。

しかしながら、移植後10日までに、変異ゼブラフィッシュ14匹のうち9匹において、注入部位付近にRFP陽性の筋線維が認められました。重要なことに、移植されたRFP陽性の筋肉は、移植後少なくとも30日まで持続しました。同様に、RAG2変異魚への胚性横紋筋肉腫（ERMS）の移植後においても、強固な生着が得られました。

移植されたERMSは、原発性ERMS腫瘍と共通の組織学的特徴を示し、蛍光解析により評価したところ、腫瘍細胞の不均一性が維持されていることが確認されました。このビデオを視聴することで、免疫不全の成魚をレシピエントとして用い、正常組織および悪性組織の筋肉移植および腹腔内移植を行う方法について十分に理解することができます。その後、フローサイトメトリー（FACS）、限界希釈移植解析、リアルタイムPCRなどの他の手法を用いて、異なる腫瘍サブポピュレーション間の機能的および分子的な差異を評価することが可能です。

全体として、本手法により、免疫不全のRAG2変異魚への蛍光筋肉および悪性組織の強固かつ長期的な生着が可能となります。この手法の利点は、レシピエント魚への事前の免疫抑制を必要とせず、ドナー動物とレシピエント動物の免疫学的マッチングも不要である点にあります。