組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用

次の実験の全体的な目標は、組織の変性および再生の研究、および癌研究のために、in vivoおよびin vitroで2つのマウス誘導性maseノッキング対立遺伝子を操作することです。これは、ヒドロキシタモキシフェン錠を動物に移植して、in vivoでマセを再活性化することによって達成されます。第2のステップとして、神経幹細胞を動物から単離し、ヒドロキシタモキシフェンで処理してin vitroでマセを再活性化します。

次に、Cの2つのハイブリダイゼーションまたは魚類におけるテロメア蛍光を、培養細胞と形式的および固定されたパラフィン包埋脳組織の両方に対して行い、マセの活性を確認する。その結果、ヒドロキシタモキシフェン治療は、病理組織学的検査に基づいて、老化表現型の緩和と腫瘍形成の促進の両方において、MASE活性を強力に再活性化できることが示されました。この方法は、THの外傷活動を調節することで老化プロセスを遅らせることができるかどうか、またはトーマスをがん治療に特異的に標的にする方法など、老化およびがん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手順を実演していただくのは、私の研究室の新宮隆先生と技師のエイプリル・ウン先生です。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、Turt ERおよびロックストップロックタート対立遺伝子の生成から開始し、注射前にすべての手術器具を滅菌し、テキストプロトコルに記載されているようにマウスに麻酔をかける。深い麻酔に達した後、麻酔をかけた動物を誘導チャンバーから取り出し、頭をイソフッ素チャンバーに接続されたチューブ内に保ちます。

マウスのフットパッドをつまんで、動物が深く麻酔されていることを確認します。また、両目に軟膏を塗ります 目が抜けるのを防ぐために、マウスの背中をポビドンヨウ素溶液で拭きます。次に、徐放性ヒドロキシタモキシフェンペレットに精密トロカールを背中の皮膚の下に注入します。

そして、ペレットを2つの肩の間の正中線まで押し込みます。創傷クリップアプライヤーで切開部を密封し、マウスの回復を監視します。麻酔に。

1日マウスの脳を取り出し、嗅球と小脳を取り外して4つの脳を保持します。4つの脳組織を1ミリリットルの冷培地に入れ、摂氏4度で保存します。神経組織を1時間以内に処理するようにしてください。

組織の重量を決定して、消化あたりの400ミリグラムの制限を超えないようにします。直径35mmのシャーレの蓋に脳をのせ、メスで脳を潰します。1ミリリットルのピペットチップを使用して、ハンクのバランス塩溶液またはHBSSを1ミリリットル加えます。

次に、HBSS遠心分離機でGの300倍を室温で2分間すすいだ後、ピースを15ミリリットルのチューブにピペットで戻します。上清を慎重に取り除いた後、予熱した酵素を1, 950マイクロリットル加えます。ティッシュ400ミリグラムまで1個混ぜます。

サンプルを15ミリリットルチューブ内で摂氏37度で15分間インキュベートします。5分ごとにチューブを反転または振とうして、サンプルを混合します。次に、30マイクロリットルの酵素を準備します 20マイクロリットルの溶液、3〜10マイクロリットルの溶液4を追加して、組織サンプルごとに2つを混合します。

次に、サンプルに静かに反転させて混合し、幅の広い先端の火で磨かれたペーストピペットを使用して、気泡の形成を避けながら10回ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、組織を機械的に解離させます。37°Cで10分間インキュベートし、3分ごとにチューブを反転させます。次に、50ミリリットルのチューブに載せた70ミクロンのセルストレーナーに細胞懸濁液を塗布します。

10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSをセルストレーナーを通して塗布します。次に、細胞ストレーナーを廃棄し、細胞懸濁液をGの300倍で20分間遠心分離します。遠心分離後、室温を設定し、上清を完全に吸引します。

幹細胞培地で細胞を必要な容量に再懸濁し、テレアレイインロックを活性化するためのさらなるアプリケーション、ストップロックを行います。タート神経幹細胞。細胞を100マイクロモルのヒドロキシタモキシフェンで2日間処理し、エマーゼおよびターター神経幹細胞を活性化します。

細胞を100マイクロモルのヒドロキシタモキシフェンを含む培養培地に保持して、テロメアフィッシュを実行します。まず、培養細胞から中期染色体をホルマリン固定およびパラフィン包埋またはFFPE組織切片用に調製します。サンプルをキシレンでparizeし、エタノールシリーズでそれぞれ5分間、PBSで5分間再水和します。

次に、メタノールと酢酸の3対1の比率で切片を1〜2時間後置します。冷エタノールシリーズの切片をそれぞれ5分間脱水し、1つのXPBSで摂氏37度で5分間風乾洗浄します。次に、4%ホルムアルデヒドの染色体を摂氏37度で2分間染色します。

以前と同様に冷たいエタノールシリーズの切片を脱水し、乾いたら風乾し、12〜25マイクロリットルのペプチド核酸ハイブリダイゼーション混合物を各スライドに塗布します。カバースリップをゴムセメントで密封し、天然の染色体調製物と組織切片を摂氏80度で4分間貼り付けます。次に、室温または摂氏37度で、湿度の高いチャンバーで2〜4時間ハイブリダイズします。

次に、サンプルを室温で洗浄バッファーを使用して15分間2回洗浄します。その後、室温でPBSで5分間洗い、23回トゥイーンします。最後に、顕微鏡検査のためにスライドをDPIまたは遠赤色蛍光で対比染色します。

テロメアが機能不全マウスで一過性に再活性化されたとき、脳や精巣などの複数の臓器で変性表現型を改善して、テロメアの再活性化が細胞に与える影響を決定することができました。培養したin vitro神経幹細胞を、後期世代のG four lock stop lock、TURT、およびG four turt ERマウスから単離しました。テロメア機能不全の神経幹細胞でテロメアを再活性化すると、自己複製能力が大幅に向上しました。

インビトロの神経新生も有意に増強され、テロメア機能障害の文脈で腫瘍形成に対するマセ再活性化の影響を決定し、タモキシフェン治療によるマセ再活性化を前立腺腫瘍モデルで実施しました。EndotのT細胞リンパ腫モデル。この治療により、両モデルで腫瘍形成が大幅に改善されました。

最後に、テロメアフィッシュはFFPE、マウスブレイン組織、および中期染色体で行われました。これらの画像では、赤はDNAを示し、緑はテロメア染色を示し、シアンはセントロメア染色を示します。このビデオを見れば、mTOR ERおよびロックストップロック、mTOR動物および細胞株における外傷活動の活性化方法、およびそれらを使用してがんおよび病原体の問題を研究する方法について十分に理解できるはずです。