Name: 組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を用いた組織変性・再生とがん研究の手法。ヒドロキシタモキシフェン投与とFISH解析により、テロメラーゼ再活性化が老化緩和と神経幹細胞の自己更新を促進することを示す。

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J.H.は、NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) と NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001) の支援を受けています。

注：このプロトコルのすべてのステップは、UT MDアンダーソンがんセンターによって承認されている。 mTERT-ER対立遺伝子の1世代<ol><li>マウスのES細胞に液体酸素断片（ 図1A） - PGK - - ネオノックインERT2-LBD（リガンド結合ドメイン）を含むベクトル上流とmTERTゲノム配列（イントロン2を通じてエクソン1） および LOXとインフレームでをターゲットに紹介エレクトロポレーションを持つ。 </li><li> 6-10日間の培養のネオマイシンでES細胞。ネオマイシン耐性クローンをピックアップし、48ウェルプレートで展開します。市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出し、サザンブロットによってノックイン対立遺伝子を確認する。 </li><li>倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーションキットをC57BL / 6胚盤胞に95％以上の正常な核型を持つ2のESラインを注入します。代理母23の子宮に胚盤胞を移植。 C57BL / 6 FEにハイグレード男性キメラ（70から90パーセント）をメイト男性。 </li><li>サザンブロットによってヘテロ接合mTERT-ERneo動物の遺伝子型判定を確認してください。 </li><li>のNeoRカセットを削除するには、ヘテロ接合mTERT-ERneo動物とEIIA-CRE動物メイト。ホモ接合を生成するために少なくとも3倍、さらにインターブリードヘテロ接合mTERT-ERの動物C57BL / 6動物にヘテロ接合性動物を交尾。 </li></ol> LSL-mTERT対立遺伝子の2世代<ol><li> トリプルストッパー - - ネオ -エレクトロポレーション23と、マウスのES細胞へのLoxP断片と（エクソン1およびイントロン2の間に、 図1B）mTERTゲノム配列ノックインのLoxPを含むベクトルをターゲットを導入する。 </li><li> 6-10日間の培養のネオマイシンでES細胞。ネオマイシン耐性クローンをピックアップし、48ウェルプレートで展開します。市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出し、サザンブロット23でノックイン対立遺伝子を確認する。 </li><li>麟蹄倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーションキットをC57BL / 6胚盤胞へのCTの95％以上が正常な核型を持つ2のESラインを。代理母23の子宮に胚盤胞を移植。 C57BL / 6雌ハイグレード男性キメラ（70から90パーセント）をメイト。 </li><li>サザンブロットによってヘテロ接合LSL-mTERT動物の遺伝子型判定を確認してください。 </li><li>ホモ接合性を生成するには、少なくとも3回のC57BL / 6匹、さらにインターブリードヘテロ接合LSL-mTERT動物とヘテロ接合動物メイト。 </li></ol> インビボでのmTERT-ERとLSL-mTERTマウスにおけるテロメラーゼの3。再活性化 mTERT-ERの場合<ol><li>注射の前に、すべての手術器具を滅菌する。 </li><li> 50％（v / v）の酸素/ 50％（v / v）の一酸化二窒素のガス混合物中のイソフルラン室（誘導に4％、維持に2％）を有するマウスを麻酔。またはケタミン - キシラジン混合物（100メートルによりマウスを麻酔グラム/ kg体重+は10mg / kg体重）。 </li><li>深い麻酔に達した後、誘導室から麻酔した動物を削除し、イソフルラン室（2％）に接続されたチューブの内側に頭を維持する。 </li><li>動物が深く麻酔していることを確認するために、マウスの足のパッドをピンチ。乾燥から目を防ぐために、両眼に軟膏を入れてください。ポビドンヨード溶液を用いてマウスの背中を拭いてください。 </li><li>背中の皮膚の下に精密トロカール（10g）でペレット化し、すべての方法2肩の間正中線にペレットをプッシュ遅い放出4-OHTを注入。 </li><li>創傷クリップアプライヤーとの切開を密封し、麻酔からの回復のためのマウスを監視します。 10日後にクリップを削除します。手順がまもなく終了したので、補足熱は必要ありません。 </li><li> 4-OHTのペレットを用いた治療の期間は、研究の目的に応じて最適化されるべきである。 </li></ol> LSL-mTERTの場合 &lt;OL&gt; <li>タモキシフェン（10mg / mlの、コーン油に溶解した）（200μlの/ 25 g /日）を腹腔内に2日間連続注入する。 </li></ol> 4.神経幹細胞の単離およびインビトロでテロメラーゼの再活性化<ol><li>マウスは二酸化炭素で安楽死させ、脳を除去する。メーカーごとのような市販の神経組織解離キットのプロトコールに従ってください。 </li><li>ボルテックスしないソリューション4.のための細胞培養培地1mlで溶液4ラベルバイアル中に凍結乾燥粉末を再懸濁ください。次いで、この溶液を分注し、後の使用のために-20℃で保存されるべきである。 </li><li>プレヒート使用前に15分間37℃で混合物。 </li><li>溶液1（50μL）と溶液2（1900μL）：酵素ミックス1を加えます。解決策3（20μL）および溶液4（10μL）：酵素ミックス2を加えます。 </li><li>最大400 mgの組織と渦のために1,950μlの酵素混合物1を準備します。 37℃で混合物を予備加熱する使用前に15分。 </li><li> 1日のマウスの脳を取り出し、そして嗅球と小脳を除去することによって、前脳を保つ。 4℃で除去し、店舗以来、冷たい培養液1ml中の前脳組織にしてください。 1時間以内に神経組織を処理することを確認してください。 </li><li>消化あたり400 mgの限界を超えていないことを確認するために組織の重量を決定します。直径35mmのペトリ皿の蓋の上に脳を置き、メスを用いて脳をつぶす。 </li><li>を1mlピペットチップを用いて、バック15mlチューブにHBSS（ワット/ oののCa / Mg）をピペット片を1ml加える。 HBSS（W / OのCa / Mg）ので洗い流してください。室温で2分間、300×gで遠心し、慎重に上清を吸引。 </li><li>予熱された酵素混合物1の1950μlを加える（ソリューション1および2）、400 mgの組織まで当り。 5分ごとに反転するか、チューブを振とうすることにより混合し、37℃で15分間、15mlチューブ中でインキュベートする。 </li><li> 20＆＃を追加することによって、組織サンプルあたり30μlの酵素ミックス2を準備956;溶液4の10μlに解決策3のlはその後に追加するサンプル。混合する優しく反転。ボルテックスしないでください。 </li><li>機械的にゆっくりと上下にピペッティング10倍ワイド先端、火災研磨パスツールピペットを用いて組織を解離。気泡を形成することは避けてください。 </li><li>チューブを3分毎に反転し、10分間37℃でインキュベートする。 </li><li>ステップ4.11を繰り返し、組織が200ミリグラムより大きくしている場合は、4.12ステップ。 </li><li> 50mlチューブに載置された70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を適用する。セルストレーナーを通して10mlのPBSを適用します。室温で20分間300gで細胞濾過、遠心細胞懸濁​​液を破棄する。完全に上清を吸引。 </li><li>さらなる用途のために必要な体積の幹細胞培地で細胞を再懸濁する。 </li><li> LSL-mTERTのNSCでテロメラーゼを有効にするには、2日間の100μM4-OHTで細胞を処理する。 100μM4で培養液中で細胞を維持し、mTERT-ERのNSCにおけるテロメラーゼを有効にするには-OHT。 </li></ol> 5.テロメアFISH <ol><li>培養細胞からの中期染色体を準備します。 </li><li> FFPE（ホルマリン固定およびパラフィン包埋）組織切片を、キシレンで脱パラフィン化し、5分間エタノール系で再水和する各（100％、90％、70％、50％エタノール）およびPBSで5分間。 </li><li>メタノールでポストフィックス：酢酸（3：1）1〜2時間のために。各5分（70％、90％、100％エタノール）、空気乾燥、冷エタノールシリーズで脱水する。 5分間37℃で1×PBSで洗浄します。 </li><li> 2分間37℃にて4％ホルムアルデヒド中で染色体を変性させる。冷たいエタノール系列で5分間ずつ（70％、90％、100％エタノール）及び空気乾燥を脱水。 </li><li>各スライドにPNAのハイブリダイゼーション混合物の12〜25μLを適用します。 （ハイブリダイゼーション混合物：70％ホルムアミド、0.06xのSSC、0.2％のBSA、0.5 ng /μLでのtRNA、0.5 ng /μLでテロメアまたはセントロメアプローブ） </li><li>ラバーセメントでカバースリップをシール。 4メートル、80℃で後変性の染色体の調製物及び組織切片インチ湿潤チャンバーで2-4時間室温または37℃でハイブリダイズする。 </li><li>洗浄バッファー2×15分間、室温で洗浄する。 （洗浄緩衝液：70％ホルムアミド、0.06xのSSC、pHは7.2）。 PBSTで室温で3×5分を洗ってください。顕微鏡検査のためのDAPIまたは遠赤色蛍光で対比染色スライド。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで、我々は2つの誘導性マウステロメラーゼアレルとどのようにインビボおよびインビトロでテロメラーゼを再活性化するの生成を報告している。 mTERT-ER活性を再活性化するための重要なステップは、タモキシフェンの継続的な濃度を維持することですので、我々はアメリカの革新的な研究によって製造4-OHT時間放出ペレットを使用することを選択。ペレットは最大60日間、1 ng / mlの定常状態血中レベル4OHTを放出保つ。以前の研究では、この戦略にテロメラーゼ活性を再活性化は、そのような幹細胞の消耗、G4 mTERT ER / ERにおいてテロメア機能不全によって誘導された複数の器官における組織損傷応答および臓器不全の障害などの変性表現型を改善することができることを示したマウス20。 老化テロメラーゼの機能を研究する以外には、これらの2つの誘導性テロメラーゼ対立遺伝子はまた、癌を研究するために使用することができる。これまでの研究では、かかったこれらの対立遺伝子の利点は、ゲノムを成形し、T細胞胸腺リンパ腫21と前立腺癌22の生物学に影響を与えるにテロメア消耗とテロメラーゼ活性化の役割を探求する。 - / - mTERT ER / ERおよびG4 PB-Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT L / Lマウスについての早期の変異原性のイベントの取得を給油の機構を提供するこれらの二つの研究は遅れて世代G4 気圧におけるテロメア機能不全があることを示した腫瘍の開始、まだ完全に悪性腫瘍の進行を予防する。テロメラーゼは、テロメア機能不全によって誘発されるゲノム不安定性、DNA損傷チェックポイントおよび横行染色体不安定性との関連で再活性化されたときに、前立腺癌21の骨転移および胸腺の脳の浸潤などの新しい生物学的特性を有する悪性腫瘍の完全な進行を可能にした、抑制されたCリンパ腫21。同様の現象はまた、大腸癌および膵臓癌（DRS。Haoqiang英、アダムBoutinとロナルドDePinhoとの個人的なコミュニケーション）を含む他の癌種で観察された。 TERT-ERタンパク質が容易に動物タモキシフェンまたはビヒクルで処置されているかに応じて、オン状態とオフ状態との間で切り替えることができるので、mTERT-ER対立遺伝子によって生成された腫瘍モデルは、抗テロメラーゼ療法を試験するために利用することができる。以前の研究では、G4 気圧で生成された腫瘍は、 - / - mTERT ER / ER動物は、4-OHTから解放された。テロメラーゼ枯渇すると、腫瘍は最終的に起因するテロメア機能不全誘発性のチェックポイント21の復職に縮小した。しかし、応答に耐性を獲得した腫瘍の一部は、テロメア（ALT）機構の代替長くすると活性化することによって消滅をテロメラーゼ。これらのALT +耐性腫瘍のさらなる特徴は、Tことを示したちょっとミトコンドリアの合成と酸化的防御PGC-1βのマスターレギュレータを含むミトコンドリアの生物学と酸化的防御に関与する遺伝子の異常な転写を持っている。テロメラーゼ+腫瘍細胞は21比較的無傷のまま維持しながら、PGC-1βまたはSOD2（酸化的防御の別のレギュレータ）のノックダウンは大幅にALT +腫瘍細胞を排除する。 これら二つのノックイン対立遺伝子の1つの制限は、彼らがテロメラーゼ遺伝子の天然の遺伝子座にあるため、彼らは唯一の内因性レベルのテロメラーゼの再活性化を余裕ができることです。ほとんどのヒト癌において、テロメラーゼは、実際にははるかに高いレベルで過剰発現される。テロメラーゼのレベルを高めるために、我々は考えることができるつの改変は、Rosa26遺伝子座へのPGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターなどの強力なプロモーターを有するmTERT-ERコンストラクトを挿入することである。 結論として、これらの2つの新規な誘導性マウステロメラーゼ対立遺伝子は、前例のないジェネットを提供特に事前取得テロメア機能不全によって誘発されるゲノム不安定性の背景の下で、加齢および組織恒常性ならびに腫瘍進行におけるテロメラーゼの機能を研究するためのツールでIC。 mTERT-ER対立遺伝子はまた、他の腫瘍を起こしやすいマウスモデルに交差することにより、抗テロメラーゼ治療を研究するために使用することができる。

テロメラーゼは、テロメアの維持に関与する酵素である。これらは、それらの完全性を保護する染色体の末端での反復配列である。テロメラーゼホロ酵素のコアコンポーネントは、テロメア1,2を繰り返し追加するための鋳型として働く逆転写酵素触媒サブユニット（TERT）及びRNAサブユニット（TERC）である。一般に、分化した体細胞では抑制されている間、テロメラーゼは、堅牢な活性を示し、生殖細胞において重要な役割を果たし、癌細胞および幹細胞。 mTERCとmTERTノックアウトマウスは、幹細胞および癌の両方におけるテロメラーゼの機能を研究するためのin vivoモデル系で大きな提供する。 mTERCとmTERTノックアウトマウス（G1）は、マウス3におけるテロメアの長い準備のために、明白な表現型を示さなかった。しかし、連続的に後半世代（G5-G6）にmTERCとmTERTノックアウトマウスをインターは、以下のような結果に最終的には進歩的なテロメアの侵食とは、高度に増殖性の組織4の深刻な変性を引き起こした。後期世代（G5-G6）mTERC - / -マウスは、精巣および生殖細胞枯渇におけるアポトーシスの高い率に不妊である。 G5、G6 mTERC - / -マウスはまた、アポトーシスおよび組織幹/前駆細胞コンパートメント4内の欠陥の自己再生能力の高い速度に骨髄、小腸および皮膚を含む高度に増殖性の組織における変性表現型を示す。後期世代mTERCの骨髄中の造血幹細胞- / -マウスの増殖能の低下を示すので、妥協自己再生能力、強化されたアポトーシスと、最終的に機能的な枯渇5,6。 - / -マウス7,8同様に、腸の陰窩において徐々に増加アポトーシス小体は、G1-G6 mTERCの各連続世代で観察された。 T機能不全のテロメアの彼悪影響インビトロにおいて成体神経幹細胞の増殖及びin vivoでの神経新生の両方が厳しく後期世代で損なわれたためmTERC（G4、G5）の高代謝回転の組織に限定していないように見える- / -マウス9 。幹細胞におけるテロメラーゼの役割は、いくつかの点で10,11老化時期尚早に似ている稀なヒトの遺伝性疾患の先天性角化異常症（DKC）における知見によって支持される。 DKCはジスケリン、コアテロメラーゼサブユニット、およびその他のジスケリン関連タンパク質12をコード化TERC、TERT、及び遺伝子の変異によって引き起こされる。平均では、DKC患者のテロメアは、年齢をマッチさせた対照の短い99％以上である。疾患の主な罹患率は、造血幹細胞の欠陥の維持によって引き起こされる再生不良性貧血、によるものである。そのような口腔白板症、爪ジストロフィー、精神retardati疾患の他の態様すべての精巣萎縮および肺合併症には、テロメラーゼノックアウトマウスの後期世代のものと密接に一致した所見を組織幹細胞および前駆細胞10の機能障害を示唆する。 DKC患者は、骨髄異形成症候群になりやすいですし、悪性の粘膜新生物の有病率の増加を持っている。従って、ヒト患者におけるテロメラーゼの欠乏は、後期世代テロメラーゼノックアウトマウスで観察された幹細胞の機能および腫瘍の素因の欠陥を再現する。 短いテロメアと高テロメラーゼ活性は、癌の特徴である。正常または前癌細胞が分裂するように、DNA二本鎖切断（DSB）13によって引き起こされるものと同様のテロメアおよび細胞チェックポイントの活性化の最終的な浸食が低いかまたは存在しないテロメラーゼ活性をもたらす。古典的なDSBは同様に、テロメア機能不全は、p53などの老化および/またはapoptosiなどの関連細胞応答を誘導することが示されている14,15だ。 p53の変異による不活性化されると、細胞周期と細胞の生存は、転座および地域の増幅および欠失16,17によって特徴づけプロ発癌性ミューテーターメカニズムを提供テロメア機能不全、を持つ細胞で増強されている。同時に、テロメア機能不全を続け、（さえp53ヌル細胞において）に関連横行染色体不安定性は、そのような癌の完全な悪性の進行を制約するように思われる。例えば、後期の世代のG4-G5 mTERC - / - INK4A / Arfの- / -マウスは、テロメアの消耗にINK4A / Arfの欠損マウスと比較して有意に減少したリンパ腫の発生率を示した。別の研究では、より高度な腺腫性病変G4 mTERTに- / - APCの分マウスは大幅に起因する大幅な増殖停止およびアポトーシス18,19へのAPC 分のマウスと比較して抑制された。ザ·テロメア機能不全によって誘発されるゲノムの不安定性は、腫瘍の進行はテロメラーゼの活性化は、癌細胞の生存および/またはp53依存性または非依存性チェックポイント機構を中和すると互換性のレベルにゲノムの不安定性を鎮圧によって部分的に悪性の進行を可能にし得るという推測を促す阻害することを観察。 テロメラーゼの再活性化を停止する、あるいは幹細胞の老化を逆転し、テロメラーゼ活性化は、ゲノムの不安定性を背景腫瘍形成を促進することができるかどうかことができるかどうかを調べるために、我々は2つ​​の誘導性マウステロメラーゼ対立遺伝子を生成した。最初の1は4-ヒドロキシ（4-OHT）誘導性TERT-エストロゲン受容体（mTERT-ER）融合はノックイン対立遺伝子である。 4-OHTの非存在下では、mTERT-ER（指定mTERT ER / ER）についてホモ接合性のマウスは、テロメラーゼ活性が欠損している、従来のmTERT又はmと同じ細胞遺伝学と細胞表現型を維持するTERCノックアウトモデル。 4-OHTの処理の際に、TERT-ERタンパク質の活性とは、天然TERTタンパク質20、21に匹敵するレベルに復元することができる。第二 ​​の対立遺伝子は、新規な誘導性TERTノックインイントロンのLoxP-ストッパー-のLoxPカセットを含有する対立遺伝子（LSL-あるmTERT）; LSLの切除をCre介在時に、mTERTは内因性発現制御機構22で再表現される。

<table><tbody><tr><td>ライカAM6000マイクロマニピュレーションキット</td><td>ライカ</td><td>引用</td><td></td>ごとに</tr><tr><td>ライカDMI6000 B倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td> 引用<td>ごとに</td><td></td></tr><tr><td>ネオマイシン</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>ズ 21810031</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>獣医麻酔システム</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン-キシラジン混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT ペレット</td> 革新的な<td>研究 of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>創傷クリップapplier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr>クリップ <tr><td></td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>神経組織解離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNAテロメア・プローブ</td><td>パナジーン</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNAセントロメア・プローブ</td><td>パナジーン</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>ゴム・セメント</td><td>ウォルマート</td><td>・エルマーズ</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

テロメア老化中の組織の変性を引き起こす十分に確立されたドライバは、ゲノムの完全性およびその関連DNA損傷シグナル伝達およびチェックポイント応答の喪失である機能障害が誘発される。発生率が大幅に年齢とともに増加した癌は、短いテロメアの長さおよび高テロメラーゼ活性によって特徴付けられる。老化や癌におけるテロメア機能不全とテロメラーゼ活性化の役割を研究するために、プロトコルは、2つのマウス誘導性テロメラーゼを生成する方法を示しノックイン対立遺伝子4-ヒドロキシ（4-OHT）誘導性TERT-エストロゲン受容体（mTERT-ER）および LOX -Stopper-LOX TERT（LSL-mTERT）。プロトコルは、テロメア機能不全を誘導し、 生体内でmTERT-ERとLSL-mTERTマウスにおいて、テロメラーゼ活性を再活性化する手順について説明します。代表的なデータは、テロメラーゼ活性の再活性化は、テロメア機能不全によって誘発される組織の変性表現型を改善することができることを示している。 ORDで小胞体は腫瘍形成におけるテロメラーゼ活性化の影響を決定するために、我々は、前立腺を生成した腫瘍モデルG4のPB-Cre4のPten L / Lである p53 L / L LSL-mTERT L / Lおよび胸腺T細胞リンパ腫モデルG4 気圧- / - mTERT ER / ER 。代表的なデータは、テロメア機能不全により誘発されるゲノムの不安定性の背景におけるテロメラーゼの再活性化が大幅に腫瘍形成を増強することができることを示している。プロトコルは、mTERT-ERとLSL-mTERTマウスから神経幹細胞（NSCの）を分離し、in vitroでのNSCでテロメラーゼ活性を再活性化するために使用する手順について説明します。代表的なデータは、テロメラーゼの活性化は、インビトロで自己再生能及び神経発生を増強できることを示している。最後に、プロトコルは、両方のマウスFFPEにテロメアFISH（in situハイブリダイゼーション蛍光）を実行するための手順を説明します（ホルマリン固定し、パラフィンフィン組み込み）は、脳組織および培養細胞の中期染色体。

ノックイン対立マウスmTERT-ERおよびLSL-mTERTを生成するための戦略は、 図1Aおよび1Bに記載した。具体的には、 のLoxP - トリプルストッパー - ネオ - LoxP配列フラグメントはLSL-mTERT対立遺伝子を生成するためにエクソン1およびmTERT遺伝子座のエクソン2の間に挿入した。 mTERT-ER対立遺伝子を生成するために、mTERT遺伝子とインフレームでERT2-LBDドメインはエキソン1のN末端 ​​に挿入した我々は、テロメラーゼ一過4、4-OHTペレットで処理することにより、テロメア機能不全マウスにおいて再活性化されたときことを示した週間、退行性の表現型は、脳（ 図2A）および精巣（ 図2B）などの複数の臓器に改善することができた。後期世代G4 LSL-mTERT及びG4 mTERTからインビトロで培養細胞にテロメラーゼ活性化の影響を決定するために、我々は、単離された神経幹細胞（NSC）-ERマウス。我々は、テロメラーゼはテロメア機能不全のNSCで再活性化されたときに、NSCの自己再生能力は非常に有意に（ 図3B）増強された（ 図3A）の増加、およびインビトロで神経発生にされたことを示した。 - / - mTERT ER /テロメア機能不全との関連で腫瘍形成におけるテロメラーゼの再活性化の影響を決定するために、我々は、PB-Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT L / L（前立腺腫瘍モデル）と気圧を生成後半世代コホート（胸腺T細胞リンパ腫モデル）ER。テロメラーゼは、8週間（ 図4B）が注入（ 図4A）又は4-OHTのペレットと、これらのマウスにタモキシフェン処理によって再活性化されたときに、腫瘍形成が大幅に両方の前立腺腫瘍モデル（ 図4A）および胸腺T細胞リンパ腫モデルにおいて増強された（ <stronG&gt;図4B）。最後に、FFPEマウス脳組織にテロメアFISHを行うプロトコル（ 図5）、中期染色体（ 図5の挿入図）を報告した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> 図1：（A）mTERT-ERノックイン戦略を。ターゲティングベクターテレビ; WT、野生型対立遺伝子。 KI、ノックイン対立遺伝子。 LA、左腕。 RA、右腕。 E1、エクソン1。 E2、エクソン2;ネオ、PGKプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子; ER、修正されたエストロゲン受容体（ERT2）リガンド結合ドメイン; DT、dyphteria毒素遺伝子。 （B）LSL-mTERTノックイン戦略。ターゲティングベクターテレビ; WT、野生型対立遺伝子。 KI、ノックイン対立遺伝子。 LA、左腕。 RA、右腕。 E1、エクソン1。 E2、エクソン2;ネオ、PGKプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子;ストッパー、3反復的な転写停止配列; DT、dyphteria毒素遺伝子。 <pキープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> 図2：代表的なデータは、テロメラーゼ活性化を表示するには、臓器の退行性の表現型を改善する脳の代表的な画像（左）。 4週間のプラセボまたは4-OHTで処置したG0とG4 mTERT-ERマウスの精巣（右）。スケールバーは、50μmを示す。再印刷20から許可を得て。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> 図3：神経幹細胞の代表的なデータは、テロメラーゼの再活性化は、インビトロで神経幹細胞の自己再生および神経発生を増強示す（A）代表的な画像G4のLSL-mTERTから分離S（上パネル） そしてG4 mTERT-ER（下パネル）は、車両または4-OHTで処理した幹細胞培地中で増殖する。神経幹細胞のin vitroでの神経新生（のTuj1 +）の（B）代表的な画像は、車両または4-OHTで処置した（1％FBSを含む）、分化培地で培養G4 mTERT-ERから単離した。スケールバーは、100μmを示す。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> 図4：テロメラーゼ活性化を表示する代表的なデータは、ゲノム不安定性を背景に腫瘍形成を強化する （A）/ Lの p53のL / L LSL-mTERT G0 PB-Cre4のPten Lから切開前立腺腫瘍の代表的な画像+/-、G4 PB- Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT- / - 、およびG4 PB-Cre4のPten L / L p53 をタモキシフェンで処置したL / Lの LSL-mTERT L / L。 22から許可を得て再印刷。 （B）G0 気圧から切除胸腺T細胞リンパ腫の代表的な画像- / - mTERT + / ER、G4現金自動支払機- / - mTERT ER / ERは、ビークルで処理し、G4 現金自動支払機- / - mTERT ER / ERは 、4-で処理8週間OHT。スケールバーは1cmに示している。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> 図5：FFPEマウス脳組織および中期にテロメアとセントロメアFISHの代表的な画像（挿入図）。赤緑テロメア染色を示し、DNAを示し、シアンのceを示しntromere染色。スケールバーは1ミリメートルを示している。

テロメアとテロメラーゼは、老化と腫瘍形成において重要な役割を果たします。このプロトコルの目標は、2つのマウス誘導性テロメラーゼノックイン対立遺伝子を生成する方法と、それらを組織の変性/再生および癌の研究にどのように利用するかを示すことです。

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

次の実験の全体的な目標は、組織の変性および再生の研究、および癌研究のために、in vivoおよびin vitroで2つのマウス誘導性maseノッキング対立遺伝子を操作することです。これは、ヒドロキシタモキシフェン錠を動物に移植して、in vivoでマセを再活性化することによって達成されます。第2のステップとして、神経幹細胞を動物から単離し、ヒドロキシタモキシフェンで処理してin vitroでマセを再活性化します。次に、Cの2つのハイブリダイゼーションまたは魚類におけるテロメア蛍光を、培養細胞と形式的および固定されたパラフィン包埋脳組織の両方に対して行い、マセの活性を確認する。その結果、ヒドロキシタモキシフェン治療は、病理組織学的検査に基づいて、老化表現型の緩和と腫瘍形成の促進の両方において、MASE活性を強力に再活性化できることが示されました。この方法は、THの外傷活動を調節することで老化プロセスを遅らせることができるかどうか、またはトーマスをがん治療に特異的に標的にする方法など、老化およびがん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演していただくのは、私の研究室の新宮隆先生と技師のエイプリル・ウン先生です。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、Turt ERおよびロックストップロックタート対立遺伝子の生成から開始し、注射前にすべての手術器具を滅菌し、テキストプロトコルに記載されているようにマウスに麻酔をかける。深い麻酔に達した後、麻酔をかけた動物を誘導チャンバーから取り出し、頭をイソフッ素チャンバーに接続されたチューブ内に保ちます。マウスのフットパッドをつまんで、動物が深く麻酔されていることを確認します。また、両目に軟膏を塗ります 目が抜けるのを防ぐために、マウスの背中をポビドンヨウ素溶液で拭きます。次に、徐放性ヒドロキシタモキシフェンペレットに精密トロカールを背中の皮膚の下に注入します。そして、ペレットを2つの肩の間の正中線まで押し込みます。創傷クリップアプライヤーで切開部を密封し、マウスの回復を監視します。麻酔に。1日マウスの脳を取り出し、嗅球と小脳を取り外して4つの脳を保持します。4つの脳組織を1ミリリットルの冷培地に入れ、摂氏4度で保存します。神経組織を1時間以内に処理するようにしてください。組織の重量を決定して、消化あたりの400ミリグラムの制限を超えないようにします。直径35mmのシャーレの蓋に脳をのせ、メスで脳を潰します。1ミリリットルのピペットチップを使用して、ハンクのバランス塩溶液またはHBSSを1ミリリットル加えます。次に、HBSS遠心分離機でGの300倍を室温で2分間すすいだ後、ピースを15ミリリットルのチューブにピペットで戻します。上清を慎重に取り除いた後、予熱した酵素を1, 950マイクロリットル加えます。ティッシュ400ミリグラムまで1個混ぜます。サンプルを15ミリリットルチューブ内で摂氏37度で15分間インキュベートします。5分ごとにチューブを反転または振とうして、サンプルを混合します。次に、30マイクロリットルの酵素を準備します 20マイクロリットルの溶液、3〜10マイクロリットルの溶液4を追加して、組織サンプルごとに2つを混合します。次に、サンプルに静かに反転させて混合し、幅の広い先端の火で磨かれたペーストピペットを使用して、気泡の形成を避けながら10回ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、組織を機械的に解離させます。37°Cで10分間インキュベートし、3分ごとにチューブを反転させます。次に、50ミリリットルのチューブに載せた70ミクロンのセルストレーナーに細胞懸濁液を塗布します。10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSをセルストレーナーを通して塗布します。次に、細胞ストレーナーを廃棄し、細胞懸濁液をGの300倍で20分間遠心分離します。遠心分離後、室温を設定し、上清を完全に吸引します。幹細胞培地で細胞を必要な容量に再懸濁し、テレアレイインロックを活性化するためのさらなるアプリケーション、ストップロックを行います。タート神経幹細胞。細胞を100マイクロモルのヒドロキシタモキシフェンで2日間処理し、エマーゼおよびターター神経幹細胞を活性化します。細胞を100マイクロモルのヒドロキシタモキシフェンを含む培養培地に保持して、テロメアフィッシュを実行します。まず、培養細胞から中期染色体をホルマリン固定およびパラフィン包埋またはFFPE組織切片用に調製します。サンプルをキシレンでparizeし、エタノールシリーズでそれぞれ5分間、PBSで5分間再水和します。次に、メタノールと酢酸の3対1の比率で切片を1〜2時間後置します。冷エタノールシリーズの切片をそれぞれ5分間脱水し、1つのXPBSで摂氏37度で5分間風乾洗浄します。次に、4%ホルムアルデヒドの染色体を摂氏37度で2分間染色します。以前と同様に冷たいエタノールシリーズの切片を脱水し、乾いたら風乾し、12〜25マイクロリットルのペプチド核酸ハイブリダイゼーション混合物を各スライドに塗布します。カバースリップをゴムセメントで密封し、天然の染色体調製物と組織切片を摂氏80度で4分間貼り付けます。次に、室温または摂氏37度で、湿度の高いチャンバーで2〜4時間ハイブリダイズします。次に、サンプルを室温で洗浄バッファーを使用して15分間2回洗浄します。その後、室温でPBSで5分間洗い、23回トゥイーンします。最後に、顕微鏡検査のためにスライドをDPIまたは遠赤色蛍光で対比染色します。テロメアが機能不全マウスで一過性に再活性化されたとき、脳や精巣などの複数の臓器で変性表現型を改善して、テロメアの再活性化が細胞に与える影響を決定することができました。培養したin vitro神経幹細胞を、後期世代のG four lock stop lock、TURT、およびG four turt ERマウスから単離しました。テロメア機能不全の神経幹細胞でテロメアを再活性化すると、自己複製能力が大幅に向上しました。インビトロの神経新生も有意に増強され、テロメア機能障害の文脈で腫瘍形成に対するマセ再活性化の影響を決定し、タモキシフェン治療によるマセ再活性化を前立腺腫瘍モデルで実施しました。EndotのT細胞リンパ腫モデル。この治療により、両モデルで腫瘍形成が大幅に改善されました。最後に、テロメアフィッシュはFFPE、マウスブレイン組織、および中期染色体で行われました。これらの画像では、赤はDNAを示し、緑はテロメア染色を示し、シアンはセントロメア染色を示します。このビデオを見れば、mTOR ERおよびロックストップロック、mTOR動物および細胞株における外傷活動の活性化方法、およびそれらを使用してがんおよび病原体の問題を研究する方法について十分に理解できるはずです。

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以下の手順は、マウス背部皮膚における melanocytic...

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。...

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

この記事では、95%エタノールをマウスの子宮に1〜3分以内に注入することにより、死亡率が非常に低く、子宮内癒着が最小限に抑えられた、信頼性と再現性のある薄い子宮内膜を作製するための詳細なプロトコルについて説明します。...

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

このプロトコルでは、 in vitro/in vivo...

分子および計算研究のためのツールとしてのマウス乳腺腫瘍からの癌関連線維芽細胞

学ぶマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を用いた組織変性・再生とがん研究の手法。ヒドロキシタモキシフェン投与とFISH解析により、テロメラーゼ再活性化が老化緩和と神経幹細胞の自己更新を促進することを示す。

組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用

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