横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価
May 25th, 2015
Compound muscle Action Potential Recordingは、横隔膜運動ニューロンによる機能的横隔膜の神経支配を定量的に評価します。ホールマウント横隔膜免疫組織化学は、個々の神経筋接合部での形態学的神経支配を評価します。このプロトコルの目標は、これら 2 つの強力な方法論を脊髄疾患のさまざまなげっ歯類モデルでどのように使用できるかを実証することです。
この手順の全体的な目標は、頸髄の横隔膜運動ニューロンによる横隔膜の機能的および形態学的神経支配の両方を定量的に評価することです。これは、同側横隔神経の超最大刺激後に麻酔をかけた動物の半横隔膜から複合筋活動電位記録を行うことによって達成されます。次のステップは、ホールマウントダイアフラム免疫組織化学を実施して、個々の神経筋接合部の神経支配を形態学的に評価することです。
最終的に、複合筋活動電位と神経筋接合部解析を組み合わせることで、CNSおよびPNS疾患のげっ歯類モデルにおける横隔膜神経支配を定量的に研究するための強力なアプローチが提供されます。この方法は、横隔膜機能を成功裏に回復するために治療的介入を使用できるかなど、脊髄損傷分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、外傷性脊髄損傷やILSなどの疾患の治療にまで及びます横隔膜の呼吸機能は、これらの衰弱状態の両方で患者の転帰に重要な役割を果たします。この手順を実証するのは、私の研究室のポスドク研究員であるカリ博士、ライト博士の研究室の学部生であるメラニー・マーティンです。 そして、私の研究室の研究技術者であるタマラ・ホラ。
動物に麻酔をかけた後、背側を下にして手術用ボードに置き、前肢をボードに固定します。次に、正中線の両側で頭蓋骨の基部から腹部に向かって腹面を剃ります。皮膚をきれいにしたら、電極を配置し、地面を尾に取り付け、参照電極を反対側の下腹部に皮下に配置します。
記録電極は、自己接着部分に導電性ゲルを塗布して調製し、次に片側肋骨縁に沿って取り付ける必要があります。次に、刺激電極を経皮的に半センチメートル離して、気管の外側、鎖骨の上に配置します。彼らは皮膚に対して垂直に入り、約1センチメートルの深さに入るべきです。
これらの電極はしっかりと固定する必要があり、手作業で行うのが最適です。すべての電極を適切な刺激装置と増幅器に取り付けます。収集したデータは、コンピュータに記録する必要があります。
分析のために、単極刺激の刺激パラメータを0.5ミリ秒、1ヘルツの超最大パルスに設定します。振幅は6〜8ボルトの範囲です。興味刺激時間を30秒に設定し、ベースラインを使用して10回の連続した刺激からの応答を平均化し、必要に応じて各動物からのピーク振幅記録までを約1週間に1回
記録します。動物の取り扱いについては、テキストプロトコルで詳しく説明されています。注射可能な麻酔の過剰摂取を使用して動物を安楽死させた後、メスまたはハサミを使用して開腹術を実施します。剣状突起から正中線に沿ってこっちりと切開します。
次に、メスと鉗子を使用して、皮膚と結合組織を筋肉組織から慎重に分離します。剣状突起を引き上げ、周囲の骨から横隔膜を切り取って、横隔膜を取り外します。横隔膜の筋肉を傷つけないように注意してください。
横隔膜の上側を、ステレオスコープ下でPBS中の4%パラホルムアルデヒドで満たされたシリコーンラインディッシュに移します。横隔膜を囲む組織を固定し、横隔膜をぴんと張って伸ばします。次に、鉗子とはさみを使用して上面から結合組織を取り出します。
固定剤を20分間機能させてから、PBSで10分間の洗浄を3回使用して取り出します。次に、0.1モルのグリシンと2%BSAをPBSに30分間塗布します。次に、ダイヤフラムをロッドドミン結合アルファバンガロートイン溶液で15分間インキュベー
トします。固定剤の場合と同様に、バンガローの毒素をPBSで洗い流します。次に、浴を冷たいメタノールに変更し、ティッシュをマイナス20°Cで5分間冷やします。5分後すぐにメタノールを取り出し、前回と同様にPBSで組織を洗浄します。
次に、0.2%TBP溶液を使用してブロックを1時間適用します。溶液を0.2%TBPの一次抗体に変更し、組織を摂氏4度で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。翌日、0.2%TBPで10分間の洗浄を3回行って一次抗体を除去し、その後、組織を二次抗体溶液で1時間ロッキングしながらインキュベートし、その後、暗闇でPBSで3回の洗浄を行い、二次抗体を除去し、組織を暗所に保ちます。
次に、ステレオスコープの下で、筋肉の上面にあるより多くの結合組織を取り除きます。洗浄後、マウントを外し、直立したエピ蛍光顕微鏡で組織を画像化し、染色された半隔膜の形態を定量的に分析します。倍率20倍と40倍を使う ダイヤフラムがマウント全体として解析されるためです。
蛍光染色のほとんどがピントが合っていません。標準的な顕微鏡を使用して、リアルタイムで分析を行うのが最善です。個々のNM jsの形態を適切にスコアリングするために、筋肉を3つのセクションに分割し、脊髄の地形的神経支配パターンに基づいて分析します。
腹側の大部分領域から始めて、筋線維に沿って見えるすべてのnjsを分析し、抗体の浸透が完全ではないため、表面から最初の3〜4本の線維よりも深く分析しないでください。無傷のNMJには、太い前終末軸索があり、神経終末のすべての領域が下にある筋肉アセチルコリン受容体と完全に重なっています。部分的に神経質なNMJは、基礎となるアセチルコリン受容体の一部の領域が空いています。
完全に除神経されたNMJは、神経終末のアセチルコリン受容体との対応を示しません。この領域の他のnjsは、別の形態または抗体の成功を示す必要があります 浸透は、複数の前末端軸索がNMJを神経支配する場合に問題になります。NMJは乗算です。
この場合、神経支配除神経が起こり、その後に再神経支配が起こった可能性があります。神経終末が下にあるアセチルコリン受容体と重なり、終末前軸索が非常に細い場合、NMJは薄く神経支配されています。これもリエーションの指標です。
成体のスプラを対象とした実験では、ドリーラットの対照群は椎弓切除術を受け、他の対照群は片側半挫傷SCIを受けました。C4で。5 週間後、ピーク cmap 振幅は、半横隔膜同側から椎弓切除術または損傷部位まで記録されました。
これは、変異したヒトを発現するラットを含む別の実験で、椎弓切除術のみの対照ラットと比較して、SCIラットでは大幅に減少したため、LSのモデルとして機能する1つのタンパク質をDしました。半横隔膜のNMJ形態は、野生型の対照動物では完全に無傷でした。しかし、トランスジェニックラットでは、njsは有意な病状を示しました。矢印でマークされた完全な除神経を示したものもありました。
他のnjsは矢じりでマークされているように部分的に除神経化されており、右側のNMJに見られるように、他のnjsは多重神経支配されており、他のnjsはここに矢印の頭でマークされた細い前末端軸索を持っていました。このビデオを見れば、横隔膜運動ニューロンによる横隔膜の機能的および形態学的神経支配の両方を定量的に評価する方法を十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてすべての実験で頑張ってください。
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概要
このプロトコルは、複合筋活動電位記録と全層横隔膜免疫組織化学を使用して、横隔膜の横隔神経運動ニューロンの内部接続を定量的に評価します。これらの方法論は、脊髄疾患の様々なげっ歯類モデルに適用可能です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 免疫組織化学
背景
- 横隔神経運動ニューロンは呼吸機能に不可欠な横隔膜を内部接続します。
- 横隔膜の内部接続を理解することは脊髄損傷に対処するために重要です。
- 機能的および形態学的評価を組み合わせることで研究能力が向上します。
- この研究では治療介入を探索するためにげっ歯類モデルを利用しています。
研究目的
- 横隔膜の機能的および形態学的内部接続を評価すること。
- 横隔膜機能を回復するための治療介入の効果を評価すること。
- 脊髄損傷および関連疾患に関する洞察を提供すること。
使用された方法
- 半横隔膜からの複合筋活動電位記録。
- 同側横隔神経の超最大刺激。
- 神経筋接合部の分析のための全層横隔膜免疫組織化学。
- 両方の方法論を組み合わせて包括的な評価を行う。
主要な結果
- 横隔膜内部接続に関する定量的データが成功裏に得られました。
- 方法論はげっ歯類モデルで効果を示しました。
- 横隔機能の治療的回復の可能性に関する洞察が得られました。
- 神経筋接合部の形態学についての理解が深まりました。
結論
- この組み合わせアプローチは横隔膜内部接続を研究するための強力なツールを提供します。
- 結果は脊髄損傷および関連疾患の治療に影響を与える可能性があります。
- このプロトコルは呼吸機能回復に関する将来の研究を導くことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons enables high-confidence evaluation of neuromuscular function in preclinical models of CNS and PNS disease. Integrating compound muscle action potential (CMAP) recordings with neuromuscular junction (NMJ) morphological analysis supports predictive de-risking for therapeutic strategies targeting respiratory function. This dual-modality approach strengthens translational continuity from mechanistic discovery to preclinical validation in respiratory and neurodegenerative disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phrenic motor neuron pathways critical for respiratory function.
- Supports biological de-risking by distinguishing functional versus morphological deficits at the NMJ.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic hypotheses for respiratory therapies.
Screening & Assay Development
- Provides validated electrophysiological and morphological endpoints for compound screening in rodent models.
- Enables reproducible, quantitative measurement of diaphragm innervation status across experimental cohorts.
- Supports assay standardization for cross-study and cross-laboratory comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional and morphological biomarkers with disease-relevant endpoints in spinal cord injury and ALS models.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic candidates based on restoration of diaphragm function.
- Supports continuity from mechanistic studies to preclinical efficacy evaluation in respiratory disease pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, target validation, and preclinical efficacy assessment for therapies aimed at neuromuscular and respiratory disorders.
- Discovery Biology: Quantitative CMAP and NMJ analysis clarify pathway function and de-risk target hypotheses.
- Screening: Electrophysiological and morphological readouts enable robust, reproducible assay platforms.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements for comparing intervention effects.
- Translational Research: Aligns preclinical endpoints with clinically relevant respiratory function outcomes.
- Enterprise Reuse: Methodology is adaptable across CNS and PNS disease models for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes functional and morphological assessment workflows for scalability and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by linking mechanistic findings to functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory and neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and immunohistochemistry for accurate data acquisition and interpretation.
- Demands access to specialized instrumentation for CMAP recording and fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation, recording, and tissue processing protocols.
- Adaptation across rodent models may require optimization of electrode placement and antibody penetration.
- Antibody penetration limits analysis to superficial NMJs, impacting depth of morphological assessment.
