Name: 横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ横隔神経支配の機能的・形態学的評価法。CMAP記録と全層免疫組織化学を組み合わせ、齧歯類モデルで呼吸機能回復の治療介入効果を定量的に解析する強力なアプローチです。

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この作業は、NINDS(A.C.L.への助成金 #1R01NS079702)とトーマス・ジェファーソン大学(M.M.)のSURPプログラムの支援を受けました。

実験手順は、トーマス·ジェファーソン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、欧州共同体理事会指令（63分の2010 / EU、609分の86 / EECおよび87から848 / EEC）に準拠して実施し、のためのNIHガイドました脳科学研究における動物の使用に関する神経科学のポリシーの管理と使用実験動物の、および社会。 1.複合筋活動電位（CMapを） <ol><li>動物の準備： <ol><li>効果にまたは注射（ケタミン、キシラジン、アセプロマジン）によって供給される1〜2％で吸入（イソフルラン）を用いてラットを麻酔。 95.0 mgのケタミン/ kgのキシラジンの10.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンの0.075ミリグラム/ kgで次のように注射用麻酔の投与量です。 注：我々は、正常に吸入および注射麻酔薬の両方を使用し、このCMAP記録プロトコルを行う際問わないで、近づきます。 </li><li>動物は、適切なAで維持されなければなりません手術前nesthetic深さは、手術の結論を介して、開始され、術後のブプレノルフィンまで有効になっています。引っ込め応答が誘発されていないことを決定するために、簡単なつま先のピンチによって適切な麻酔を確認してください。さらに、綿棒で角膜反射をテストします。外科的手順では、麻酔深度が軽すぎるとなっていることを示唆している、心拍数や呼吸数が増加していないことを決定します。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防止するために、動物の目に獣医軟膏を適用します。 </li><li>外科医は手術を開始する前に、消毒剤（クロルヘキシジンスクラブ）で彼女/彼の手を洗う必要があります。外科医は、滅菌手袋、フェイスマスク、ガウンまたはクリーン白衣を着用してください。すべての機器を洗浄し、手術前にオートクレーブ処理されるべきです。滅菌が完了したことを確認するために、機器のレベルでオートクレーブする前に、機器のキット内の滅菌インジケータストリップを追加します。外科医べきストリップ上の行全体が手術を開始する前に、黒であることを確認します。同様に、オートクレーブテープを示すとボックスの外側をテープで固定します。手術は、同じ日に、いくつかの動物で行われる場合には、手術の間に器具を清掃し、ガラスビーズ滅菌器で滅菌します。必要に応じて、適切な時間に滅菌器具のハンドルを置く滅菌止血剤で楽器を除去、無菌フィールド内で冷却し、その後の官能性末端を配置することによってガラスビーズ滅菌器内器具の両端を滅菌適当な時間のためのガラスビーズ滅菌器への器具。 </li><li>動物を麻酔した後、ダウン背面に外科的ボード上となるようにテープを上に向け、腹部の場所は、外科用ボードに、動物の前肢を保護するために使用することができます。 </li><li>頭蓋底で始まる腹面の尾側を剃るし、正中線の両側腹部周辺はSHであることを確認AVED半ダイアフラムが記録されているに応じて。皮膚の剃毛表面にポビドンヨードを適用します。 </li></ol></li><li> CMAPの録音のための準備： <ol><li>尾への動物の準備、場所接地電極を皮下に続いて（ 図1）。 </li><li>反対下腹部に参照電極を皮下に配置します。 </li><li>自己接着面ストリップまたはディスク記録電極（表面帯状電極の寸法：0.5×3センチ）の上に導電性ゲルを配置し、その後、一方的な肋骨縁に沿って横方向に表面電極を配置します。 </li><li>経皮0.5センチメートル離れて気管に横方向および鎖骨に優れた刺激電極を配置します。皮膚を通して約1.0センチメートル深い電極を挿入します。その場所は、その後の刺激と一緒に移動しないように手で電極を固定します。 注：付着点の部位の皮膚に対して90°の角度刺激電極N。 </li></ol></li><li>複合筋活動電位（CMAP）録音： <ol><li>コンピュータ支援データ分析に続いて刺激/アンプを使用して電気生理学的記録を入手します。 </li><li>シングルプル刺激の刺激パラメータは、0.5ミリ秒、1.0 Hzの超最大パルスでなければなりません。刺激の振幅はV 6.0の間と8.0（ 図2A）である必要があります。 注：この実験の中で、動物間で同じ振幅で刺激強度を使用しています。目的は、刺激の最小の振幅を用いて、応答振幅を最大にすることです。それは刺激の時に発生する初期応答が、刺激アーティファクトであることに注意することが重要です。また、ケアは、その後急速CMAP応答が続いて刺激アーティファクト、後に安定/フラットベースラインが先行するCMAPの応答を得るために注意すべきです。そのような応答を得るためには、刺激の位置を変更する必要があるかもしれない、および/または記録電極。 </li><li>刺激の間に30秒待ってから、平均応答（ 図2B - C）を得るために一列に10刺激を繰り返します。ベースラインからピークに振幅を測定（ 図2A）。横隔神経/ダイアフラムが活性化されていないときに、動物の呼吸サイクルのフェーズ中に横隔神経刺激を行っています。手順は、反対側の半振動板に同じ動物に繰り返すことができます。 </li><li> NMJ染色が行われる場合、最終的なCMAP記録セッションの後、動物を灌流。毎週（または任意の間隔で）約一回、同じ動物で繰り返しCMAPの録音を行っています。 </li><li>生存CMAPの記録に続いて、動物が覚醒し、sternallyリカンベントまで回復中に循環温水暖房パッドに回復し、継続的に監視することができます。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。&lt;/ LI&gt; <li>一度sternallyリカンベント、（その後一日一回）最初の48時間、動物ごとに12時間を監視します。手術後の体重および流体損失安定するまで動物は（弛緩性皮膚、だる）を脱水していると思われる場合は、流体（;皮下;注射1〜2 mlのサイトは回転で1日2回、乳酸リンゲル液）を管理。彼らはワイヤーバー蓋フィーダに到達できない場合は食べることを奨励するために、必要に応じて急性術後期間中に小さな皿で軟化した食品と動物を提供します。 </li><li>手術の終了前には0.05mg / kgの用量でブプレノルフィンを投与し、その後12時間間隔で、最初の24時間（その後痛み/ストレスの兆候に依存）皮下注射を介して、（サイトが回転します）。痛みや苦痛の徴候は​​、その後に気づいている場合は、ブプレノルフィンで動物を扱います。痛み/苦痛を示す兆候は、活性の欠如、発声、（脱水）を食べたり飲ん不足、過度の体重減少、ガード、EXCを含みます能格かじるまたは切開部位でスクラッチ。痛みや苦痛を決定する際に使用される追加の基準は、外来刺激に無反応、一時的またはいわれのない発声、こじつけまたは異常呼吸、永続的な赤褐色鼻な眼放電、マークされた立毛を含みます。また、病気の動物を示唆する不衛生の証拠を監視します。動物がまだ処理の72時間後に苦痛であることが観察された場合、動物を安楽死させる（上記概説疼痛/ストレス条件に応じて、受信した後、鎮痛プロトコルは、上記）。 </li></ol></li></ol> 2.ダイアフラム神経筋接合部（NMJ）の分析<ol><li>動物の解剖： <ol><li>動物に注射用麻酔の過剰摂取の管理（：;腹腔内投与0.225ミリグラム/ kgで30.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンで285.0ミリグラム/ kgのキシラジンでケタミン3回は、上記使用した用量）。過量投与に続いて、すべての動物は安楽死の第二の方法（開胸）Tを有していなければなりませんOの死を確認してください。死は、心臓や呼吸停止を観察することによって、動物の固定および拡張生徒に注目することによって確認する必要があります。 </li><li>メスや解剖ハサミが尾側正中線に沿ってzyphoidプロセスから切除を拡張して開腹を行っています。慎重にメスや鉗子を使用して、基礎となる筋肉から皮膚や結合組織を分離します。 </li><li> zyphoidプロセスを引き上げながら、振動板が骨の周囲に付着したままであることを確認して、全体の振動板を除去するために、解剖ハサミを使用しています。それはダイヤフラム全体の成功解剖を可能にする、横隔膜筋への損傷を防ぐことができますし、その後の染色のために筋肉をクリーニングに役立つように、これは重要です。 注：必要であれば、この時点で、動物を灌流することができます。 </li></ol></li><li>振動板のクリーニングと染色： <ol><li>全体解剖ダイアフラムを突き止める、優れた表面がガラス100ミリメートルペトリ皿中にシリコーンゴムに、上向きに実体顕微鏡を用いて20分間 - （PBS、1％リン酸緩衝生理食塩水で行った）、4％パラホルムアルデヒド。それはピンと張ったようにダイヤフラムを伸ばし、昆虫ピンを使用して、横隔膜筋自体（ 図3）をピン止めを避けるために、周囲の組織を突き止めます。 </li><li>慎重に＃5鉗子と小さなはさみで筋肉の唯一の優れた表面から結合組織をきれいに。 注：特に指定のない限り、この染色プロトコルは、ゆっくりと光から覆われ、室温でロッキングのすべての後続のステップを実行してください。横隔膜筋が常に完全に乾燥を避けるために、液体中に浸漬されていることを確認します。 </li><li>染色の前に、全ての必要な試薬調製：1×PBS、2％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBSを、0.1 M 1×PBS中の2％BSA / PBS、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で行われたグリシン、および0.2％TBP（0.2 2％BSA / PBS）中の％トリトンX100。 -20℃でメタノール - クールを事前にしてください。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> 2で行われた（0.1 Mグリシンでインキュベート30分間％のBSA / PBS）。 </li><li> 15分間RBTX（ローダミン結合αブンガロトキシン）溶液中でインキュベートします。ローダミン結合アルファブンガロトキシン1：1×PBSで400希釈を次のようにRBTXのためのソリューションです。 注：このプロトコルでは、ローダミンを用いているが、選択した任意のフルオロフォアは、染色のために使用することができます。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> -20℃の冷凍庫では、5分間MeOHでインキュベートします。 注：冷凍庫に筋肉を置く前にメタノールを追加し、直ちにインキュベーション期間の後溶液を除去しないでください。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> 1時間0.2％のTBPのブロック（0.2％トリトンを2％BSA / PBS製）。 </li><li>ロッキングしながら4℃で一晩、一次抗体溶液（0.2％でTBP）とインキュベートします。抗体の希釈液を次のようにSV2（1:10）とSMI-312（1：1,000）。 </li><li> 0.2％TBPで10分間3回洗浄します。 </li><li> FGM1（FITC結合ヤギ抗マウスIgGの1：100希釈を用いた二次抗体とインキュベートします1; 1時間揺動しながら、0.2％TBP）で行われました。 注：染色のためのプロトコルの残りの光から保護します。 </li><li> 1×PBSで10分間洗浄3倍。 </li><li>前取り付け、カバースリップに筋肉の優れた（上記参照）の表面上に再クリーン周囲の結合組織。 注：それはきれいにした後、染色した後、すぐにサンプルをマウントすることをお勧めします。必要な場合は、サンプルは、1×PBSでカバー蒸発を防ぐためにパラフィルムで包み、毎日PBSを変えて、1週間まで4℃で保存してもよいです。 </li><li>スライドガラス上にマウントされると、非hardsetベクタシールドでカバースリップ。乾燥を防ぐために、明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。店舗スライドは長期的に、-20℃で段ボールスライドフォルダに平らに。 </li></ol></li><li>分析と共焦点イメージング： <ol><li>定量的染色の形態を分析し、直立エピ蛍光を用いて、20Xと40X倍率下半ダイアフラムマウント顕微鏡。 注：ダイヤフラムは全体のマウントの方法で染色し、分析されているので、筋肉が非常に厚いです。静止画像は、非共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影されたときその結果、蛍光染色の大部分は、完全に焦点から外れています。このような理由から、これはあなたが常に適切に個々のNMJのそれぞれの形態を識別するために「上」と「下」の筋肉を介して集中することができますように顕微鏡でリアルタイムでNMJ分析を実施することをお勧めします。彼らは、シナプス後受容体クラスターへの空間的関係にある組織を通って移動すると、このアプローチを使用して、人は簡単に個々の運動軸索の軌跡をたどることができます。 </li><li>筋肉の腹対背の長さを測定することにより、特定の脊髄レベル（ 図4H）からの地形神経支配のパターンに基づいて、分析のための3つの別々のセクションに筋肉を分割。 </li><li>筋肉やMOVの腹側領域で始まります背る、表面筋線維上にある顔のNMJアンすべてを分析します。 RBTXが原因で標識するために使用され、より大きな抗体に比べて、毒素の小さなサイズに筋肉へのより深い浸透（これは貧しい抗体の浸透に解釈が困難な場合があるように、より深い表面から第3-4繊維よりも筋肉繊維を分析しないでくださいニューロン）。 </li><li>ニューロンの事前端子軸索の直径が太く、神経末端の全ての領域が完全に下にある筋肉アセチルコリン受容体（AChRs）と重複している場合、完全なように、各NMJを特定します。 </li><li>基礎となる筋肉AChRsの任意の領域が神経終末を対応する占有されていない場合は、部分的除神経のように各NMJを特定します。 </li><li>筋肉AChRsには、対応する神経終末を持っていない場合は、1つは、神経末端の欠如はのために単純ではないことを確認することができますように（それは、焦点の同じフィールドで標識されたニューロンと他のNMJを持つことも重要である完全に除神経として各NMJを特定うんちR筋肉のその領域における抗体の浸透）。 </li><li>乗算神経支配のように複数のプレターミナル軸索神経支配個々NMJがある場合（これは、この接合部での神経再生の除神経、おそらく試みのいくつかのレベルがあったことを示している）各NMJを特定します。 </li><li> NMJは、神経終末とその下AChRs間の完全なオーバーラップを持っていますが、（これはまた、神経再生における除神経と試みのいくつかのレベルの指標である）シンプレ端子軸索を持っているかのように薄く神経支配各NMJを特定します。 </li><li>各動物のための上記のNMJカテゴリーのすべてのための3識別された領域のそれぞれについて分析を行います。同じ実験群の他の動物からの結果と、各動物からのデータを平均します。マウス半ダイアフラムにおけるラットヘミダイヤフラム筋肉および150〜200に約200〜300の接合部は、実験群当たり少なくとも3（好ましくは5〜6以上）の動物で定量化する必要があります。 </li><li>高解像度の共焦点画像を入手し、使用共焦点顕微鏡でパブリケーションのD、。 </li><li> 20〜40ミクロ​​ンの深さ0.3μmのステップサイズでZ-スタックを取得し、全体のシナプスプロファイルが含まれていることを確認するために、各接合部の上下に追加の光学切片を収集します。 </li><li>最大強度の予測にZシリーズの画像を再構成するために収集ソフトウェアを使用してください。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

呼吸機能が呼吸、特に絞り神経支配を標的治療法の開発、外傷性SCIとALSの両方に妥協されるように、臨床的に5,6に関連しています。総合呼吸機能を研究するために、組み合わされたアプローチの方法が使用されるべきです。 CMapを外部の横隔神経刺激を介して振動板の機能神経支配の程度を測定するが、延髄脊髄の呼吸ドライブ8内因性ではありません。また、これらの記録は、特に、個々の運動軸索とシナプス後アセチルコリン受容体のレベルで、NMJにおける形態学的変化を検査することができません。記載染色プロトコルを使用することにより、定量的に、このような完全な脱神経、部分的除神経及び横隔膜筋9の個々のNMJであっても、再生発芽および神経再生などの関連の形態学的表現型を評価することができます。 それにもかかわらず、これらの二つのプロトCOLSは、まだ完全に呼吸器病変のすべての側面をキャプチャしません。損傷がPhMNプールまたは横隔神経を損傷することなく下降延髄脊髄の軸索に発生した場合、CMAP振幅はまだ横隔神経は、外部14を</su...

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、上位と下位運動ニューロンとその結果としての筋肉麻痺の両方の損失に関連する衰弱運動ニューロン疾患です。診断時には、患者の生存率は、平均でのみ2〜5年1です。横隔膜運動ニューロン（PhMN）の損失は、ALSの病因の重要なコンポーネントです。患者は、最終的には、振動板のPhMN神経支配、インスピレーション2,3の主要な筋肉の損失に起因する死亡します。外傷性脊髄損傷（SCI）は、関連する呼吸困難の深刻な問題です。 SCIの約12,000の新しい症例が原因で脊髄への外傷性損傷に毎年4起こります。場所、種類及び重症度に対する疾患の不均一性にもかかわらず、SCIの症例の大部分は、多くの場合、衰弱し、永続的な呼吸障害をもたらす頸髄に外傷を伴います。 ALSおよびSCIに加えて、他の中枢神経系（CNS）疾患は、W関連付けることができi番目の横隔膜呼吸不全5,6。 横隔神経は、同側半ダイアフラムを神経支配し、それは同側頸髄のC3-C5レベルに位置PhMN細胞体から発生する遠心性運動神経です。 PhMN出力は吻側腹呼吸器グループ（rVRG）7として知られているエリアに脳幹から延髄脊髄の入力を降順によって制御されます。 rVRG-PhMNダイアフラム回路は、吸気呼吸の制御、ならびに他の非換気ダイヤフラムの動作の中心です。この回路に影響を与える様々な外傷と神経変性疾患は、呼吸機能および患者の生活の質の顕著な低下につながることができます。ダイヤフラム神経筋接合部（NMJ）でrVRG、PhMN生存、横隔神経の整合性と適切な神経支配からPhMNsに入力を降順通常の絞り機能に必要なすべてのです。これは、技術を使用することが重要であること定量的ALS、SCIおよび他のCNS ​​疾患のげっ歯類モデルにおいてインビボでこの回路を評価することができます。 このプロトコルでは、目標は、電気生理学的および形態学的レベルの両方で振動板のPhMN神経支配を評価するための実験的なツールを記述することです。複合筋活動電位（CMapを）指定された運動神経の全ての遠心性運動ニューロンの軸索を刺激した後、ターゲットの筋線維の脱分極誘発さの応答を分析することによって記録されています。この技術は、PhMNs 8半横隔膜の神経支配の機能を定量化するために麻酔したラットおよびマウスにおいてインビボで使用することができます。原因CMapを、すべての同時記録（あるいは、少なくとも、多くの/ほとんどの）全体の半横隔膜の筋線維を表すという事実のために、それはまた、疾患を追跡するために、絞りNMJで、個々の運動軸索と筋線維の表現型を調べるために有用です - このような部分やcompleなどと治療関連の形態学的変化TE除神経、再生発芽および再支配。これは筋肉9を通して個々のNMJの詳細な形態学的評価に続いて、振動板の全体マウント免疫組織化学（IHC）を介して達成することができます。 CMapをを組み合わせ、NMJ分析は、定量的にCNSおよびPNS疾患の齧歯類モデルで横隔膜神経支配を研究するための強力なアプローチを提供します。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー</td><td>T353-500</td><td>まず、脱イオン蒸留水で 10% 溶液を調製します。1x PBS で 4% を調製し、pH を 7.4 に調整</td></tr>します。<tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2% ウシ血清アルブミン (2% BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>2 g BSA を 1x PBS</td></tr><tr><td>0.2% Triton X100 100 ml に溶解します。2% BSA/PBS (ブロッキング緩衝液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100mL</td><td>溶解 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS</td></tr><tr><td>0.1 M グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>25 ml に 0.185 g を 2% BSA/PBS</td></tr><tr><td>&-ブンガロトキシン</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>濃度 1:400</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoclonals</td><td>SMI312</td><td>濃度 1:1,000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク</td><td>SV2-上清</td><td>濃度 1:10</td></tr><tr><td>FITC ヤギ抗マウス IgG1</td><td>ロシュ</td><td>3117731001</td><td>濃度 1:100</td></tr><tr><td>シリコーンゴム</td><td>シルガード、ダウ コーニング</td><td>パーツ # 184</td><td>キットに付属する説明書に従ってください: ニーズに応じて複数のサイズの培養皿 (30 mm、60 mm、100 mm) を使用できます</td></tr><tr><td>Vectashield 蛍光封入剤</td><td>ベクター研究所</td><td>H-1000</td><td>これはハードセットなメディアではありません。カバースリップを透明なマニキュアで固定する必要があります。</td></tr><tr><td>小型スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>CMAP録音用ソフトウェア</td><td>スコープ3.5.6;ADI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディスク表面電極</td><td>Natus neurology</td><td>019-409000</td><td></td></tr><tr><td>皮下針電極</td><td>Natus neurology</td><td>019-453100</td><td></td></tr><tr><td>導電性ゲル</td><td>Aquasonic</td><td>122-73720</td><td></td></tr><tr><td>CMAP記録用刺激装置/記録システム</td><td>ADI Powerlab 8SP刺激装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMAP記録</td><td>用アンプバイオAMP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

このプロトコルは、特に横隔膜の横隔膜運動ニューロン（PhMN）神経支配を電気生理学的および形態学的レベルの両方で評価するためのツールに焦点を当てています。横隔神経刺激後の複合筋活動電位(CMAP)記録は、麻酔をかけたラットやマウスにおいて、in vivoで頚髄のPhMNによる機能的な横隔膜神経支配を定量的に評価するために使用できます。CMAPは、半横隔膜全体のすべての筋線維の同時記録を表すため、部分的および完全な除神経、再生発芽、再神経支配などの疾患および治療に関連する形態学的変化を追跡するために、横隔膜NMJでの個々の運動軸索および筋線維の表現型も調べることが有用です。これは、横隔膜のホールマウント免疫組織化学(IHC)と、それに続く筋肉全体の個々のNMJの詳細な形態学的評価によって達成できます。CMAPsとNMJ分析を組み合わせることで、CNSおよびPNS疾患のげっ歯類モデルにおける横隔膜神経支配を定量的に研究するための強力なアプローチが提供されます。

大人のSprague-Dawleyラットは、C4脊髄レベル10〜12のいずれかで椎弓切除のみ（非損傷対照）または一方的なヘミ挫傷SCIを受けました。 5週間後の手術では、椎弓切除術/損傷部位に半絞り同側から記録ピークCMAP振幅が大きく、椎弓切除のみの制御（ 図2B）と比較して、SCIラット（ 図2C）に減少しました。半ダイアフラムのすべてのNMJは対照非罹患野生型ラット（ 図4A、C）で完全に無傷でした。逆に、SOD1 G93Aラット （ALSの齧歯類モデル）は、完全脱神経（ 図4G、矢じり）、部分的な脱神経を含むヘミダイヤフラムのNMJ（ 図4B）、で有意病理を示した（ 図4E、矢印; 図4G、上のNMJ右）、複数の神経支配（ 図4D）とシンプレ端子軸索（ 図4F、矢じり）。 <p...

Compound muscle Action Potential Recordingは、横隔膜運動ニューロンによる機能的横隔膜の神経支配を定量的に評価します。ホールマウント横隔膜免疫組織化学は、個々の神経筋接合部での形態学的神経支配を評価します。このプロトコルの目標は、これら 2 つの強力な方法論を脊髄疾患のさまざまなげっ歯類モデルでどのように使用できるかを実証することです。

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

本手順の全体的な目的は、頚髄の横隔神経運動ニューロンによる横隔膜の機能的および形態的な神経支配を定量的に評価することである。これは、麻酔下にある動物において、同側の横隔神経に最大上刺激を与えた後、半側横隔膜から複合筋活動電位（CMAP）を記録することで達成される。次のステップとして、横隔膜のホールマウント免疫組織化学染色を行い、個々の神経筋接合部の神経支配を形態学的に評価する。最終的に、複合筋活動電位（CMAP）と神経筋接合部の解析を組み合わせることで、中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）疾患のげっ歯類モデルにおける横隔膜神経支配を定量的に研究するための強力なアプローチが得られます。この手法は、治療的介入によって横隔膜機能を正常に回復させることができるかといった、脊髄損傷分野における重要な疑問への回答に寄与します。横隔膜の呼吸機能は、外傷性脊髄損傷やALSのような衰弱性疾患における患者の転帰に重要な役割を果たすため、本技術の応用範囲はこれらの疾患の治療にまで及びます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクトラルフェローであるDr. Kali、Dr. Wrightの研究室の学部生であるMelanie Martin、および私の研究室のリサーチテクニシャンであるTamara Hollaが行います。動物を麻酔した後、背面を下にして手術台に置き、前肢を台に固定します。次に、正中線の両側で、頭蓋底から腹部に向かって腹面を剃毛します。皮膚を洗浄後、電極を配置し、アースを尾に接続し、対側の下腹部皮下に参照電極を挿入します。記録電極の自己粘着部分に導電性ゲルを塗布して準備し、片側の肋骨縁に沿って貼り付けます。次に、刺激電極を経皮的に、気管の外側かつ鎖骨の上方に0.5 cm間隔で配置します。電極は皮膚に対して垂直に挿入し、深さ約1 cmまで挿入してください。これらの電極はしっかりと固定する必要があります。手で固定するのが最適です。すべての電極を適切な刺激装置および増幅器に接続してください。収集されたデータはコンピュータに記録する必要があります。解析のため、単極刺激の刺激パラメータを 0.5 milliseconds、1 hertz の超最大パルスに設定します。振幅は 6 ～ 8 volts の範囲で設定可能です。刺激時間を 30 seconds に設定し、10 回の連続刺激による応答を平均化します。必要に応じて、各動物から得られたベースラインからピーク振幅までの記録を週 1 回程度の頻度で取得してください。動物の取り扱いについては、テキストプロトコルに詳述されています。注射用麻酔薬を過剰投与して動物を安楽死させた後、メスまたははさみを用いて開腹術を行います。剣状突起から正中線に沿って切開します。次に、メスとピンセットを使用して、皮膚と結合組織を筋肉から慎重に分離します。剣状突起を上に引き上げ、周囲の骨から横隔膜を切り出すことで、横隔膜を取り除きます。この際、横隔膜の筋肉を傷つけないように注意してください。実体顕微鏡下で、横隔膜の上面を上にして、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを満たしたシリコンラインディッシュに移します。横隔膜の周囲の組織をピンで固定し、横隔膜をピンと張らせます。その後、ピンセットと剪刀を用いて、上面から結合組織を除去します。固定液を20分間作用させた後、PBSを用いて10分間の洗浄を3回行い、固定液を除去します。次に、PBSで調製した0.1 molar glycineおよび2%BSA溶液を30分間適用します。その後、横隔膜をrod Domine結合alpha bungalow toin溶液中で15分間インキュベートします。固定剤の時と同様に、PBSを用いてバンガロウ毒素を洗い流します。次に、浴槽の液を冷メタノールに交換し、組織を-20 °Cで5分間冷却します。5分後、速やかにメタノールを除去し、前述と同様にPBSで組織を洗浄します。次に、0.2%TBP溶液を用いて1時間ブロッキングを行います。溶液を0.2%TBPで希釈した一次抗体液に交換し、緩やかに攪拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。翌日、0.2%TBPで10分間の洗浄を3回行い、一次抗体を除去します。その後、二次抗体溶液中で、ロッキングしながら暗所で1時間インキュベートします。最後に、PBSで3回洗浄して二次抗体を除去し、組織を暗所で保存します。次に実体顕微鏡下で、筋肉の上表面にある結合組織をさらに除去します。洗浄後、組織を直立型エピ蛍光顕微鏡にセットして撮影し、染色された半横隔膜の形態を定量的に解析します。横隔膜をホールマウントとして解析するため、20倍および40倍の倍率を使用してください。蛍光染色の大部分が焦点から外れています。標準的な顕微鏡を使用する場合、リアルタイムで解析を行うのが最適です。個々のNM jの形態を適切にスコアリングするために、脊髄の地形的な神経支配パターンに基づいて、筋肉を3つのセクションに分割して解析してください。腹側端の領域から開始し、筋線維に沿って視認できるすべてのNMJを解析します。抗体の浸透が不完全であるため、表面から3〜4本目の線維より深い部分は解析しないでください。完全なNMJでは、終末前軸索が太く、神経終末のすべての領域が下層の筋肉アセチルコリン受容体と完全に重なり合っています。部分的に脱神経したNMJでは、下層のアセチルコリン受容体の一部の領域に占有されていない箇所が見られます。完全に脱神経した神経筋接合部（NMJ）では、神経末端におけるアセチルコリン受容体との対応が見られません。当該領域の他のNMJは異なる形態を示すはずであり、もし複数の終末前軸索が1つのNMJを支配している場合は、抗体の浸透の成否が問われることになります。NMJは多重に存在しています。本症例では、神経支配の消失に続いて再神経支配が起こった可能性があります。神経末端が下層のアセチルコリン受容体と重複し、末端前の軸索が非常に細い場合、NMJは疎に神経支配されていることになります。これは再神経支配の指標でもあります。成体Sprague-Dawleyラットを用いた実験において、対照群には椎弓切除術を、その他の群には片側性の半挫傷脊髄損傷（SCI）を施しました。C4レベルにおいて、4〜5週間後に、椎弓切除または損傷部位と同側の横隔膜からピークCMAP振幅を記録しました。変異型ヒトSOD1タンパク質を発現させ、ALSモデルとした別のラットを用いた実験では、脊髄損傷（SCI）ラットにおいて、椎弓切除のみを行った対照ラットと比較して有意に減少していました。野生型対照動物の半横隔膜におけるNMJ（神経筋接合部）の形態は完全に維持されていました。しかし、トランスジェニックラットでは、NMJに著しい病理学的変化が認められました。一部では、矢印で示される完全な脱神経が確認されました。矢印で示されているように、他の神経接合部は部分的に脱神経しており、右側の神経筋接合部（NMJ）に見られるように、多重神経支配を受けているものや、ここに矢印で示したような細い末梢前軸索を持つものもありました。このビデオを視聴することで、横隔神経運動ニューロンによる横隔膜の機能的および形態的な神経支配を定量的に評価する方法について、十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Neuroscience

神経科学

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横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

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