CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング
2015年3月24日
肝臓の免疫細胞の安定した生体内高解像度イメージングは困難です。ここでは、マウス肝臓内の免疫細胞の遊走と細胞間相互作用を、インテンシブケアモニタリングと組み合わせた生体内多光子レーザー走査型顕微鏡法と組み合わせた長時間(約6時間)にわたって研究するための高感度で信頼性の高い方法を提供します。
次の実験の全体的な目標は、進行する肝炎症性疾患における白血球の移動と相互作用を追跡することです。これらの細胞が肝臓組織に動員される方法の根底にある一連のイベントと、免疫病理学への潜在的な関与をよりよく理解すること。これは、まずマウスの呼吸を制御するために気管切開を行うことで達成され、これは動物の長期的な生存を確保するための重要なステップです。
第2のステップとして、マウスは開腹術を行って肝臓を外科的に露出させ、多光子顕微鏡で臓器にアクセスできるようにします。次に、肝臓をローズに埋め込むことで固定し、配置して動きのアーチファクトを最小限に抑えます。イメージングは数時間にわたって実行でき、個々の白血球の動員、位置、相互作用の変化を追跡する高解像度のタイムラプスシーケンスが得られます。
肝臓の炎症を発症する過程で、この方法は、白血球の動員、細胞細胞の相互作用、免疫病理学のメカニズムなど、急性および慢性の肝臓炎症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。従来の顕微鏡法と比較したこの技術の主な利点は、多焦点顕微鏡法により、子馬の漂白や光毒性が低く、サンプルの摂動がほとんどない長期イメージングが可能であり、組織の深さ100マイクロメートルまでの光学スライスが可能であり、これは遠赤色レーザー光のレーザーのユニークな物理学によるものです。さて、この方法は肝臓病への洞察を提供することができます。
他のシステムにも簡単に採用できます。安定化および固定の方法以来、組織は生体内顕微鏡検査の事実上すべての問題に適用することができ、したがって、脾臓、腎臓、さらには皮下腫瘍などの臓器を容易に画像化することができる流暢な関連細胞を使用する。また、すべての白血球サブセットを可視化し、それらの相互作用と肝臓の炎症を送り込むことも可能です。
一般的に、この方法に不慣れな個人は、小動物手術の非常に複雑なため、苦労するでしょう。しかし、私たち自身の経験により、これは数週間の制限要因に過ぎず、いくつかの実践的なルーチンが必要です肝臓組織の脆弱性のため、準備手順を学ぶのは難しく、方法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。麻酔薬を設定した後、マウスのaroステージに3%のarosを充填し、40度の角度で注ぎます。
次に、手術作業エリアが完全に消毒されていることを確認し、必要なすべての器具なども消毒されていることを確認してください。次に、麻酔カクテルの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。5分後、動物の反射神経を確認してから、皮膚を消毒し、眼科用軟膏を目に塗ります。
次に、マウスを準備テーブルに固定します。テープを使用して、首をやさしく伸ばしすぎた腹側を露出させるように配置します。切歯に引っ掛けられた輪ゴムはこれを達成することができます。
次に、あごの下の最初の切開を約0.5〜1センチメートルの長さで行います。次に、唾液腺の間の結合組織を慎重に解剖し、気管を囲む筋肉管を見つけます。筋肉をそっと引き裂いて気管を露出させます。
気管の下に糸を引っ張り、T字型切開部を使用してマイクロハサミで気管を開きます。換気チューブを約半センチ挿入します。小さな解剖学的鉗子を使用してチューブを進めます。
次に、チューブを縫合糸で固定します。次に、安全性を高めるために、チューブを皮膚に縫合し、シアノアクリレートを使用して皮膚の切開部を密閉し、チューブを動物の頭に固定します。粘着テープを使用して、2%isoフッ素の連続的な流れを使用して麻酔を維持します。
マウスの手術の準備をした後、胸骨の下に小さな皮膚切開を行い、両側の肋骨の下で横方向に切り口を伸ばします。この過程で露出したすべての血管を焼灼します。出血を最小限に抑えるには、線状肘で小さな初期カットを行い、腹腔へのアクセスを確保します。
カットを水平に伸ばし、すべての血管を密閉し、肝臓にアクセスできるようにします。次に、マウスをアグロステージに移し、動物の両側にスライドを積み重ねて、所定の位置に保持します。これらのスタックは、後で配置される肝臓のステージが腹部に過度の圧力をかけないように、マウスの高さと一致する必要があります。
次に、胸骨の縫合糸を使用して、肋骨を引っ込めます。肋骨を引っ込めた後、肝臓と横隔膜をつなぐ靭帯を大動脈まで切断しますが、血管を破裂させたり切断したりしないように細心の注意を払って作業してください。また、肝臓と消化管をつなぐ靭帯を切断します。
マウスを45度回転させて、大きな肝葉へのアクセスを改善します。標準のカバースリップを取り、鋭くならないように端に沿ってテープで留めます。腹腔の上に置きます。
これは、肝臓が肝臓をステージに配置するためのステージとして機能します。ダブルボールスタイラスプローブ、またはパッド入りのヘラを肝臓の下に慎重に滑り込ませ、臓器の上部を保持します。湿った組織力学的な圧力を使用すると、肝臓組織が即座に損傷するため、臓器の取り扱いには注意が必要です。
次に、ローブをスライドに持ち上げ、ゆっくりと引っ張って所定の位置に置きます。葉は通常、曲がったり折りたたまれたりして、細いへらや湿った組織で組織を持ち上げて端を広げようとします。次に、カバースリップまたはスライドの形で横方向のサポートを追加します。
カバーを積み重ねて、肝葉と同じ高さになるように滑ります。肝臓の病期分類と固定は、プロトコルの最も重要なステップです。機械的なストレス、ねじれ、圧力は、即座に組織を損傷したり、少なくとも正弦波血管の血流を損な
ったりします。次に、横方向のサポートで支えられた肝臓葉の上にテープで留められたエッジを備えた大きなカバースリップを置きます。このカバースリップをできるだけ水平に配置します。肝臓を圧迫してはいけません。
白い組織は、画像が迅速に進行しない限り、血流が損なわれていることを示しています。現在、長期麻酔を提供するために2つの独立した腹腔内カテーテルを挿入し、Gファイブを適用する必要があります。これらは、27ゲージの針と柔軟なシリコンチューブから組み立てられています。
次に、シリンジポンプを使用してフローを開始します。カテーテルを後肢近くの下腹部に挿入します。バイタルモニターをマウスに取り付けた後、1つのXPBSに100ミリリットルの3%arosを準備します。
arosが摂氏41度に冷えたら、18ゲージの針が付いた5ミリリットルの注射器を使用して肝臓を埋め込みます。エアロが冷えたら、ハイデマンスパチュラを使用して余分なものを取り除き、肝臓をスキャンするのに十分な大きさの視野を露出させます。その後、スキャンを続行します。
視野が整ったら、マウスを顕微鏡下で動かして、タイムラプスイメージングに適したスキャン領域を選択します。肝臓組織は、十分な血流と最小限のサンプル摂動を持つ代表的なフィールドを特定する外部白色光源を使用して目でスキャンされます CXCR 6つのGFPヘテロ接合マウスを実験として生体内T-P-L-S-Mイメージングに供しました。一部の患者は、急性肝障害を誘発するために四塩化物の腹腔内注射を受けました。
GFPを発現するモーダル細胞をビデオで追跡し、その追跡を重ね合わせて細胞移動性のスナップショットを取得しました。その後、線路は正規化されました。正常な肝臓には、ランダムな移動パターンを持つ細胞がありました。
CCI 4を注射した肝臓は、細胞移動の障害を示しました。その起源から全変位を測定すると、CCI 4治療の36時間後に肝細胞損傷部位に細胞トラップがあったことが明らかになりました。肝臓の損傷による遊走障害は、個々の細胞の遊走速度を経時的にプロットすることでも示され、18時間後には部分的な停止、36時間後には完全な遊走性停止が示されました。
また、移動細胞の速度の低下は、細胞を集団として比較した場合にも統計的に有意であることを示すことができました。したがって、このアプローチは、肝臓疾患の発症における細胞遊走とポジショニングの変化を追跡するのに適しています。このビデオを見れば、インタバイタルマルチフォト顕微鏡用のマウスの肝臓の作り方を十分に理解できるはずです。
ここで提供する方法は、動物を安定させて長期的な生存を実現するだけでなく、私たちが提供する穏やかな固定方法により、運動アーチファクトを最小限に抑えることができます。マスクすると、この手法は適切に実行されれば約1時間で実行できますこの手順では、動物のバイタルパラメータを制御して、体温、心拍数、酸素、およびCO2レベルを安定させることが重要です。これは、この技術に従って壊死と呼吸の深さを適応させることによって達成できます。
フローサイトメトリー分析やレーザーキャプチャマイクロダイセクションなどの他の手順を実行して、浸潤免疫細胞の表現型や組織または浸潤細胞によって分泌されるメディエーターなどの追加の質問に答えることができます。この技術により、研究者は肝臓における白血球の輸送と細胞相互作用のダイナミクスに関する洞察を得ることができ、炎症性肝疾患につながる一連の事象を解剖することが可能になりました。マルチフォト顕微鏡に使用される高エネルギーパルス赤外レーザーでのイメージングを行うレーザーセキュリティガイドラインに従ってください。
この実験を行う際には、レーザー光線の反射が目や皮膚に危険を及ぼさないようにしてください。
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概要
この研究は、肝臓内の免疫細胞の安定な生体内高解像度イメージングの方法を提示し、長期間にわたるそれらの移動と相互作用の観察を可能にします。生体内マルチフォトンレーザー走査顕微鏡法を用いるこの手法により、肝臓炎症疾患のマウスモデルにおける白血球の挙動を詳細にモニタリングすることができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 生体内イメージング
背景
- 肝臓炎症における免疫細胞のダイナミクスを理解することは、免疫病理学の洞察を得るために重要です。
- 白血球の挙動を捉えるために長期のイメージング技術が必要です。
- 以前の方法では、長期の観察期間に対する感度と信頼性に欠けていました。
- この研究は、新しいイメージングアプローチでこれらの課題に対処します。
研究目的
- 肝臓における白血球の移動と相互作用を調査すること。
- 肝臓炎症時の免疫細胞の動員メカニズムを解明すること。
- 免疫反応の長期イメージングの信頼性のある方法を提供すること。
使用した方法
- マウスの呼吸制御のための気管切開。
- イメージングのために肝臓を露出するための開腹術。
- 動きのアーティファクトを減らすために肝臓を培地に埋め込む。
- 高解像度イメージングのための生体内マルチフォトンレーザー走査顕微鏡法。
主な結果
- 白血球の移動と相互作用の長期イメージングの成功。
- 時間経過に伴う白血球の挙動の変化を捉えた高解像度のタイムラプスシーケンス。
- 肝臓炎症における免疫細胞動員のダイナミクスに関する洞察。
- 免疫反応を研究するための方法の実現可能性を実証。
結論
- 開発された方法は、免疫細胞ダイナミクスの研究のための強力なツールを提供します。
- 肝臓疾患における白血球の役割の理解を深めます。
- このアプローチは、他の炎症と免疫反応のモデルにも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Long-term intravital imaging of immune cell dynamics in the liver enables mechanistic de-risking of inflammatory liver disease targets by visualizing leukocyte recruitment, positioning, and interactions in real time. This approach supports target validation by linking CXCR6-expressing immune cell behavior to disease progression in preclinical models, improving predictive confidence in therapeutic hypotheses. The method provides a disease-relevant system for assessing immunomodulatory compounds under physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking CXCR6.gfp+ immune cell migration and positioning in healthy and diseased liver.
- Operational Value: Provides functional validation of leukocyte subsets involved in immunopathology through direct observation of cell-cell interactions.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by visualizing impaired migration and cell trapping in CCl4-induced liver injury models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements such as migration speed, total displacement, and interaction frequency for compound screening.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-resolution time-lapse data with minimal phototoxicity over 6-hour imaging windows.
- Operational Value: Enables standardized preparation and fixation protocols that reduce variability across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects immune cell dynamics to disease progression by correlating CXCR6+ cell behavior with acute and chronic liver damage.
- Operational Value: Facilitates preclinical model validation by enabling longitudinal assessment of leukocyte trafficking in intact tissue.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking imaging readouts to histopathological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing dynamic, quantitative readouts of immune cell behavior in a disease-relevant liver microenvironment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of leukocyte recruitment mechanisms and stromal interactions in inflammatory liver disease.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparation with stabilization of vital signs for consistent imaging conditions.
- Analytics: Provides track-based metrics including migration speed, displacement, and interaction maps for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects intravital observations to disease phenotypes through correlation with CCl4-induced hepatocellular damage.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organs and disease models via standardized surgical preparation and intravital imaging framework.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in leukocyte-driven immunopathology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized anesthesia, vital sign monitoring, and tissue embedding protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by visualizing target engagement and cellular response in intact tissue.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on direct observation of immune cell modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and intravital microscopy operation.
- Dependent on multiphoton laser scanning microscopes with tunable far-red excitation and sensitive detectors.
- Necessitates cross-team standardization of surgical preparation, vital sign monitoring, and image analysis pipelines.
- Adaptation to other models requires validation of tissue stabilization and reporter expression in target organs.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for specialized training to maintain animal viability during long-term imaging.
