CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

本実験の全体的な目的は、進行する肝炎症疾患における白血球の遊走と相互作用を追跡することです。これにより、これらの細胞が肝組織に動員されるメカニズムの根底にある一連の出来事と、免疫病理への潜在的な関与についてより深く理解することを目指します。この目的を達成するため、まず気管切開を行い、マウスの呼吸管理を可能にします。これは、動物の長期生存を確保するために極めて重要なステップです。

第2ステップとして、マウスに開腹術を施して肝臓を外科的に露出し、マルチフォトンスコープで臓器へのアクセスを可能にします。次に、動きによるアーチファクトを最小限に抑えるため、肝臓をローズに埋め込んで固定および配置します。数時間にわたってイメージングを行うことで、個々の白血球のリクルート、配置、および相互作用の変化を追跡する高解像度のタイムラプスシーケンスを取得できます。

肝炎症の発症過程において、本手法は、白血球の動員、細胞間相互作用、あるいは免疫病理学的メカニズムなど、急性および慢性肝炎症の分野における重要な疑問の解明に寄与します。従来の顕微鏡法と比較した本手法の主な利点は、マルチフォーカル顕微鏡を用いることで、低レベルの光退色や光毒性でサンプルへの摂動をほとんど伴わずに長期的なイメージングが可能であること、および遠赤色レーザー光の独自の物理的特性により、組織深部まで最大100 µmの光学切片を取得できることです。したがって、本手法は肝疾患に関する知見を提供することができます。

この手法は他のシステムにも容易に適用可能です。組織の安定化および固定方法により、実質的にあらゆる生体内顕微鏡観察の課題に適用できるため、流動的な関連細胞を用いて、脾臓や腎臓、さらには皮下腫瘍などの臓器を容易にイメージングできます。また、すべての白血球サブセットを可視化し、それらの相互作用や肝炎症を観察することも可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、小動物外科手術の極めて高い複雑さから苦労されることでしょう。しかし、我々の経験からすれば、これは数週間の限定的な要因に過ぎず、実技によるルーチンワークを重ねることで克服できます。肝組織は非常に脆弱であるため、準備段階の習得は困難であり、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。麻酔処置を行った後、マウス用ステージに3%arosを、40度の角度から注いで満たしてください。

次に、手術部位および必要な器具などを十分に消毒します。その後、麻酔剤カクテルを腹腔内投与してマウスを麻酔します。5分後、動物の反射を確認し、皮膚を消毒して眼科用軟膏を眼に塗布します。

次に、マウスを処置台に固定します。テープを用いて、頸部を緩やかに伸展させ、腹側が露出するように配置します。切歯にゴムバンドを掛けることで、この固定を行うことができます。

次に、顎の下に0.5から1 cmほどの長さの初回切開を行います。続いて、唾液腺の間の結合組織を慎重に剥離し、気管を囲む筋肉の管を探します。筋肉を優しく裂いて、気管を露出させます。

気管の下に糸を通し、次にマイクロ剪刀を用いて、切開線にT字型の切開を加えて気管を開きます。換気チューブを約0.5 cm挿入します。小型の解剖学的ピンセットを使用してチューブを進めます。

次に、チューブを縫合糸で固定します。さらに固定を確実にするため、チューブを皮膚に縫い付け、シアノアクリレートを用いて皮膚の切開部を封鎖し、チューブを動物の頭部に固定します。粘着テープを使用し、2% iso fluorineを連続的に流して麻酔を維持します。

マウスの手術準備を整えた後、胸骨の下に小さな皮膚切開を加え、そこから肋骨の下の両側に向かって横方向に切開を広げます。この過程で、露出したすべての血管を電気焼灼します。出血を最小限に抑えるため、腹腔に到達する際は、正中線上の肘の部分で最初に小さな切開を行ってください。

切開を水平方向に広げ、すべての血管を封鎖して肝臓に到達できるようにします。次に、マウスをアグロステージに移動させ、動物を固定するために左右にスライドグラスを積み重ねます。この積み重ねたスライドの高さはマウスの高さに合わせ、後で設置する肝臓用ステージが腹部に過度な圧力をかけないようにしてください。

次に、胸骨に縫合糸を用いて肋骨を牽引します。4-0の縫合糸で十分です。肋骨を牽引した後、肝臓と横隔膜をつなぐ靭帯を切断します。大動脈まで完全に切断しますが、血管を破裂させたり切断したりしないよう細心の注意を払ってください。また、肝臓と胃腸管をつなぐ靭帯も切断します。

マウスを45度回転させ、より大きな肝葉へのアクセスを改善します。標準的なカバーガラスを用意し、端が鋭利にならないよう縁に沿ってテープを貼ります。それを腹腔の上に置きます。

これは、肝臓をステージ上に配置するための土台として機能します。ダブルボールスタイラスプローブまたはパッド付きスパチュラを肝臓の下に慎重に滑り込ませ、臓器の上部を保持します。濡れたティッシュを使用しても、機械的な圧力が加わると即座に肝組織に損傷を与えるため、臓器の取り扱いには細心の注意を払うことが不可欠です。

次に、葉をスライド上に持ち上げ、軽く引っ張って位置を調整します。葉は通常、曲がったり折れ曲がったりした状態になるため、細いスパチュラまたは湿らせたティッシュで組織を持ち上げ、端をそっと広げてください。続いて、カバーガラスやスライドを用いて側面にサポートを配置します。

カバーガラスを積み重ねて、肝葉と同じ高さにします。肝臓のステージングと固定は、本プロトコルにおいて最も重要な工程です。機械的なストレス、ねじれ、または圧迫が加わると、即座に組織損傷が生じるか、少なくとも類洞血管内の血流が損なわれます。

次に、端にテープを貼った大きなカバーガラスを、側方支持体で固定された肝葉の上に被せます。このカバーガラスができるだけ水平になるように配置してください。肝臓を圧迫しないように注意してください。

イメージングを迅速に行わない限り、組織が白くなっていることは血流の障害を示しています。これから、長期的な麻酔の維持およびG fiveの投与を行うために、2本の独立した腹腔内カテーテルを挿入する必要があります。これらは27ゲージの針と柔軟なシリコーンチューブを用いて組み立てられます。

その後、シリンジポンプを用いて注入を開始します。カテーテルを後肢に近い下腹部に挿入してください。マウスにバイタルモニターを装着した後、1 XPBSで3% arosを100 milliliters調製します。

Arosが41 °Cまで冷却されたら、18ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用いて、肝臓をArosに埋め込みます。Arosの冷却が完了したら、Heidemanスパチュラを使用して余分な部分を取り除き、肝臓をスキャンするのに十分な広さの視野を確保します。その後、スキャンを開始してください。

視野を準備した後、マウスを顕微鏡下に移動させ、タイムラプスイメージングに適したスキャン領域を選択します。外部白色光源を用いて肝組織を目視でスキャンし、血流が十分でサンプルへの擾乱が最小限である代表的な領域を特定します。実験として、CXCR6 GFPヘテロ接合体マウスを用いて生体 intravital T-P-L-S-M イメージングを行いました。一部のマウスには、急性肝損傷を誘発するために四塩化炭素を腹腔内投与しました。

GFPを発現しているModal細胞をビデオで追跡し、その軌跡を重ね合わせることで細胞移動の全体像を得た。その後、これらの軌跡を正規化した。正常な肝臓では、細胞はランダムな移動パターンを示した。

CCI fourを注入した肝臓では、細胞遊走の障害が認められました。起点からの総変位量を測定したところ、CCI four処理から36時間後、肝細胞損傷部位において細胞のトラッピングが生じていることが明らかになりました。肝損傷による遊走能の低下は、個々の細胞の遊走速度を時間経過とともにプロットすることでも示すことができ、18時間後に部分的な停止、36時間後に完全な遊走停止が認められました。

細胞集団として比較した際にも、遊走細胞の速度低下に統計的な有意差があることが示されました。したがって、この手法は進行中の肝疾患における細胞の遊走および配置の変化を追跡するのに適しています。このビデオを視聴することで、生体内多光子顕微鏡観察に向けたマウス肝臓の調製方法について十分に理解できるはずです。

本手法では、緩やかな固定法を用いることで、動物を長期生存させるための安定化と、体動によるアーティファクトの最小化を同時に実現しています。習熟すれば、この手法は適切に実施して約1時間で完了させることができます。この処置の間、動物の体温、心拍数、酸素およびCO2レベルなどのバイタルパラメータを制御することが重要です。これは、本手法に従って麻酔の深さと呼吸を調整することで達成されます。

浸潤した免疫細胞の表現型や、発生後に組織または浸潤細胞から分泌されるメディエーターなど、追加の疑問を解決するために、フローサイトメトリー解析やレーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどの他の手順を実施することができます。これらの手法により、研究者は肝臓における白血球の移動や細胞間相互作用のダイナミクスに関する知見を得ることができ、炎症性肝疾患に至る一連のイベントを詳細に解析することが可能になりました。マルチフォト顕微鏡に使用される高エネルギーパルス赤外線レーザーでイメージングを行う際は、レーザー安全ガイドラインに従ってください。

本実験の実施中は、レーザー放射の反射によって目や皮膚に危険が及ばないように注意してください。