Name: CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶ肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング法。CXCR6.Gfpレポーターマウスを用いて、白血球の動態と相互作用を高解像度で観察し、肝炎症における免疫細胞の動員メカニズムを解明する。

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著者は、アーヘン大学病院の中央動物施設の技術支援に感謝します。この研究は、ドイツ研究財団(DFG Ta434/2-1、DFG SFB/TRR 57)およびアーヘンの学際的臨床研究センター(IZKF)の支援を受けました。この研究は、アーヘン工科大学医学部内のアーヘン臨床研究学際センター(IZKF)の中核施設であるコアファシリティ「Two-Photon Imaging」によってさらに支援されました。

注：実験は、動物の保護に関する（NIH出版、第8版、2011年）「実験動物の管理と使用に関する指針」及び指令63分の2010 / EU以下の動物実験を支配するドイツの法律に従って行った科学的な目的（欧州連合官報、2010）に使用される。公式許可は政府の動物の管理と使用オフィス（LANUVノルトラインヴェストファーレン、レックリングハウゼン、ドイツ）から付与されました。 注：短期画像化のために省略することができる手順の準備時間を削減し、外科的プロトコルを簡略化するアスタリスク（*）が付いています（ 例もショット、3-Dスタックまたは短期間のタイムラプス顕微鏡をスナップ）。必要に応じて、しかし、生存期間が顕著に減少する場合の撮像には、広範囲の監視および制御を循環することなく行うことができる。 1.顕微鏡のセットアップと手術前の準備（5-10マイルN） <ol><li> （顕微鏡、パワーラボ、レーザー、加熱パッド、気象室、Webカム、シリンジポンプ装置、人工呼吸器）上のスイッチシステム。 </li><li>イソフルラン蒸気と設定イソフルランレベルへのO 2供給が1.5体積％に接続します（V / V）、小動物人工呼吸器に接続します。 <ol><li>短期間のイメージングのために、唯一の初期腹腔内麻酔誘導後、イソフルランを用いて麻酔を維持し（ステップ2.2参照）。次いで、安定な肝臓微小循環を保証するために2巻の％（v / v）のイソフルランを使用して、2時間未満に撮像時間を維持する。 </li></ol></li><li> 150〜200μLの容量で120〜140呼吸サイクル/分に呼吸を設定します。 </li><li>マウスのアガロース段階を設定します。 40°の角度でディッシュ（約10cm×15センチベース）に注ぐこと、3％（w / v）アガロース100mlのを準備する。 </li><li>必要な機器を収集外科作業領域を設定します。微生物感染を防ぐために、w / vのSekuseptフォルテSの1％溶液（9.9％を使用して器具を消毒する5分です。v、ホルムアルデヒド/ w）の、グルタラール9.8％実験（ 図1A）の前に。 </li><li>残りの成分を得る：皮膚消毒剤（ 例えば 、10％ポビドンヨード溶液）、肝臓ステージ（スタック·ブリッジ）、アガロース溶液（3％（w / v）のPBS中の）5％、シリンジポンプ（w / v）のグルコース溶液を麻酔液I（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を、綿棒、n-ブチル-2- Cyanoacrylat、及び1×PBSで（G-5）、シリンジポンプ。予熱のインキュベーション室にアガロース段階ディッシュを入れてください。 </li></ol> 2.気管切開（10〜15分） <ol><li> 25〜28グラムの重さ、家の繁殖でからC57BL / 6マウスを使用してください。 12時間明/ 12時間暗サイクルで、温度と湿度が管理された環境でのハウスFELASAガイドラインに従って特定病原体フリーの条件下ではマウス、。動物に標準マウス食餌（スニフ標準的なげっ歯類食）と水を自由に無料でアクセスを許可します。 </li><li> initによってマウスを麻酔IAL腹腔内麻酔液II（ケタミン0.1 mg / mlの、キシラジン1 mg / mlの、ブプレノルフィン10μg/ ml）を250μlの内（ip）注射。 <ol><li> *生体内撮像中維持費のために、継続的に連続的な腹腔内注射により麻酔液Iを投与し（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を0.2ミリリットル/時間の流量でシリンジポンプ装置を使用して吸入イソフルラン0.5巻の％との組合せ（v / v）である。 </li><li> 5分後の反射神経をチェックします（ 例えば鉗子でフットパッドピンチ）、気管切開のために皮膚を消毒、マウスは外科トレラント麻酔状態にある場合の準備を開始。 </li><li> （ 図1B）を乾燥から角膜を防ぐために、目の保護クリーム（ 例えば 、デクスパンテノールは50mg / g）を適用します。 </li></ol></li><li>四肢のために粘着テープを使用して腹側を露出する準備テーブルの上にマウスを固定。穏やかに、この位置に固定する、例えば 、首を引き伸ばし、ゴムバンドを使用して、tはフック切歯O。 <ol><li>綿棒で消毒剤を適用することにより、ポビドンヨード溶液を用いて、皮膚や毛を消毒する。 </li></ol></li><li>直接顎の下に、最初の皮膚カット（0.5〜長さ1cm）を実行する（ 図1C） <ol><li>慎重に唾液腺（ 図1D）との間に結合組織を解剖。 </li><li>慎重に開いている筋肉の管周囲の気管（ 図1E、F）を引き裂く。 </li></ol></li><li>後で換気チューブの固定（ 図1G）のための気管の下に外科スレッドを置きます。 <ol><li> T字型の切開を行う軟骨リング間のマイクロハサミでオープン気管（ 図1H） </li></ol></li><li>切開（〜0.5センチメートル）を介して気管内に換気チューブを置きます。 、前方のチューブをプッシュ小さな解剖鉗子で尾方端をつかみ、ゆっくりと気管にチューブを前進させるために（ 図1I） </li><li>外科糸でチューブを固定（ 例： </e気管内部の管の周囲結び目を結ぶステップ2.5に配置されたスレッドとM&gt;、5-0）;偶発depositioning（ 図1J、K）を避けるために、皮膚の管の第2頭蓋固定を行う。 </li><li>シールは、組織接着剤（ 例えば 、n-ブチル-2- Cyanoacrylat）（ 図1L）で切断した。 </li><li>粘着テープを使用して先頭にチューブを固定する。 </li></ol> 3.開腹（15〜20分） <ol><li>低体温症を防ぐために加熱パッド上にマウスを置きます。腹部を剃る、慎重に皮膚から毛を取り除く。ポビドンヨード溶液を用いて剃毛した皮膚や毛を消毒。 </li><li>外科用ハサミ（ 図2A）を使用して、胸骨の下にある小さな皮膚カットを行います。出血を防ぐために、すべての可視血管を焼灼、両側に横方向に肋骨の下にカットを拡張します。 </li><li>慎重に腹膜（ 図2B）を開く、胸骨下の白線の小さなカットを行う。 cauterizを使用して両側にカットを拡張ationが（ 図2C、D）を出血を防ぐために。 </li><li>アガロース段階皿（ 図2E）にマウスを置きます。マウス（通常は12〜14カバースリップ）（ 図2F）の両側に適切な高さのスタックを置きます。 </li><li>呼吸に顕微鏡を同期させるために背中の上部の下に呼吸トリガーセンサを配置します。トリガーユニット（ 図2G）をアクティブにします。 </li><li>リブ（ 図2I）を後退させる胸骨を通して外科糸（5-0）を配置します。 </li><li>慎重に湾曲した外科用ハサミを使用して、肝臓および横隔膜（鎌状靱帯）、ならびに肝臓および胃腸管を連結する靭帯を切断する。大動脈（ 図2J）まで鎌状靭帯をカット。 </li></ol> 4.サンプルのセットアップ（10〜15分） <ol><li>大型肝葉へ簡単にアクセスするための45°の角度で右側にマウスを置きます。 </li><li>腹部をカバーし、肋骨下のステージングブリッジを追加します。空洞。鋭いエッジ（ 図2K）を覆うように粘着テープ被覆を有する標準カバースリップを使用してブリッジを製造する。 </li><li>ステージ上で大規模な肝葉を置きます。慎重にダブルボールスタイラスプローブまたは肝臓下のパッド入りのへらをスリップし、湿った綿棒やウェットティッシュを使用して臓器の上部を保持する。スライド上に葉を持ち上げて、穏やかなドラッグを適用します。ローブは曲げたり折り畳むことができる。肝臓（ 図2L）の唯一の穏やかな操作に余分なケアを提供する。 </li><li> 例えば 、小さなカバースリップ（20ミリメートル×20ミリメートル）、その横に肝葉のほぼ同じ高さの山がカバースリップをサポートするために、横方向のサポートステークスを、置きます。 </li><li>肝葉に大きなカバースリップ（24ミリメートル×50ミリメートル）を配置します。そのカバースリップは、（ 図2M）できるだけ水平に配向されていることを確認してください。 注：カバースリップは、それを圧迫することなく、組織と接触しているべきである。血流障害（白組織）の目に見える兆候を確認してください。 microcirc場合、ulationが破壊され、さらに支援する株式を追加します。 </li><li> *長期の麻酔およびG-5アプリケーションのために二つの独立した腹腔内カテーテル（ 図2N）を配置します。次の後肢に下腹部に横方向にカテーテルをインストールします。 注：腹腔カテーテルは柔 ​​軟なシリコーンチューブ（ 図3）27 G針を接続して自作することができる。 </li><li> *皮膚に5-0外科用糸のループを有する固定する針が偶発的変位を回避する。 </li><li> * I 1カテーテルする麻酔溶液とシリンジポンプを取り付け、0.2ミリリットル/時間に設定された流量、カテーテル2にG-5とシリンジポンプを取り付け、0.1ミリリットル/時に流量設定。 </li></ol> 5.マウスの監視<ol><li> *場所のECGフロントに電極および後肢四肢（ 図4A）。 </li><li> * 2レベルセンサをCOに有効期限のチューブを取り付けます。 </li><li> （ 図4Cの熱パッドに接続された外部温度センサを追加する）。 </li></ol> 6.埋め込み、組織固定（5〜10分） <ol><li> 1X PBSにアガロース（w / v）の3％の100ミリリットルを準備します。温度を5 mlシリンジと18 G針（ 図5A）を用いて41°Cである場合に肝臓を埋め込 ​​む。 </li><li> （ 図5B、C）カバースリップ上で、マウスの周りに残っているアガロースを注ぐ。アガロースが完全に糊化するまでお待ちください。 </li><li>準備肝葉（ 図5D、E）をスキャンするために十分なviewfield大型の準備、ハイデマンのへらを使用して余分なアガロースを削除します。 </li></ol> 7.イメージング<ol><li>顕微鏡気候室にマウスを転送します。 </li><li> 1×PBS（37℃に予熱した）の50〜100ミリリットルを追加します。 </li><li>蒸発（ 図5F）を防止するために試料皿をカバーしています。 </li><li> * 0.5体積％（V / V）に吸入イソフルランを減らします。 </li><li> *、ソフトウェアを監視するECG、心拍数及び呼気CO 2の記録を開始。 </li><li>イメージングを起動します。オープンラのSerシャッター、Z-スタックの上限と下限を定義し、関心のビューのフィールドを識別し、時間経過の記録を開始。必要に応じて、Z-ドリフト（ 例えば 、血液の圧力または温度変動の変化に、 図（5G）を補正するために、Zスタックを再調整する。 注：撮像期間終了後、または動物の循環や麻酔が不安定になった場合、（麻酔からの覚醒せず）頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは利益相反を明らかにしていない。

我々の研究の目的は、肝臓の生体TPLSMイメージングのための高度に標準化された安定した再現性のある方法を開発することであった。一般的に、生体内イメージングは​​、開発、恒常性および疾患における異なる白血球集団のホーミングとの相互作用を、以下の実際の生活条件の下で細胞挙動に貴重な洞察を与えている。しかし、呼吸器および腸の蠕動運動を直接他の固形臓器と比較して、肝臓、ならびにそれらの高い脆弱性に送信される起因れる肝臓のやや困難な解剖学的位置は、安定した長期生体内イメージングのためのいくつかの課題を課した。ここ数年、マウスでの多くの実験研究が常駐から主要な貢献や浸潤単球/マクロファージ30-32、好中球33または様々なリンパ球サブセット34,35と、負傷した肝臓28中の免疫細胞浸潤の非常に動的な性質を明らかにした。しかし、Mこれらのデータのレオナは、エンドポイント分析（ 例えば 、多色、動物を犠牲にした後にフローサイトメトリー）から誘導した。今まで唯一の少数の研究は、多色生体内イメージングを用いて肝臓の炎症の際に携帯トラフィックのダイナミク...

細胞や器官全体での細胞機能、さらには生物全体の可視化は、本体2の事実上すべての部分を含め、50年以上のために大きな関心となっている。そのため、いくつかの初期の研究では、すでに肝臓3,4の生体内イメージングを採用。しかし、いくつかの制限が肝組織の長期安定した高解像度画像に関する最新に存在する。 によるダイアフラムおよび胃腸管5との密着肝臓の解剖学的位置に、微細な生体イメージングのための最も一般的な問題は、呼吸による動きと、より少ない程度に、腸管の蠕動6である。他の固形臓器と比較して、肝臓手術は特に困難である。による緻密な微小血管構造のために、外科的処置は、大規模な出血性病変を引き起こす障害微小7、また居住者のiの活性化できそのようなクッパー細胞8としてmmune細胞。したがって、組織の機械的固定は6,9は生体顕微鏡イメージングに干渉する可能性がある他の場所で公開されている。 健康な肝臓では、全血液量の10〜15％は、肝血管系内に存在し、臓器循環の変化（ 例えば 、血圧変動の影響を非常に受けやすい臓器をレンダリングする、全体的な心拍出量10の約25％を受け取る）。したがって、過度の組織処理または集中循環により、例えば 、せん断応力、変位、損傷に対する肝臓の血流の途絶は、同様に肝臓の免疫応答に影響を与え、白血球遊走行動における人為的な変更、障害、肝酸素したがってさらに肝臓の損傷につながる臓器保存および動物の全体的な生活時間など。 初期の微視的研究は、生体内エピ蛍光MIに基づいていたcroscopy、そのような光退色および低い浸透深さのようないくつかの技術的な制約は、長期の肝臓イメージング4,11,12のためのこの技術の使用を制限する。この新しい方法は、現実の状況13-15の下に、ほぼすべての臓器においてイメージング研究を実行することが技術的に可能であったように、1990年代の多光子顕微鏡の発展に伴い、フォト漂白または侵入深さの制限は主に、解決された。しかし、肝臓イメージングに対する主残された課題であった：いくつかの時間の16のより長い期間の呼吸運動、肝臓組織の自己蛍光、肝類洞に不変の血流を確保し、特に安定したイメージング。 いくつかの研究は、肝臓17における様々な白血球の機能および移動に対処し、 例えば 、NKT細胞18-20、T細胞21,22、肝臓マクロファージ23,24または好中球25、長期多メートルもののicroscopyイメージングはまだ成功し、さらに難しい既存の損傷に起因する急性または慢性の肝疾患を有する動物におけるタスク及び更なる損傷26に、したがってより高い感受性を確立されていなかった。しかし、リアルタイムで回遊行動と肝臓の白血球の細胞機能を監視することは、肝臓の恒常性と疾患27において、その特定の役割で小説洞察を可能にする。 ケモカイン受容体CXCR6は、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、およびいくつかのT細胞集団18,28を含むいくつかのリンパ球サブセット上で発現される。マウスでの以前の研究は、CXCR6とその同族リガンドCXCL16が恒常性の間に肝正弦波にNKT細胞のパトロールを制御することができることが示されている。したがって、（CXCR6座に緑色蛍光タンパク質[gfpを]のノックインを運ぶ）CXCR6.gfpマウスの使用は、脳29のような種々の器官でのリンパ球の遊走を調べるために記載されているまた、肝臓18,20は 、炎症時にCXCR6.gfp細胞の浸潤を増加を示す。 この研究で提供される方法では、安定化条件下で長期間にわたりこれらのプロセスに従うことが可能であった。生体多光子ベースの手順は、動物や器官の最小限の摂動と高度に再現性があったイメージングを可能にした。呼吸と循環の開閉制御に続く大規模な監視により、長期的な動物の生存のために最適化。と非常に柔軟で、腎臓や脾臓などの他の実質臓器にも採用しやすい。

<table><tbody><tr><td>麻酔薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum、0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Rotex Medica</td><td>料金: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac 麻酔システム</td><td>ハーバード装置</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>グルコース 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (イソフルラン蒸気) 気化器</td><td>アイケマイヤー</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>フォレンアボット</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>アイソトニック(0.9%)NaCl溶液</td><td>デルタセレクトGmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン10%</td><td>セバ</td><td>電荷:36217/09</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン2%</td><td>メディスター</td><td>電荷:04-03-9338 / 23</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20ミリリットルシリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 三角フラスコ</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ビーカー 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>2 ml シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>市販の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Eye と鼻軟膏</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>綿ガーゼ綿棒</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr>カバー<tr><td>スリップ24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr>デュ<tr><td>ラポアシルクテープ</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>羽使い捨てメス</td><td>羽02.001.30.011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファインボアポリエチレンチューブ0.58 mm ID</td><td>スミス医療</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>ヒストアクリル</td><td>ブラウン</td><td>1050052</td><td>5x 0.5 ml</td></tr><tr><td>ロイコプラスト</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>アルコールHaut&hellip;farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>ステリカン針 18 G x 1</td><td>B. ブラウン</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>ステリカン針 27 3/4 G x 1</td><td>B. ブラウン</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ティッシュペーパー</td><td>市販</td></tr><tr><td>手術器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アマルガム バーニッシャー 3PL</td><td>ギャッツ</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>ブレアリトラクター(4芯(鈍い))x2</td>スト<td>ルツ&クライン</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>デュモン No.7 鉗子</td><td>ファイン・サイエンス・ツールズ社</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe鉗子湾曲x1</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子ストレート x2</td><td>ファインサイエンスツールズ株式会社</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>ハイデマン スパチュラ HD2</td><td>ストーマ</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>シザー</td><td>ファインサイエンスツールズ株式会社</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Semken鉗子</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した小型手術用ハサミ</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>小型手術用ハサミ ストレート</td><td>ファイン・サイエンス・ツールズ社</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツールズ株式会社</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECG トリガーユニット</td><td>ラピッドバイオメディカル</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR 呼気終末二酸化炭素分析装置</td><td>AD 機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>ハーバード大学装置</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>多光子顕微鏡 Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 8チャンネルレコーダー</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>温度制御加熱パッド</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>温度センサー</td><td>comercially available</td><td></td><td></td></tr> 顕微鏡<tr><td>用温度制御システム -Cube&ボックス</td><td>ライフイメージングサービス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cxcr6.gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html>傷害に応答して肝臓の炎症は、単球、好中球、T細胞サブセット、B細胞、ナチュラルキラー（NK）およびNKT細胞を含む白血球の異なるサブタイプの浸潤を伴う非常に動的なプロセスである。免疫細胞の遊走を監視するための肝臓の生体内顕微鏡起因試料調製及び固定、光学分割および長期動物の生存に関して高い要件に特に困難である。しかし、炎症過程の動力学ならびに細胞の相互作用の研究は、より良好な炎症性肝疾患の開始、進行および退行を理解するために重要な情報を提供することができる。したがって、高感度で信頼性の高い方法は、集中治療と組み合わせて生体二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）で長時間（約6時間）マウスの肝臓に移行し、異なる免疫細胞の細胞間相互作用を研究するために設立された監視。 ENT &quot;&gt;提供される方法は、穏やかな調製および器官の最小の摂動と肝臓の安定した固定を含み、長期生体内イメージング最大6時間の期間にわたって事実上退色や光毒性効果を多色多光子顕微鏡を用いて、トラッキングを可能にする特定の白血球サブセットの、及び安定した撮影条件によるマウスの重要なパラメータと循環、温度およびガス交換の安定化の大規模な監視する。 肝臓の炎症の際のリンパ球の遊走を調べるためには、ノックインマウスCXCR6.gfpベースライン条件下および四塩化炭素（CCl 4）の腹腔内注射（複数可）によって誘発される急性および慢性肝障害の後に生体内肝臓イメージングに供した。 、ナチュラルキラー（NK） - - このようなCD4 T細胞などのTリンパ球のサブセットでなく、粘膜associ CXCR6、主にナチュラルキラーT（NKT）上で、リンパ球上に発現されるケモカイン受容体であるatedの不変（MAIT）T細胞1。 CXCR6.gfp +免疫細胞の回遊パターンと位置決め後の肝臓損傷の際、変更された行動を詳細に洞察力、したがって、疾患の進行におけるそれらの潜在的な関与を許可。

私たちの生体内TPLSMアプローチを検証するために、我々は生体内TPLSMイメージングにCXCR6のGFP / +マウスを受ける。マウスは、いずれかのベースライン対照として未処理のまま、または急性肝障害20を誘導するために四塩化炭素（CCl 4）の単回腹腔内注射を行った。 ビデオシーケンスは、2-5時間の期間にわたり採取し、細胞は、それらの緑色蛍光を経時的に追跡した。一般的な細胞運動性を表示するには、手順の間に検出されたすべてのトラックは、重畳画像（ 図6A）としてプロットした。ベースライン条件下で細胞が中心静脈に向かって肝臓類洞に沿って長距離の移動を示したが、18時間のCCl 4処置後CXCR6 + / gfpの細胞は、既に部分的に損なわれた運動パターンを示した。いくつかの高速移動の細胞はまだ、肝臓類洞に存在したが、いくつかの焦点領域が、その細胞で見ることができた傷害の領域に細胞を募集し走化性応答を示す、ローカルスキャンにランダム移行から...

肝臓の免疫細胞の安定した生体内高解像度イメージングは困難です。ここでは、マウス肝臓内の免疫細胞の遊走と細胞間相互作用を、インテンシブケアモニタリングと組み合わせた生体内多光子レーザー走査型顕微鏡法と組み合わせた長時間(約6時間)にわたって研究するための高感度で信頼性の高い方法を提供します。

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

本実験の全体的な目的は、進行する肝炎症疾患における白血球の遊走と相互作用を追跡することです。これにより、これらの細胞が肝組織に動員されるメカニズムの根底にある一連の出来事と、免疫病理への潜在的な関与についてより深く理解することを目指します。この目的を達成するため、まず気管切開を行い、マウスの呼吸管理を可能にします。これは、動物の長期生存を確保するために極めて重要なステップです。第2ステップとして、マウスに開腹術を施して肝臓を外科的に露出し、マルチフォトンスコープで臓器へのアクセスを可能にします。次に、動きによるアーチファクトを最小限に抑えるため、肝臓をローズに埋め込んで固定および配置します。数時間にわたってイメージングを行うことで、個々の白血球のリクルート、配置、および相互作用の変化を追跡する高解像度のタイムラプスシーケンスを取得できます。肝炎症の発症過程において、本手法は、白血球の動員、細胞間相互作用、あるいは免疫病理学的メカニズムなど、急性および慢性肝炎症の分野における重要な疑問の解明に寄与します。従来の顕微鏡法と比較した本手法の主な利点は、マルチフォーカル顕微鏡を用いることで、低レベルの光退色や光毒性でサンプルへの摂動をほとんど伴わずに長期的なイメージングが可能であること、および遠赤色レーザー光の独自の物理的特性により、組織深部まで最大100 µmの光学切片を取得できることです。したがって、本手法は肝疾患に関する知見を提供することができます。この手法は他のシステムにも容易に適用可能です。組織の安定化および固定方法により、実質的にあらゆる生体内顕微鏡観察の課題に適用できるため、流動的な関連細胞を用いて、脾臓や腎臓、さらには皮下腫瘍などの臓器を容易にイメージングできます。また、すべての白血球サブセットを可視化し、それらの相互作用や肝炎症を観察することも可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、小動物外科手術の極めて高い複雑さから苦労されることでしょう。しかし、我々の経験からすれば、これは数週間の限定的な要因に過ぎず、実技によるルーチンワークを重ねることで克服できます。肝組織は非常に脆弱であるため、準備段階の習得は困難であり、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。麻酔処置を行った後、マウス用ステージに3%arosを、40度の角度から注いで満たしてください。次に、手術部位および必要な器具などを十分に消毒します。その後、麻酔剤カクテルを腹腔内投与してマウスを麻酔します。5分後、動物の反射を確認し、皮膚を消毒して眼科用軟膏を眼に塗布します。次に、マウスを処置台に固定します。テープを用いて、頸部を緩やかに伸展させ、腹側が露出するように配置します。切歯にゴムバンドを掛けることで、この固定を行うことができます。次に、顎の下に0.5から1 cmほどの長さの初回切開を行います。続いて、唾液腺の間の結合組織を慎重に剥離し、気管を囲む筋肉の管を探します。筋肉を優しく裂いて、気管を露出させます。気管の下に糸を通し、次にマイクロ剪刀を用いて、切開線にT字型の切開を加えて気管を開きます。換気チューブを約0.5 cm挿入します。小型の解剖学的ピンセットを使用してチューブを進めます。次に、チューブを縫合糸で固定します。さらに固定を確実にするため、チューブを皮膚に縫い付け、シアノアクリレートを用いて皮膚の切開部を封鎖し、チューブを動物の頭部に固定します。粘着テープを使用し、2% iso fluorineを連続的に流して麻酔を維持します。マウスの手術準備を整えた後、胸骨の下に小さな皮膚切開を加え、そこから肋骨の下の両側に向かって横方向に切開を広げます。この過程で、露出したすべての血管を電気焼灼します。出血を最小限に抑えるため、腹腔に到達する際は、正中線上の肘の部分で最初に小さな切開を行ってください。切開を水平方向に広げ、すべての血管を封鎖して肝臓に到達できるようにします。次に、マウスをアグロステージに移動させ、動物を固定するために左右にスライドグラスを積み重ねます。この積み重ねたスライドの高さはマウスの高さに合わせ、後で設置する肝臓用ステージが腹部に過度な圧力をかけないようにしてください。次に、胸骨に縫合糸を用いて肋骨を牽引します。4-0の縫合糸で十分です。肋骨を牽引した後、肝臓と横隔膜をつなぐ靭帯を切断します。大動脈まで完全に切断しますが、血管を破裂させたり切断したりしないよう細心の注意を払ってください。また、肝臓と胃腸管をつなぐ靭帯も切断します。マウスを45度回転させ、より大きな肝葉へのアクセスを改善します。標準的なカバーガラスを用意し、端が鋭利にならないよう縁に沿ってテープを貼ります。それを腹腔の上に置きます。これは、肝臓をステージ上に配置するための土台として機能します。ダブルボールスタイラスプローブまたはパッド付きスパチュラを肝臓の下に慎重に滑り込ませ、臓器の上部を保持します。濡れたティッシュを使用しても、機械的な圧力が加わると即座に肝組織に損傷を与えるため、臓器の取り扱いには細心の注意を払うことが不可欠です。次に、葉をスライド上に持ち上げ、軽く引っ張って位置を調整します。葉は通常、曲がったり折れ曲がったりした状態になるため、細いスパチュラまたは湿らせたティッシュで組織を持ち上げ、端をそっと広げてください。続いて、カバーガラスやスライドを用いて側面にサポートを配置します。カバーガラスを積み重ねて、肝葉と同じ高さにします。肝臓のステージングと固定は、本プロトコルにおいて最も重要な工程です。機械的なストレス、ねじれ、または圧迫が加わると、即座に組織損傷が生じるか、少なくとも類洞血管内の血流が損なわれます。次に、端にテープを貼った大きなカバーガラスを、側方支持体で固定された肝葉の上に被せます。このカバーガラスができるだけ水平になるように配置してください。肝臓を圧迫しないように注意してください。イメージングを迅速に行わない限り、組織が白くなっていることは血流の障害を示しています。これから、長期的な麻酔の維持およびG fiveの投与を行うために、2本の独立した腹腔内カテーテルを挿入する必要があります。これらは27ゲージの針と柔軟なシリコーンチューブを用いて組み立てられます。その後、シリンジポンプを用いて注入を開始します。カテーテルを後肢に近い下腹部に挿入してください。マウスにバイタルモニターを装着した後、1 XPBSで3% arosを100 milliliters調製します。Arosが41 °Cまで冷却されたら、18ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用いて、肝臓をArosに埋め込みます。Arosの冷却が完了したら、Heidemanスパチュラを使用して余分な部分を取り除き、肝臓をスキャンするのに十分な広さの視野を確保します。その後、スキャンを開始してください。視野を準備した後、マウスを顕微鏡下に移動させ、タイムラプスイメージングに適したスキャン領域を選択します。外部白色光源を用いて肝組織を目視でスキャンし、血流が十分でサンプルへの擾乱が最小限である代表的な領域を特定します。実験として、CXCR6 GFPヘテロ接合体マウスを用いて生体 intravital T-P-L-S-M イメージングを行いました。一部のマウスには、急性肝損傷を誘発するために四塩化炭素を腹腔内投与しました。GFPを発現しているModal細胞をビデオで追跡し、その軌跡を重ね合わせることで細胞移動の全体像を得た。その後、これらの軌跡を正規化した。正常な肝臓では、細胞はランダムな移動パターンを示した。CCI fourを注入した肝臓では、細胞遊走の障害が認められました。起点からの総変位量を測定したところ、CCI four処理から36時間後、肝細胞損傷部位において細胞のトラッピングが生じていることが明らかになりました。肝損傷による遊走能の低下は、個々の細胞の遊走速度を時間経過とともにプロットすることでも示すことができ、18時間後に部分的な停止、36時間後に完全な遊走停止が認められました。細胞集団として比較した際にも、遊走細胞の速度低下に統計的な有意差があることが示されました。したがって、この手法は進行中の肝疾患における細胞の遊走および配置の変化を追跡するのに適しています。このビデオを視聴することで、生体内多光子顕微鏡観察に向けたマウス肝臓の調製方法について十分に理解できるはずです。本手法では、緩やかな固定法を用いることで、動物を長期生存させるための安定化と、体動によるアーティファクトの最小化を同時に実現しています。習熟すれば、この手法は適切に実施して約1時間で完了させることができます。この処置の間、動物の体温、心拍数、酸素およびCO2レベルなどのバイタルパラメータを制御することが重要です。これは、本手法に従って麻酔の深さと呼吸を調整することで達成されます。浸潤した免疫細胞の表現型や、発生後に組織または浸潤細胞から分泌されるメディエーターなど、追加の疑問を解決するために、フローサイトメトリー解析やレーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどの他の手順を実施することができます。これらの手法により、研究者は肝臓における白血球の移動や細胞間相互作用のダイナミクスに関する知見を得ることができ、炎症性肝疾患に至る一連のイベントを詳細に解析することが可能になりました。マルチフォト顕微鏡に使用される高エネルギーパルス赤外線レーザーでイメージングを行う際は、レーザー安全ガイドラインに従ってください。本実験の実施中は、レーザー放射の反射によって目や皮膚に危険が及ばないように注意してください。

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。...

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

この記事では、画像取得と分析のための特定の方法論と組み合わせて、生体内顕微鏡イメージングを使用して、マウスの肝臓血管系の個々の血管内の血流速度の動的測定と定量化の詳細な方法について報告します。...

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。...

共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。...

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

この実験では、マウスを血管を染色できるローダミンBイソチオシアネート-デキストランで尾静脈に注射します。肝臓が露出して固定された後、肝臓の特定の部分を選択して、多光子顕微鏡を用いて生体内の深部組織を観察することができる。...

マウス肝組織における血管の多光顕微鏡観察

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

ここでは、関心のある組織/器官および皮膚に直接接着することができる光学的に透明なシリコーン窓を使用して、長期の生体内イメージングのためのアプローチを提示する。これらの窓は、現在現場で使用されている他の窓よりも安価で汎用性が高く、外科的挿入は動物に限られた炎症および苦痛を引き起こす。...

透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング

ここでは、マウスの眼の前房に生着した肝スフェロイドの非侵襲的な in vivo イメージングを可能にするプラットフォームについて説明します。ワークフローは、初代肝細胞からのスフェロイドの生成から、マウスの眼への移植、共焦点顕微鏡による細胞分解能での in vivo イメージングまで多岐にわたります。...

マウス眼の前房に移植された肝スフェロイドのin vivoイメージング

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。...

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

本プロトコルは、肝臓の完全な肝組織における星状細胞の形態を可視化・モデル化するための包括的な画像パイプラインを提供します。このアプローチは、マウス遺伝学を用いた線維芽細胞の蛍光標識、in situ 肝灌流ベースの組織調製、そして光学的透明性を得るための修正iDISCO組織クリアリング法を組み合わせています。...

肝線維症マウスモデルにおける肝星状細胞形態のマッピング

学ぶ肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング法。CXCR6.Gfpレポーターマウスを用いて、白血球の動態と相互作用を高解像度で観察し、肝炎症における免疫細胞の動員メカニズムを解明する。

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

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