髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in vitroでの胸腺髄質上皮細胞の研究は大部分が成功していません。本明細書に記載の3D培養システム(改変皮膚器官型培養モデル)は、mTECの増殖、分化、および無差別遺伝子発現の維持の再現において優れていることが証明されています。

この手順の全体的な目標は、胸腺細胞、髄質細胞、上皮細胞、またはmtechを三次元器官型培養またはOTCシステムで培養することです。これは、最初に繊維質の足場材料を12ウェルフィルターインサートに配置し、続いてヒト皮膚線維芽細胞を含む新たに調製したフィブリンゲルを層状にすることによって達成されます。4〜5日間の予備培養の後、MTSは足場に座り、水中培養条件下で培養されます。

最終的には、免疫組織化学、RNA単離、および事実を共培養で実施し、CED Mtechの発達を評価することができます。既存の2D培養システムと比較した場合の3D Organotypic co-cultureシステムの主な利点は、mtechの分化、増殖、および無差別遺伝子発現の維持の再現性においてはるかに優れていることです。今日、この技術を実証するのは、私たちの共同研究ラボの技術者であるアイリス・マーティンです。

ヒトの真皮線維芽細胞が流暢になったら、厚さ0.4〜0.6ミリメートルのビスコ不織布繊維材料を沸騰させ、乾燥させ、アイロンをかけて、足場繊維を準備します。金属製の穴あけパンチを使用して、それらを11ミリメートルの円に切ります。切断した繊維質材料を2つのスライドの間に置き、スライドをホイルで包み、オートクレーブします。

滅菌したら、インサートを滅菌済みの12ウェルプレートのウェルに入れ、次に各足場を対応するインサートに入れます。次に、100マイクロリットルのウシ胎児血清中の第5線維芽細胞の10倍を、足場当たり100マイクロリットルの新たに希釈したトロンビンに2.7倍混合する。トロンビン線維芽細胞混合物を各足場に分注し、続いて200マイクロリットルの新たに希釈したフィブリノーゲンを分注します。.

次に、各ウェル内で細胞混合物を混合し、穏やかにピペッティングしながら溶液を足場全体に均等に分配します。この画像は、培養の1日目と4日目のフィブリンゲルによるヒト真皮線維芽細胞の成長を示しています。足場のないコントロールウェルにテストゲルを調製し、この時点での血栓の時間と形成を追跡します。

ピペットの先端を使用して、または線維芽細胞の後にプレートを反転させることにより、凝固した臓器培養物を培地に浸し、ソルビン酸とTGFベータ1を4〜5日間補充して、mtech播種の日に、この培地をタンパク質のミリリットルあたり500単位を含むRFAD培地と交換して、早熟な線維素溶解を予防します。7〜8時間後、100マイクロリットルのRFADに懸濁した5番目のMT Eに2.5倍の10を各足場の上部に播種し、共培養物を24時間インキュベートします。翌日、培地をプロイン1ミリリットルあたり250単位を含む新鮮な培地と交換し、さらに4〜7日間の培養を行います。

培養終了時の免疫組織化学によってm Texsの発達を評価するには、一対の鉗子を使用して、足場真皮当物をそれぞれのフィルターから分離します。OTCをOCTコンパウンドにしっかりと挿入し、埋め込みます。OTCを液体窒素上で気相で凍結し、O-T-C-R-N-Aを分離します。

足場組織をフィルターから分離した後、メスを使用してOTCを断片に切断し、1ミリリットルの変性溶液を含む2ミリリットルのRNAフリーチューブに移します。高速準備装置を使用して、OTCを6.0の速度で2回、毎回30秒間機械的に細断し、各細断の間に氷上で2分間の休息時間を設けます。次に、製造元に記載されている酸グアドジウムチオシアン酸フェニルクロロホルム抽出を使用してRNAを単離します。

フローサイトメトリーでOTCを解析するには、メンブレンを取り外し、足場をフィブリン線維芽細胞mtechゲルから分離します。そして最後に、先ほど示したようにメスでゲルをカットします。ティッシュをファックスチューブに移します。

コラゲナーゼディスペーストの2ミリリットルを続けます。次に、チューブを摂氏37度に置き、磁気攪拌しながら20分間水浴に入れます。攪拌は、組織が完全に消化されたときに5分ごとにピペットをバイパスします。

得られた細胞懸濁液を70μmのストレーナーでろ過し、図示のように適切な抗体を用いて細胞を染色します。MTSはケラチン14の発現によって識別できるため、マントン陽性の線維芽細胞と容易に区別できます。興味深いことに、未成熟のM Texと成熟したM Texは、培養において異なるが再現性の高い成長パターンを示します。

例えば、未熟な CD 80 D low M Texs は、通常、線維芽細胞と密接に接触して二重層を形成します。CD 80 Dの高MTSは、線維芽細胞で区切られたコンパクトな細胞凝集体を形成する傾向がありますが、mtechサブセットは、EDUの組み込みによって証明されるように、実証された3D OTC条件下で生き残るだけでなく増殖します。興味深いことに、CD 80の低MT技術は、ranklの存在下でより高い速度で増殖します。

CD 80の高MT技術者には逆のことが言えますが、このビデオを見た後、MTの培養方法をよく理解しているはずです。3D OTCを使用する技術者。これは、技術の差別化やPGEの維持と誘導の点で、2D培養システムを使用するよりもはるかに優れた方法であり、いくつかのテイクパラメータを研究または操作できる可能性があります。