ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

この手順の全体的な目標は、1型および3型のインターフェロンサブタイプなど、相同性の高い遺伝子群のハイスループット分析のために、384ウェルアッセイプレートを調製し、実行することです。これは、まずアッセイプレートの実行に使用する標準的な段階希釈液を調製することによって達成されます。次に、プライマープローブとテンプレート制御なしのワーキングストックミックスを調製します。

次に、384ウェルアッセイプレートを自動マルチチャンネルピペッターで調製し、乾燥させて保存します。最後に、384ウェルアッセイプレートを泳動し、分析します。最終的に、ハイスループットの定量的リアルタイムRT PCR Rアッセイは、組織培養モデルにおけるインターフェロン発現シグネチャーを定義するために使用され、病原体や感染症や自己炎症性疾患の臨床サンプルを研究するために使用されます。

この技術の主な利点は、標準的な線形プローブまたはcyberg greenを使用した定量的R two PCRのような既存の方法よりも、分子ビーコンおよびロック核酸蛍光プローブを使用して、高度に類似した配列間の単一塩基対の違いを識別できることである。51マイクロリットルのS-S-D-N-Aを20.3ミリリットルの水と混合することにより、17の標準希釈セット用のSSDNA水混合物を準備します。190マイクロリットルのSS DNA水混合物を8チューブPCRストリップの最初のチューブに、180マイクロリットルを次の5本のチューブに分注します。

50 Picomolar 標準ストックから 10 マイクロリットルを 190 マイクロリットルの S-S-D-N-A 水混合ボルテックスでチューブに移し、迅速に遠心分離することにより、1 〜 20 希釈を行います。PCRストリップは、直近に希釈したチューブから直列ボルテックスの次のチューブに20マイクロリットルを移すことにより、1〜10希釈を行い、PCRストリップを迅速に遠心分離します。シリーズの最後のチューブが標準を受け取るまで、1〜10希釈を繰り返します。

最大17本の2ミリリットルチューブをラベリングした後、12.5マイクロリットルの電子マルチチャンネルピペットを使用して、テキストプロトコルに従って調製されたプライマーとプローブを使用して、各チューブに2マイクロリットルのS-S-D-N-Aを追加します。適切なフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブを各プライマーに加えます。プローブセットワーキングストックチューブは、テンプレートなしコントロールまたはNTCワーキングストックミックスを準備します。

この表に従って、各プライマープローブセットの14.3マイクロリットルを適切なNTCワーキングストックミックスチューブに移します。NTCワーキングストックに必要なプライマープローブセットのEloquaを取り外した後、1.5ミリリットルの水で混合して、各プライマープローブセットワーキングストックチューブの最終容量を1.7ミリリットルにします。プライマープローブセットとNTCミックスの96ウェルソースプレートを調製します。

新しい96ウェルプレートを冷却した96ウェル冷却ブロックに置き、250マイクロリットルの電子マルチチャンネルピペットを使用して、正しいプライマープローブセットまたはNTCミックスでウェルを指定します。すべてのプライマープローブセットに66マイクロリットルの水を追加します。井戸は、4つのターゲット17の井戸に82.5マイクロリットルの水を分配します。

すべての抗C混合物に27.5マイクロリットルの水を分注します。次に、作業ストックにある54マイクロリットルの正しいプライマープローブを、ウェルディスペンスで指定されたプライマープローブに追加します。ターゲット17プライマープローブワーキングセットストックの67.5マイクロリットルは、ウェルで指定されたターゲット17プライマープローブにストックされています。

22.5マイクロリットルの正しいNTCワーキングストックミックスを指定されたウェルに追加します。次に、粘着プレートシールを使用して96ウェルプレートをシールし、700Gで1分間遠心分離して、内容物が96ウェルアダプターでウェルの底にあることを確認します。プレートをボルテックスミキサーに置き、1000 RPで1分間混合します。

次に、プレートを700Gで5分間遠心分離します。384ウェルアッセイプレートを準備するには、自動マルチチャンネルピペッターのスイッチを入れ、ソフトウェアアイコンをダブルクリックして、プラットフォームをセットアップするためのインターフェロンアッセイプレートを作成するためのプロトコルを開きます。完全にフルになったピペットチップボックスをプラットフォームポジション1に、96ウェルソースプレートをポジション4に、新しい384ウェルプレートをポジション6に置きます。

実行が完了したら、再生ボタンを押して実行を開始します。384ウェルアッセイプレートを平らな面に軽くたたいて、液体がウェルの底にあることを確認し、プレートを700 Gで1分間回転させた後、接着プレートシールを貼り付けます。粘着プレートシールをはがします。

384ウェルアッセイプレートをプレートドライヤーにセットし、384ウェルマニホールドをウェルの真上に配置します。384ウェルアッセイプレートの内容物が乾燥したら。新しい粘着プレートシールを貼り、迅速なホイルラベルを貼り、アッセイプレートをロードして実行するために使用するまで、摂氏4度の暗闇で保管します。

2マイクロリットルのS-S-D-N-Aを84.9マイクロリットルの水に希釈することにより、2つのハウスキーピング遺伝子またはHKGウェルミックスを準備します。次に、希釈したSSD NA 11.8マイクロリットルの水、マスターミックスの23マイクロリットル、および正しい20XHKGプライマープローブセットの9.2マイクロリットルを各ラベル付きHKGチューブに追加し、ボルテックスし、サンプルとポジティブコントロールCDNAを78.8マイクロリットルのマスターミックスと54.8マイクロリットルの水で各24マイクロリットルのサンプルとポジティブコントロールチューブに調製した後、簡単に遠心分離します。乾燥した384ウェルアッセイプレートに添加する標準液とNTCウェルミックスを調製するには、1.5ミリリットルのチューブに165マイクロリットルの水と275マイクロリットルのマスターミックスを加え、NTCウェルミックスには1.5ミリリットルのチューブに52.5マイクロリットルの水、52.5マイクロリットルのマスターミックスを1.5ミリリットルのチューブに

あらかじめ調製した乾燥させた384ウェルアッセイプレートを摂氏4度から取り出し、700 GSで1分間遠心分離します。30マイクロリットルの電子マルチチャンネルピペットで、7.5マイクロリットルのNTCを分注します。各NTCによく混ぜます。

各標準に標準と標準1.5マイクロリットルのよく混合の6マイクロリットルを分配します。次に、12.5マイクロリットルの電子マルチチャンネルピペットを使用して、7.5マイクロリットルのサンプルを指定されたウェルに分注します。HKGのプライマーの調査の2.5マイクロリットルを分注し、1分間の渦で700 Gsの版を密封し、1分間の渦で密封された384の井戸の版を渦で密封する384の井戸の版を密封した後、指定の井戸に混合物を分配し、5分間のための700のチーズで遠心分離する。

最後に、密封されたアッセイプレートをQ-R-T-P-C-R装置に入れます。アッセイレイアウトのテンプレートを開き、以下の反応条件を使用します。この図に見られるように、実行を開始し、データをエクスポートし、テキストプロトコルに従ってデータを分析すると、ヒトタイプ1および3のインターフェロン発現シグネチャーは、Toll様受容体リガンドで刺激された6人のドナーからの末梢血単核細胞またはp BMCで分析されました。

データは、ハウスキーピング遺伝子に正規化された絶対CQ値と全RNAのマイクログラムあたりのテンプレートのコピー数を含む2つの分析方法を使用して、対数スケールのレーダーチャートとして表示されます。このデータは、TLRアゴニストによって誘発されるヒトインターフェロン発現シグネチャーが、Resus Maccasにおけるタイプ1および3インターフェロンのリガンド特異的発現シグネチャーであることを示しています。この実験ではTLRリガンドにも特異的であり、3人のドナーからのPBMCを3つのリガンドで3時間刺激した。

ベースラインでの非刺激細胞におけるインターフェロンサブタイプの発現は、ここに示すように低かった。限られた数のインターフェロンαサブタイプがLPSおよびポリICに応答して発現されました。対照的に、イミキモドに応答したインターフェロンの発現は高く、サブタイプの発現はインターフェロンベータとインターフェロンの広範囲発現でした。.

ラムダ1は、3つのTLRアゴニストすべてによって強化されました このビデオを見た後、タイプ1および3インターフェロンサブタイプのような非常に類似した遺伝子グループのハイスループット分析のための4つのウェルアッセイプレートを調製、実行、およびanalyze. 3Dする方法を十分に理解しているはずです。