タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

このビデオでは、タイムラプスイメージングを用いて、ステレオ顕微鏡上で組織修復のダイナミクスを捉える方法を実演します。まず、尾鰭が切断操作を容易に実施できる大きさまで十分に発達した幼生期までゼブラフィッシュ胚を育成します。これは通常、孵化後に行われます。

第2ステップは、注射針を用いて尾鰭を切断することです。第3ステップは、幼魚をイメージングチャンバーに固定し、実体顕微鏡でタイムラプス動画を撮影することです。最終ステップは、Bit Plains Sなどの画像解析ソフトウェアやオープンソースソフトウェアのImage Jを利用して、尾鰭の再生を定量化することです。私の研究室では、ゼブラフィッシュをモデルとして創傷治癒と組織再生の研究を行っています。

本日は、明視野ステレオ顕微鏡を用いて、これらのプロセスのダイナミクスをリアルタイムで捉える手法を実演します。ゼブラフィッシュ幼魚の尾鰭を用いて、組織再生の初期プロセスを捉える手法をご紹介します。提示するイメージング手法により、シンプルな顕微鏡設定で組織全体のスケールの挙動を観察・分析することが可能となり、タイムラプス機能を備えたあらゆるステレオ顕微鏡に容易に適用できます。

それでは始めていきましょう。ゼブラフィッシュを幼魚期まで育成します。尾鰭の創傷治癒は、孵化後の段階で観察するのが最適です。この時期には尾鰭が十分に発達しており、脊髄やその他の組織を損傷させることなく容易に切断処置が行えるためです。

卵を近接した状態で回収し、28 °Cのインキュベーターで一晩培養します。翌朝、死滅した胚を取り除き、0.03% instant ocean aquarium salt solutionを含む胚培地で洗浄します。必要に応じて、幼魚の色素沈着を防ぐため、0.003% pheno thyroidを含む胚培地をディッシュに添加してください。

本デモンストレーションでは、インキュベーター内で受精後2日目まで胚を成長させ、幼生が卵膜から孵化した状態でイメージングチャンバーの準備を行います。このステップでは、イメージングチャンバーを構築するための2つの方法を紹介します。方法1は、ホームセンターなどで入手可能な飲料水グレードのPVCまたはテフロンチューブを用いたイメージングチャンバーの作製です。

カバーガラスを固定するのに適したサイズである、外径 25 millimeter、内径 20 millimeter のチューブを使用します。チューブをできるだけ均等に、厚さ 10 millimeter のリング状に切断します。やすりを用いてエッジを滑らかにし、水とエタノールで洗浄します。

チャンバーを自然乾燥させます。方法2では、既製品のマットテックガラス底・ガラス天蓋イメージングチャンバーを使用するか、小型のペトリ皿からイメージングチャンバーを作成します。自作する場合は、35 mmまたは50 mmのペトリ皿を使用し、蓋に10 mmの穴を開けます。

次に、カバーガラスの外側にシリコングリースを塗布し、25 by 25 mmの正方形または円形のカバーガラスを外側に貼り付けます。この際、クリーンなピペットチップを使用して、封入剤がしっかりと固定されるようにしてください。イメージングの手順において、カバーガラスの内側に微細なプラスチックメッシュを取り付けます。これは、メッシュを内輪の直径に合わせて切り出し、さらにメッシュの中央に幼虫の約3倍の大きさの小さな長方形を切り抜くことで行えます。

損傷前の幼魚のマウントおよびイメージング。この工程は、後の鰭の再生の定量化に適しています。まず、標本を固定するために、胚培地を用いて0.5%の低融点アガロース溶液を調製し、42°Cに保持したアガロース溶液に麻酔済みの幼魚を移します。

ヒーティングブロックを用いて、幼虫をアグロス（agros）の一滴と共に小型ペトリ皿に移し、幼虫を側臥位に固定します。キャップ付きのマイクロローダーチップを使用し、アグロスを凝固させた後、trica溶液を添加します。その後、後ほど使用する実体顕微鏡へと移動します。

タイムラプスイメージングには、デモンストレーションとしてZEISS Discovery V 12実体顕微鏡とAxioVisionソフトウェアを使用します。まず、イメージングに適した対物レンズと倍率を選択し、顕微鏡の設定を調整します。次に、AxioVisionソフトウェアで顕微鏡のカメラ検出モードを選択します。

ライブモードを選択して、画面上で幼虫を確認します。プロパティウィンドウを開き、輝度を自動検出させるか、顕微鏡の透過照明ベースでコントラストを手動で調整します。幼虫を視野外に移動させ、「シェーディング補正」機能を選択します。

バックグラウンドノイズを最小限に抑えるため、幼虫を再び視野内に配置し、スナップショットを撮影します。損傷処理の準備として、この画像を保存してください。まず頭部からアロスを掻き出し、幼虫をアロスから取り除きます。

これにより、頭部を残ったアガロースからそっと引き離すことで、幼魚をアガロースから滑り出させることが可能になります。インスタントオーシャン塩類溶液を用いて1.5%アガロースプレートを調製します。実体顕微鏡下で、幼魚を凝固したアガロースの上に横向きに置き、23ゲージの注射針で尾鰭の遠位部を切断します。

タイムラプスイメージングのための幼虫の固定。ここでは2つのタイムラプスイメージング法を紹介します。まず1つ目の方法として、幼虫を固定した後のチャンバーリング内でのイメージング方法について説明します。

キャップ付きのマイクロローダーピペットチップを用いて、遠位尾鰭の周囲に固まったアグロスを慎重に掻き取ります。これにより、適切な創傷治癒または組織再生が可能になります。組織を固定せずに操作し、鰭を繰り返し傷つけないように注意してください。この操作の間に、溶液を交換して、イメージング手順の妨げとなる不要な残渣をチャンバーから除去します。

新しいTrica溶液を用いて、チャンバーの上部にシリコングリスを塗布し、チャンバーリングを新しいTrica溶液で満たします。その上にガラススライドを載せてチャンバーを密閉します（方法2）。この方法では、ガラス蓋付きペトリ皿を用いて幼虫をイメージングする方法について説明します。

幼虫を蓋の上に固定し、カバーガラスで覆い、蓋の中をトリカ溶液で満たします。その後、尾鰭からアグロスを掻き取ります。

次に、ボトムチャンバーの上端にシリコングリスを塗布し、チャンバーにTrica溶液を満たします。蓋からTrica溶液を注意深く捨て、蓋を反転させて幼虫をボトムチャンバーのTrica溶液に浸します。この操作はわずかに傾けて行うことができます。気泡の混入を防ぐため、シリコングリスでチャンバーを密閉し、タイムラプスイメージングにより28 °Cの適切な温度が維持されていることを確認します。

断熱材として段ボールと気泡緩衝材を用い、熱源として鶏卵の孵化に使用される有線ドームを備えた加熱インキュベーションチャンバーを組み立てます。顕微鏡の周囲にインキュベーションチャンバーを配置し、温度を28 degrees Celsiusに調整します。約10～20分間、または温度が安定するまで、加熱インキュベーションチャンバーの前方を開き、イメージングチャンバーを顕微鏡に設置します。

カバーガラスが対物レンズに向かって上を向くように設置します。イメージング工程を通じて鰭の成長と再生を確実に捉えられるよう、視野の3分の2が空いた状態で幼魚の鰭を配置してください。ソフトウェアの60多次元取得ウィンドウで幼魚を再配置することなく、ZackタブのZスタックおよびタイムラプスオプションとスライスモードを選択します。

スライス厚を選択し、次にスタートストップモードを選択します。タイムラプス表でスタックの上限位置と下限位置を定義します。動画の間隔と期間を選択し、スタートボタンを押して録画を開始します。

最初の1時間以内に、幼虫のX軸およびZ軸の境界を確認してください。成長やアガロース組成の違いにより幼虫が移動している可能性があるため、必要に応じて時間をかけて位置を調整してください。タイムラプス記録の終了時にファイルを保存し、ポストプロセッシングおよび定量ステップのデータ解析に進んでください。

このセクションでは、method one imasで生成されたデータを分析するいくつかの方法について説明します。まず、imasソフトウェアを用いて鰭（ひれ）の成長を測定する方法について説明します。Amarisソフトウェアでタイムラプス動画を開き、ファイルをMRS形式で保存してください。

ソフトウェアのパフォーマンスを向上させるには、正投影図を選択して動画を投影として表示してください。鰭（ひれ）の長さを測定するには、左上のツールバーにある「新しい測定ポイントを追加」オプションを選択します。「表示統計値リストの設定」で、ラインモードで表示する統計値を選択してください。

Settings（設定）タブで、Labels（ラベル）プロパティのPairs（ペア）を選択し、Name（名前）とDistance（距離）を選択して、測定線の横に点Aと点Bの間の距離を表示させます。次に、Edit（編集）モードに切り替え、Shiftキーを押しながら遠位鰭の第1点を選択します。その後、同じ設定で、no accordの遠位端にある第2点を選択します。距離が画像上に表示され、Statistics（統計）タブからエクスポートすることが可能です。

右下のディスクボタン「export all」を選択してすべてをエクスポートします。また、計測ポイントオプションに代わり、スライスビューアを使用してスライスビューモードで距離を測定することも可能です。目的の位置までスクロールし、1点目と2点目をマウスの左ボタンでクリックすると、距離が表示されます。

しかしながら、このオプションではデータの書き出しができません。次に、オープンソースソフトウェアであるImage Jを用いてフィン面積を決定する方法について簡潔に説明します。Zeiss Axio visionファイル形式を認識するプラグインを使用して、Image Jでタイムラプス動画を開いてください。

あるいは、非圧縮のTIFFシーケンスを読み込みます。これにより、ファイル内に情報が保持されていない場合でも、[analyze] → [set scale] で距離、ピクセル数、および既知の距離を定義し、ファイル情報を保存することができます。また、単位長をmicrometersに設定してください。

ツールバーで、自由選択ツールを選択し、マウスの左ボタンを押し下げたまま傷口の輪郭をなぞります。傷口の縁に沿って描画してください。

「分析（analyze）」の下にある「計測（measure）」オプションをクリックし、創傷面積の代表的な結果を表示します。鰭（ひれ）を切断すると、切断後36時間にわたって部分的な再生が起こります。鰭の面積測定の結果、切断後約14時間までは、おそらく細胞死により鰭組織が減少することが示され、その後、わずかな再生長が見られます。

切断した鰭と再生した鰭を比較すると、36時間以内に鰭の長さが2.48倍に増加したことが分かります。切断は、まず「パースストリング効果（巾着口効果）」を誘発します。これは、切断創から突出した鰭ひだ細胞に存在するアクチン・ミオシンケーブルによる収縮を特徴とし、その後これらの細胞は除去されます。初期段階では体長が増加しますが、鰭は再生しません。

初期段階において、切断後約14時間で、鰭は近位から遠位に向かって成長し始めます。要約すると、我々の結果は、切断が創傷収縮を誘発し、それが細胞の押し出しを促進するために不可欠である可能性を示しています。

プロセスが完了すると、鰭の再生が始まります。これにより、鰭の発達的な成長が起こっていると考えられます。このプロセスとは別に、我々は、生存しているゼブラフィッシュ幼魚を用いて組織修復のダイナミックなプロセスを観察することを可能にする手法を提示しました。

本手順では、結果を最適化するために検証した特定の条件が必要となります。提示したイメージング手法の明確な利点は、CCDカメラとTimeLapseソフトウェアを備えたあらゆる実体顕微鏡に容易に適応できることです。また、より高価な共焦点イメージングシステムに代わる低コストな選択肢となります。

本手法では蛍光や細胞検出は使用していませんが、破砕制御のための自動化システムや、撮影後のデコンボリューションソフトウェアを利用することで、これらのアプリケーションへと拡張し、細胞下解像度で創傷修復および再生プロセスをさらに観察することが可能です。本手法は、組織の修復と再生の基礎となる基本的な生物学的プロセスについて、学生に深い理解を促すことができます。ゼブラフィッシュの胚および幼魚の光学的な透明性と取り扱いの容易さ、そしてあらゆる実体顕微鏡に適合可能なシステムの汎用性により、教室環境での基礎的な脊椎動物生物学の教育に適しています。