タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

このビデオでは、タイムラプスイメージングを使用して実体顕微鏡で組織修復ダイナミクスをキャプチャする方法を示しています。これは、まずゼブラフィッシュの胚を幼生期まで育てることで達成されますが、尾びれが十分に発達して切断が容易に行えるサイズになったときに行われます。これは通常、ハッチング後に達成されます。

2番目のステップは、シリンジ針を使用して尾びれを切断することです。3番目のステップは、幼虫をイメージングチャンバーにマウントし、実体顕微鏡でタイムラプスムービーをキャプチャすることです。最後のステップは、Bit Plains Sなどの画像解析ソフトウェアや、ゼブラフィッシュをモデルとして創傷修復と組織再生を研究するオープンソースソフトウェアの J.Hi.My 画像を使用して、尾びれの再生を定量化することです。

本日は、明視野実体顕微鏡を用いて、これらのプロセスのダイナミクスをリアルタイムに捉える方法をご紹介します。今日は、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれを使用して組織再生の初期プロセスを捉える方法を示します。提示されたイメージング法は、タイムラプス機能を備えた任意の実体顕微鏡に容易に適応できるシンプルな顕微鏡環境で、組織スケール全体の挙動を観察および分析する機会を提供します。

それでは始めましょう。ゼブラフィッシュの飼育 幼生期へ。尾びれの創傷修復は、この時期までに尾びれが十分に発達しているため、孵化段階後に最もよく観察でき、脊髄や他の組織に損傷を与えることなく切断を簡単に行うことができます。

近くで卵を集め、摂氏28度のインキュベーターで一晩孵化させます。翌朝、死んだ胚を取り出し、0.03%インスタントオーシャンアクアリウムソルト溶液を含む胚培地ですすいでください。必要に応じて、0.003%甲状腺フェノを含む胚培地を皿に追加して、幼虫の色素沈着を防ぎます。

このデモンストレーションでは、幼虫がイメージングチャンバーの準備から孵化したインキュベーターで受精後2日まで胚を発育させます。このステップでは、イメージングチャンバーを構築するための2つの方法を提供します。方法1は、飲料水グレードのPVCまたはテフロンチューブで作られたイメージングチャンバーで構成されており、どの金物店でも入手できます。

外径25mm、内径20mmのチューブは、カバースリップアタッチメントに適したサイズであるため、使用してください。チューブをカットして、厚さ10mmのリングをできるだけ均一にします。サンドペーパーを使用してエッジを滑らかにし、水とエタノールですすいでください。

チャンバーを風乾させます。方法2は、事前に製造されたマットテックガラスボトム、ガラストップイメージングチャンバーを利用するか、小さなペトリ皿からイメージングチャンバーを作成することで構成されます。独自のイメージングチャンバーを作成するには、35mmまたは50mmのシャーレを使用し、蓋に10mmの穴を開けます。

次に、カバースリップの外側にシリコングリースを塗布し、25 x 25ミリメートルの正方形または丸いカバースリップをきれいなピペットチップで外側に取り付けて、取り付けアグロスがしっかりと取り付けられたままになるようにします。イメージング手順では、カバースリップの内側に細かいプラスチックメッシュを取り付けます。これは、メッシュを内輪の直径のサイズに切断し、次に幼虫のサイズの約3倍の小さな長方形をメッシュの中央に切断することで実現できます。

損傷前の幼虫の取り付けとイメージング。このステップは、フィン再生の後の定量化に適しています。まず、胚培地に0.5%低溶融アグロ溶液を調製し、麻酔をかけた幼虫を摂氏42度に維持されたアロ溶液に移す標本を固定します。

加熱ブロックで、アグロスを一滴入れた幼虫を小さなシャーレに移し、幼虫を横に置きます。キャップ付きのマイクロローダーチップを使用して、arosを固化させ、トリカ溶液を追加します。後で使用する実体顕微鏡に進みます。

タイムラプスイメージングには、zes discovery V 12実体顕微鏡とAxioビジョンソフトウェアを使用してデモンストレーションを行います。まず、イメージングに適した対物レンズと倍率を選択して、顕微鏡の設定を調整します。次に、alvisソフトウェアの顕微鏡でカメラ検出モードを選択します。

ライブモードを選択して、幼虫を画面に表示します。プロパティウィンドウを開くと、明るさが自動的に検出され、顕微鏡の透過照明ベースでコントラストが手動で調整されます。幼虫を視野の外に移動し、シェーディング補正機能を選択します。

周囲の雑音を最小限に抑えるには、幼虫を視野に戻し、スナップショットを撮ります。画像を保存して傷害に備えます。最初に頭からエアロスをこすり落として、幼虫をアロスから取り除きます。

これにより、幼虫は、残りのエアロス切断アッセイから頭をそっと引き離すことで、エアロから滑り落ちることができます。インスタントオーシャンソルト溶液を使用して1.5%エアロスプレートを準備します。実体顕微鏡下で、幼虫を固化したアロスに横向きに置き、23ゲージの注射針で尾びれの遠位部分を切断します。

タイムラプスイメージング用の幼虫の取り付け。今回は、2つのタイムラプスイメージング手法をご紹介します。最初の方法では、幼虫の取り付け後にチャンバーリング内の幼虫を画像化する方法を示します。

遠位尾フィンを囲む固化したアグロスを、キャップ付きのマイクロローダーピペットチップで慎重にこすり落とします。これにより、適切な創傷治癒または組織再生が可能になります組織を拘束することなく、ヒレを繰り返し傷つけないようにしてください。この手順では、古い溶液を交換して、イメージング手順を妨げる不要な破片をチャンバーから取り除きます。

新しいトリカ溶液を使用して、チャンバーの上部にシリコングリースを塗布し、チャンバーリングに新しいトリカ溶液を充填します。上部にスライドガラスを貼って、チャンバー方式2をシールします。この方法では、ガラスの上のペトリ皿で幼虫を画像化する方法を示します。

幼虫を蓋に取り付け、スリップを覆い、蓋を埋めます。トリカ溶液付き。テールフィンからアグロスをこすり落とします。

次に、下部チャンバーの上部縁にシリコングリースを塗布し、チャンバーにトリカ溶液を充填します。蓋からトリカ溶液を慎重にデカントし、蓋を裏返して、わずかな角度で行うことができる下部チャンバーのトリカ溶液に幼虫を浸します。エアポケットを避けるために、チャンバーはシリコングリースタイムラプスイメージングで密閉され、摂氏28度の適切な温度が維持されるようにします。

断熱材として段ボールのプチプチで作られた加熱インキュベーションチャンバーと、熱源として鶏卵のインキュベーションに使用されるワイヤードドームを組み立てます。インキュベーションチャンバーを顕微鏡の周囲に置き、温度を摂氏28度に調整します。約10〜20分、または温度が安定するまで、加熱したインキュベーションチャンバーの前面を開き、イメージングチャンバーを顕微鏡の上に置きます。

カバースリップを対物レンズに向けて上を向いて立ちます。視野の3分の2が空いたままになるように幼虫のヒレを配置して、イメージング手順の過程でヒレの成長と再生を確実に捉えます。ソフトウェアの60多次元取得ウィンドウで幼虫の位置を変更することなく、ZackタブとスライスモードでZスタックとタイムラプスオプションを選択します。

スライスの厚さを選択し、次に開始停止モードを選択します。タイムラプステーブル内のスタックの上限と下部の位置を定義します。ムービーの間隔と時間を選択し、スタートボタンを押して録画を開始します。

最初の1時間以内に、幼虫の境界とザックの境界を確認します。必要に応じて、幼虫の成長やアグロス組成の違いにより幼虫が移動した可能性があるため、時間の経過とともに幼虫の位置を変えます。タイムラプス録画の最後にファイルを保存し、後処理と定量ステップのデータ解析を進めます。

このセクションでは、データ生成方法1 imasを分析するいくつかの方法について説明します。まず、imasソフトウェアを使用してフィンの成長を決定する方法について説明します。Amarisソフトウェアでタイムラプスムービーを開き、ファイルをMRSファイル形式で保存します。

ソフトウェアのパフォーマンスを向上させるには、直交ビューを選択して、ムービーを投影として表示します。フィンの長さを測定するには、左上のツールバーで[新しい測定ポイントを追加]オプションを選択します。[表示統計値のリストの設定] で、ライン モードで表示する統計値を選択します。

設定タブで、ラベルプロパティでペアを選択し、名前と距離を選択して測定線の隣に点AとBの間の距離を表示し、編集モードに切り替えてシフトボタンを押し続け、遠位フィンの最初の点を選択します。次に、同じ構成を使用して、ノーアコードの遠位端にある 2 番目のポイントを選択します。距離は画像に表示され、[統計]タブでエクスポートできます。

ディスクボタンを選択すると、右下にあるすべてエクスポートできます。測定ポイントオプションの代わりに、スライスビューアを使用してスライスビューモードで距離を測定できます。目的の位置までスクロールし、マウスの左ボタンで1番目と2番目の位置をクリックすると、距離が表示されます。

ただし、このオプションではデータのエクスポートは許可されません。次に、オープンソースソフトウェアを使用してフィンエリアを決定する方法について簡単に説明します。画像J.画像Jで、Zeiss Axioのビジョンファイル形式を認識するプラグインを使用して、TimeLapse動画を開きます。

または、非圧縮の TIFF シーケンスでロードします。これにより、ファイル情報が analyze select set scale の下に保存され、距離とピクセル、および既知の距離 (ファイルに保持されていない場合) が定義されます。また、単位の長さをマイクロメートルに設定します。

ツールバーで。フリーハンド選択ツールを選択し、マウスの左ボタンを押したままにして傷の輪郭を描きます。傷口に沿って描きながら。

analyze の下の measure オプションをクリックして、創傷の代表的な結果の領域を表示します。フィンの切断は、切断後36時間にわたって部分的な再生につながります。ヒレの面積測定は、ヒレの切断が切断後約14時間までヒレ組織の減少を引き起こすことを示しており、これはおそらく細胞死によるもので、その後に細い再生長が続きます。

切断されたヒレと再生されたヒレを比較すると、36時間以内にヒレの長さが2.48倍に増加していることがわかります。切断は、最初に、切断創から押し出されたフィンフォールドセルに存在するアクチンミオシンケーブルを介した収縮を特徴とする巾着効果を引き起こし、その後クリアされます。最初は体長が長くなりますが、ヒレは再生しません。

初期段階で。切断後約14時間で、ヒレは近位から遠位の位置に成長し始めます。要約すると、私たちの結果は、切断が創傷収縮を引き起こし、細胞の押し出しを促進するために不可欠である可能性があることを示しています。

プロセスが完了すると、フィンの再生が始まります。発達ヒレの成長が起こっているようです。このプロセスとは無関係に、生きたゼブラフィッシュの幼生を用いて組織修復のダイナミックな過程を観察できる方法を提示しました。

この手順では、結果を最適化するためにテストした特定の側面が必要です。提示されたイメージング方法の明らかな利点は、CCDカメラとTimeLapseソフトウェアを装備した任意の実体顕微鏡に容易に適応できることです。また、より高価な共焦点イメージングシステムに代わる低コストの代替品を提供します。

この方法は蛍光や細胞検出を使用しませんが、シャッター制御の自動化システムとイメージング後のデコンボリューションソフトウェアを利用して、創傷の修復と再生のプロセスを細胞内分解能でさらに観察することで、そのようなアプリケーションに拡張できます。この方法により、学生は基本的な生物学的プロセス、基礎となる組織の修復と再生について理解を深めることができます。光学的な透明度と、胚性および幼生のゼブラフィッシュの使用の容易さ、およびあらゆる実体顕微鏡へのシステムの適応性により、教室で基本的な椎骨生物学を教えるのに適しています。