Name: 細胞内カルシウムの二光子イメージング 2+取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ二光子顕微鏡を用いたラット大動脈内皮細胞および平滑筋細胞における細胞内カルシウムと一酸化窒素の定量法。この手法は血管細胞シグナル伝達の高解像度イメージングを可能にする。

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我々は、イメージング研究のヘルプは博士ウィリアムCashdollar、およびウィスコンシン州の血液研究所のノースウェスタン·ミューチュアル財団イメージングセンターに感謝します。また、この原稿で、有用な議論の重要な読書のための博士ダリアIlatovskayaに感謝します。本研究は、（AS）に健康補助金HL108880と（AMG）はDP2-OD008396の国立研究所によってサポートされていました。

以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に応じてありました。 ラット大動脈の1の単離<ol><li>イソフルラン（5％誘導、1.5から2.5パーセントのメンテナンス）または別のIACUC承認の方法でラットを麻酔。 </li><li>仰臥位でラットを配置します。腹部の臓器を露出させるために、皮膚と皮下組織を通って腹部の小さな腹側正中切開を行います。ガーゼパッドを使用して、穏やかに、図1に示すように、大動脈と大静脈を露出するために腸を偏向させます。 </li><li>簡単に言えば、結合組織からと大静脈から大動脈を解剖鈍いです。縫合糸を使用して、腎臓にできるだけ近い大動脈を縛ります。大動脈2センチ、15ミリリットルの円錐TUに配置 - 約1を分析氷の上で：;（140のNaCl、1.2のMgCl 2、2のCaCl 2、4.5のKCl、6グルコース、10 mMのHEPESでPSS）は、通常の生理食塩液を含むこと。 </li><li>大動脈が分離されると、承認されたIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させる。3 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、先の細いピンセット、およびmicroscissorsは大動脈のオフ脂肪および結合組織を解剖。大動脈がきれいになったら、縦に大動脈を切断し、後で氷上PSSに配置します。 </li></ol> 2.色素添加およびインキュベーション<ol><li>アルミ箔で覆われている個々の500μlのチューブに、DMSOベースのソリューションで提供されている1 mMののFluo-4 AM色素のピペット7μlの。時間をかけて、色素の性質を維持するために-20℃の冷凍庫に保管してください。注：これらは非常に分注しlutionsは、少なくとも6ヶ月間安定であるべきです。 </li><li>使用前に、色素溶液を開く前に、室温まで昇温することができます。使用直前に作業溶液を調製します。後で使用するために希釈された試薬を保管しないでください。 </li><li>何のカルシウムを含有しないPSSの450 ULにDMSO溶液に溶解した既製の1mMのFluo-4 AM色素の7μlを添加します。アセトキシメチル（AM）エステルを分散させる助け、カルシウム色素の負荷を改善するために、ローディングカクテルに非DMSOベースの10％プルロニック酸溶液40μlを追加します。 </li><li> 1時間（2.3で説明したように）、ローディングカクテルを含む500μlのチューブに解剖した大動脈を置きます。 RTで回転シェーカー上箔と場所ですべてのチューブをカバーしています。 </li><li>血管系におけるNO産生を監視しない場合は、DAF-FMジアセテート染料を使用しています。 450μlのPSS、40μlのプルロニック酸および10mM DAF-FMジアセテートの5μLを含有する溶液中に大動脈をインキュベートします。 （2.3で説明）のカルシウムのインキュベーションプロトコルと同様に、大動脈を配置室温で次の30分間、続いて4℃で30分間回転シェーカー上に箔と場所でカバーNO染料溶液を含む500μlのチューブです。 </li><li> NO産生が測定されていない場合、 図4（b）に示すように、対照としてNO産生を遮断しないように、内皮のNO合成酵素阻害薬、L-NAMEを使用します。その手順については、（室温で）インキュベーションの最後の30分間（2.5で説明したように）カクテル100 nmのL-NAMEに追加します。 </li></ol> 3.レーザー走査2光子顕微鏡のプロトコル<ol><li>細胞外色素を除去し、クリーンPSSで3回 - 1時間のインキュベーションの後、大動脈2を洗います。 </li><li>通常のPSSまたはCa 2+を含まない緩衝液（実験プロトコルに依存します）のいずれかを含むシリコーン被覆皿に大動脈を転送します。ピンダウンμ状のピンを使用してシリコーン（皿開口部に露出され、すなわち、内皮ルーメン）と接触している外膜を有するシリコーンコーティング上に大動脈。あるいは、スライスアンカーを使用グリッドまたは接着剤は、組織を固定します。 注：ストレスと可能な機械的なアーティファクト、伝達を低減およびCa 2+フリーソリューションを大動脈を修正し、5待つに-実験開始の10分前。 </li><li>薬物の自動または手動のアプリケーションのために、または細胞外溶液を変更するためのシリコーン被覆プレートに蠕動ポンプまたはシリンジを接続します。 </li><li>直立二光子顕微鏡のノーズピースの下に皿を置き、試料の上に25×（NA 1.05と作動距離2mm）を水浸対物レンズを取り付け、位置決めします。注：この特定のレンズが使用できない場合は、通常の目的と比較して飛躍的に信号の解像度を向上させることができるので、特に2光子イメージングのために製造され対物レンズを使用しています。 </li><li>ソフトウェアを使用して、2つの光子レーザーをアクティブにします（レーザーは、ポンプとオンし始めます）。チューニング820 nmのレーザー励起。 </li><li>エピ蛍光を用いて、大動脈を探し、上の目的を集中粗調整を使用して、内皮表面。 </li><li>励起レーザは、モードロックされ、非デスキャン検出器が係合されると予想される発光スペクトルに適切な放射フィルタがインストールされていることを確認して、2光子レーザ走査顕微鏡モードに切り替えます。注：ここでは、FV10-MRL / R（540 nmの495）を使用しました。 </li><li>約5％のレーザー出力を使用して、生のスキャンを開始し、微細血管内皮細胞を可視化するために、目的の焦点を合わせます。 注：通常のPSSでインキュベートしたときに内皮細胞は強い蛍光シグナルを示すであろう。容器はカルシウムを含まない緩衝液中でインキュベートされたとき、これは著しく弱くなります。内皮細胞は、開いた大動脈の上に存在し、平滑筋細胞は、単に内皮細胞（ 図2参照 ）の下に見られます。血管はいずれも平滑であってもあるので、平滑筋細胞および内皮細胞の両方が存在している場所があります。&lt;/ LI&gt; <li>セルがフォーカスに入ると、顕微鏡ソフトウェアプログラムは、高速スキャンモードで連続画像（ラスタースキャン、1.1秒のフレームコレクションの頻度で512×512ピクセルのウィンドウ）を収集します。フルオ4 AM蛍光と並行して、血管収縮の変化を検出し、より良い実験条件を可視化するために光画像を送信し収集します。 </li><li>ベースライン信号画像のコレクションの後、外液中のCa 2+イオン濃度を変更したり、ゆっくりと撮影しながら蠕動ポンプを使用して、薬理学的な刺激剤を適用します。負荷細胞内の蛍光シグナルの増加を観察します。 注：内皮細胞は、フローの変化にこのようにして、それがのCa 2+またはNOシグナル伝達の薬理学的活性剤を塗布する前に、低い層アプリケーションや車両試験を使用することをお勧めし応答します。のFluo-4（のFluo-4 Iの解離定数がロードされた血管内nMの濃度値を、細胞内カルシウムを再計算しますS 345 nM）を、蛍光強度は、ベースライン時およびイオノマイシンとのMnCl 2を添加した後に記録することができた。4 </li></ol> 4.画像処理と計算<ol><li>フィジーの画像処理パッケージをダウンロードし、インストールします。 </li><li>フィジーの画像ファイルを開きます。プロンプトが表示されたら、ファイルをインポートすると、チャンネル（透過光と蛍光信号）を分割します。データ分析のための唯一の蛍光シグナルを使用してください。 </li><li>フィジープログラム内で、分析タブをクリックし、[ツール]オプションまでスクロールダウンします。ツールのオプションでは、ROIのマネージャーを言うタブを見つけ、それをクリックしてください。新しいウィンドウが表示されます。 </li><li>この後、分析]タブで設定された測定値をクリックしてください。関心のある特定の測定値を選択します。カルシウムトランジェント測定では、平均グレー値のオプションを使用します。 </li><li>円形トレースツールでは、関心領域（ROI）を追跡し、すべてのRのためのROIマネージャ画面で「追加」をクリックして始めますOI。一度興味のあるすべてのセルは、「より」タブの下にマルチメジャーを選択し、ROIマネージャウィンドウで、トレースされています。スプレッドシートにこれらの測定の全てを直接測定値を保存するか、コピー＆ペーストするかを覚えておいてください。 </li><li>フィジーから* .txtファイルやExcelスプレッドシートを開き、新しい原点ワークシートに番号を転送します。注：または、さらなる分析のためにシグマプロットやプリズムのようなプログラムを使用します。 </li><li>オリジンプログラム内では、すべての過渡応答の概要を観察するためにプロット→線+シンボルメニューを使用します。応答しない細胞の選択を解除します。 </li><li>時間スケール（X軸）へのトレース数を再計算し、列→列値の設定を使用し、（我々の場合1.1sで）画像収集頻度へのトレース番号の列を掛けます。 </li><li>平均（Y軸）および標準エラーのトレースを計算するために選択したすべての記録のための行の解析→統計を使用してください。細胞プロット→線+シンボルの現在のグループのための最終的なグラフをプロットします。 </li><li> MEA以下のようにn個のカルシウム過渡計算が記載されています。 <ol><li>オリジンプログラム内の総カルシウム放出のために、グラフをクリックして、次に統合→メニュー分析→微積分を使用しています。曲線下面積の全積分は、結果ログに表示されます。 </li><li>一過性の動態については、グラフ上でクリックし、メニューを使用します。分析→非線形曲線フィット→[データセット（最大値から過渡応答の最後の範囲でX軸を選択します）。完了→指数関数的減衰1→関数選択→フィッティングを開始します。 注：指数フィッティングがグラフウィンドウに表示され、ログイン結果。得られたデータ（値）をリリースし、カルシウムの総量を表し、チャンネルの動力学は、過渡応答を媒介しました。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

実験の概要。より良い血管生理学にカルシウムの寄与を理解し、NOに、新規な方法を測定するために開発されたの[Ca 2+] iと内の平滑筋および単離された無傷の大動脈の内皮細胞NO。 1）機械的分離と準備（酵素消化ない）容器の：一緒に、このプロトコルは、これらの重要なステップで構成されています。これは最適な生理学的記録を得ることが可能な限り健康で無傷の組織を維持することが重要です。 2）プルロニック酸とカルシウム標識色素またはNO-標識色素でインキュベーションは重要である、しかし、いくつかの他の船舶の種類、異なるプルロニック酸およびインキュベーション時間をテストする必要があります。グリッドとピンとシリコーンコートディッシュに大動脈の3）適切な固定は、2光子顕微鏡で撮像中に安定したビューを提供します。血管が収縮と拡張されますので、容器はプロペであることを確認することが重要ですRLY発生する可能性のある運動アーチファクトを回避するために皿に固定されました。結果の4）定量。過渡振幅が常に細胞の生理学的特性を比較するための最良のパラメータでない場合がありますのでご了承ください。一過性の...

カルシウムは、内皮細胞および平滑筋細胞などの血管細胞内の基本的なセカンドメッセンジャーです。これは、血管収縮のための主要な刺激であり、内皮内のNO発生を介してその効果を含め、血管拡張において重要な役割を果たしています。これにより、撮像技術の制限のために、それは、無傷の血管内カルシウム処理を観察することは事実上不可能でした。 2光子イメージングシステムと新しいカルシウムの作成またはNO標識色素の開発は、カルシウム動態及び血管系内のNO産生を理解し始めるために十分な深さと解像度でイメージすることができます。 二光子顕微鏡は、最近ので、深く低いバックグラウンド蛍光と高い信号感度で組織に浸透するその優れた能力の組織、器官、さらには全体の動物試験に適用されている。1,2イルミネータで2光子励起の狭いスペクトルイオン焦点と非デスキャン検出器の使用は、2光子顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡よりも優れている理由です。共焦点顕微鏡は、自動蛍光および共焦点ピンホールへのピンボケ光の散乱に起因する必要な組織深さで高品質の画像を生成することはできません。したがって、我々は、[Ca 2+] i のシグナルを測定するために2つの光子顕微鏡を使用する方法と、高解像度、低信号対雑音比を有する無傷の、個々の血管細胞におけるNO産生を開発しました。

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズD-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズF14217</td><td>500 &micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>プルロニック F-68 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス 直立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:sapphireレーザー 690nm &mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>フィルター</td><td>オリンパス</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>495 から 540 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>25&times; 水浸対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&nbsp;</td><td>ワーナー・インストゥルメント&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>その他基礎試薬&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

カルシウムは、血管組織の多くの生理学的プロセスの非常に重要な調節因子です。ほとんどの内皮および平滑筋の機能は非常に細胞内カルシウム（[Ca 2+] i） の一酸化窒素（NO）の変化に依存します。の[Ca 2+] i の 、NOおよび下流分子は血管収縮薬および血管拡張薬に反応して血管によってどのように処理されるかを理解するために、我々はカルシウム標識（またはNO標識）を適用する新規な技術を開発した2光子顕微鏡を有する色素単離された血管におけるカルシウム処理（またはNO産生）を測定しました。ここで説明した内皮細胞または平滑筋細胞内にラット、ラベルカルシウムまたはNOから大動脈を分離する方法を示す詳細なステップバイステップの手順であり、画像のカルシウムトランジェント（またはNO産生）生理次の2光子顕微鏡を用いて、または薬理学的刺激。この方法を使用する利点は、複数倍である：1）それは、同時にすることが可能ですLY異なる刺激に応答して、両方の内皮細胞および平滑筋細胞におけるカルシウムトランジェントを測定します。 2）それは、画像の内皮細胞とそれらの天然の環境における平滑筋細胞のいずれかを可能にします。 3）この方法は、細胞内カルシウムまたはNO変化に非常に敏感であり、正確な測定のための高解像度の画像を生成します。 4）記載の手法は、活性酸素種のような他の分子の測定に適用することができます。要するに、2光子レーザ発光顕微鏡の応用カルシウムトランジェントを監視し、単離された血管の内皮細胞および平滑筋細胞におけるNO産生は、高品質の定量的データを提供しておらず、血管機能を調節するメカニズムの理解を推進してきました。

正確に血管の生理学（血管拡張および血管収縮）のカルシウムの寄与を評価するために、プロトコルは、単離された無傷の大動脈の両方の内皮細胞および平滑筋細胞にカルシウム色素をロードするように設計されました。 図1に示されている設定の一般的な実験では、単離およびイメージングの前に容器の製造のための基本戦略を示しています。簡単に言うと、ラットから大動脈を単離した後、それは脂肪および結合組織を除去する必要があり、縦方向にスリット。開かれた大動脈は、プロトコルに記載されており、光に揺らしながら室温で1時間インキュベートしたような従来準備ローディングカクテルを含む箔で覆われた500μlのチューブに配置する必要があります。インキュベーション後、大動脈を上向きにシリコーン及びルーメン最寄りの外膜とシリコンで覆われたプレート上に釘付け、洗浄する必要がありますし、イメージングのための直立2光子顕微鏡に移しました。 ONCE大動脈を顕微鏡上に置かれており、容器にフォーカスがある、内皮細胞は、それらの強い蛍光発光（ 図2A）<...

血管細胞機能は、細胞内メッセンジャーの活性に依存します。 ここで説明するのは、単離された大動脈の個々の内皮細胞および平滑筋細胞における生理学的および薬理学的刺激に応答した細胞内カルシウムおよび一酸化窒素レベルの測定を可能にするex vivo 2光子イメージング法です。

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

この手順の全体的な目的は、2光子顕微鏡を用いて、新鮮に単離した血管内のカルシウムまたは一酸化窒素を測定することです。まず、血管を機械的に単離し、準備します。次に、血管をカルシウム標識染料、または nitric acid を含むO標識染料でインキュベートします。次に、2光子イメージング中に安定した視野を確保するため、グリッドとピンを用いて血管をシリコンコーティングされたディッシュに固定します。最後に、2光子イメージングを行い、その結果を定量化します。このビデオでは、細胞外カルシウム濃度の変化に応答した、単離血管の内皮細胞における細胞内カルシウムシグナリングの上昇を示しています。最終的に、この手法を用いることで、研究者は新鮮に単離された血管の内皮細胞または平滑筋細胞におけるカルシウムまたは一酸化窒素の変化をモニタリングすることが可能になります。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、血管組織における細胞内プロセスのより優れた信号分解能と精密な測定を提供できることです。ここでは、この技術を古典的な（幾何学的ではない）ダイスと組み合わせて適用し、単離された中空器官上の個々の細胞におけるカルシウム・トランジェントと一酸化窒素産生を測定しました。本手法は、異なる血管細胞型における細胞内カルシウムおよび酸化物レベルを調節するメカニズムに関する知見を深めるのに役立つと考えています。生細胞、特に血管などの完全な組織における2光子励起顕微鏡イメージングは、高解像度の信号が得られ、焦点外の背景蛍光が少ないという利点があります。2光子励起の局在化範囲が狭いため、組織内の単一の焦点体積のみを照射し、焦点外の吸収を大幅に抑制して光散乱を減少させることができます。これにより、コラーゲンやエラスチン線維を含む自発蛍光の強い組織においても、蛍光分子のダイナミクスをイメージングすることが可能になります。解剖顕微鏡下でテキストプロトコルに従ってラットの大動脈を単離した後、微細チップピンセットとマイクロシザーを用いて、大動脈から脂肪および結合組織を除去します。洗浄が完了したら、組織を縦方向に切断し、後で使用するために生理食塩水（PSS）に移します。ローディングカクテルを調製するには、カルシウムを含まないPSS 450 µLに、既製の1 mM fluo-4 AM色素およびDMSO溶液 7 µLを加えます。次に、アセチルメチルエステルの分散を助け、カルシウム染料のローディングを改善するために、DMSOを含まない10%onic acid溶液を40 µL、ローディングカクテルに加えます。摘出した大動脈を、ローディングカクテルが入った500 µLチューブに入れます。チューブをアルミホイルで覆い、室温のローテーターで1時間振盪させます。テキストプロトコルに従い、大動脈組織をシリコンコーティングされたディッシュの表面に固定した後、ディッシュを正立二光子顕微鏡のノーズピースの下に配置し、25倍の水浸対物レンズを検体上の適切な位置に取り付けます。顕微鏡ポートに対応する放出フィルターを装着します。ソフトウェアを使用して二光子赤外線レーザーを起動し、透過光下でレーザー励起波長を820 nanometersに調整します。対物レンズの粗動調整を用いて大動脈を特定し、内皮表面に焦点を合わせます。顕微鏡を2光子レーザー走査モードに切り替え、励起レーザーがモードロックされていることを確認します。非DS走査検出器を、レーザー出力約5〜10%で有効にします。ライブスキャンを開始します。最後に、対物レンズを調整して血管内皮細胞または平滑筋細胞に焦点を合わせます。実験プロトコルの本文に従って、連続画像を収集してください。画像処理および計算を行うため、メタデータを含む形式で画像を保存します。GNU General Public Licenseに基づいてリリースされている画像処理パッケージFijiをダウンロードし、インストールしてください。ソフトウェアを使用して、画像ファイルを開きます。次に、プロンプトが表示されたら、透過光チャンネルと蛍光チャンネルを分割し、Fijiプログラム内でのデータ解析には蛍光チャンネルのみを使用するようにします。[analyze]タブをクリックし、[tools]オプションまでスクロールしてください。次にROIマネージャータブをクリックすると、新しいウィンドウが表示されます。続いて、「Analyze」タブの下にある「Set Measurements」をクリックし、関心のある特定の測定項目を選択します。これはカルシウムトランジェントの測定のためです。「mean gray value（平均灰色値）」オプションを使用します。次に、円形トレースツールを用いて関心領域のトレースを開始し、ROIマネージャーで選択した各ROIに対して「add」をクリックします。関心のあるすべての細胞のトレースが完了したら、ROIマネージャーの「more」タブから「multi measure」を選択します。最後に、測定値を直接保存するか、スプレッドシートにコピーして貼り付け、テキストプロトコルに従って計算を行います。このビデオで説明したプロトコルを用いると、大動脈の内皮細胞はその形状と強力な蛍光シグナルにより容易に特定できます。また、内皮細胞と同じ視野に平滑筋細胞も観察されるため、2種類の細胞が異なるアゴニストや刺激に対して、協調しながらも独立してどのように反応するかをより深く理解することができ、本手法の有用性が示されます。アセチルコリン、または内皮の強力なカルシウム依存性血管拡張剤であるCHAに対する応答の測定を、ここに示す方法で決定しました。CHAを添加すると、PSSのみの細胞と比較して内皮細胞の蛍光が増加し、細胞内カルシウム含有量が急速に増加した後、緩やかに基線に戻ることが示されました。このプロトコルは、内皮の一酸化窒素産生の検出にも適しています。本実験では、大動脈内皮細胞にDAF FM DA acetateをロードしました。CH刺激に応答してDye ENO産生がカルシウム依存的に増加し、この反応は内皮OCH合成酵素阻害剤のL nameによって阻害されました。この手法は、心血管生理学領域における重要な疑問の解明に寄与します。ここに記載した実験手順を、利用可能な複数の遺伝子改変動物モデルと併せて活用することで、基礎研究およびトランスレーショナルリサーチにおけるtwo photo microscopyのFAR FSA応用への新たな視点が得られます。この手法を用いることで、血管細胞内の特定の細胞内シグナル伝達経路に関する深い理解とメカニズム的な洞察を得ることができます。このビデオを視聴することで、新鮮に単離した血管の個々の細胞内におけるカルシウムおよび一酸化窒素レベルをリアルタイムでモニタリングするための、本技術の適用方法を学ぶことができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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細胞内カルシウムの二光子イメージング

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