新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

次の手順の全体的な目標は、アンカレッジの独立した培養技術を使用してin vitroでがん幹細胞を増殖させ、その後、新しいがん幹細胞標的療法の代謝効果をテストすることです。これは、最初にヒト膵臓腺癌組織サンプルを単一細胞懸濁液に解離することによって達成されます。第2のステップでは、腫瘍組織を酵素でさらに消化し、次いでゼラチンプレート上に播種し、線維芽細胞集団を除去するために、単離された癌細胞を次いで超低接着マルチウェルプレートに播種し、腫瘍球の代謝活性および形成を評価するために目的の薬物で処理する。

最終的には、目的の薬物を免疫不全マウスに使用して、患者由来の異種移植片を装着したマウスで、in vivoでの薬物の効果を検証することができます。これらの方法は、がん幹細胞生物学を研究するための強力なツールであり、新しいがん幹細胞標的療法を開発するための最初のステップとして機能します。この手順を実演するのは、乳がん研究所のがんと老化の幹細胞センターの若手研究者である私自身と、私の研究室の博士課程の学生であるティニ・クルスです 無菌のバイオセーフティキャビネットで膵管腺がんからがん幹細胞を分離します。

滅菌メスと鉗子を使用して、1ミリリットルの滅菌PBSを含む60 x 15ミリメートルの培養皿でヒト腫瘍をミンチし、必要に応じてさらに3〜4ミリリットルのPBSを組織が完全に解離するまで追加します。組織懸濁液を滅菌円錐管に移し、PBSを最終容量5ミリリットルに加えます。次に、解離遠心分離機でサンプルを機械的に均質化し、均質化した組織をコラゲナーゼで摂氏37度で分解します。

1時間の遠心分離後、細胞は蘇生し、ペレットを10ミリリットルの完全培地に懸濁します。細胞懸濁液を40μmのストレーナでろ過し、再び細胞をスピンダウンします。今回は、ペレットをCKの5ミリリットルに懸濁し、室温で5分後、赤血球溶解バッファーを遠心分離により除去し、ペレットを癌幹細胞培地に再懸濁します。

次に、ゼラチンでコーティングされた皿の上で細胞を摂氏37度でインキュベートし、急速に付着する線維芽細胞の大部分を除去します。1時間後、上清を回収し、生存可能な膵臓がん細胞の数を定量化して、がんの腫瘍球形成を促進します。幹細胞濃縮は、がん幹細胞培地の適切な容量で細胞を希釈し、1ミリリットルあたり3細胞の10の2倍の最終濃度に希釈し、氷の上で数分間冷却します。

次に、24超低接着細胞プレートの最初と最後の列に500マイクロリットルのPBSを追加した後、ピペットで細胞を再懸濁し、プレートの空のウェルにウェルごとに1ミリリットルの細胞を播種します。細胞の4つのウェルを目的の薬物で処理し、少なくとも4つのネガティブコントロールウェルをビヒクルで処理します。次に、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と1週間インキュベートします。

一日おきに、各井戸に私たちの車に新鮮な処理を追加します。5日目または7日目に、腫瘍球の連続包装のためのより大きな構造の同定を可能にする自動セルカウンターを使用して、形成された腫瘍球の数を評価します。7日目に、40マイクロメートルのセルストレーナーを使用して球体を採取します。

次に、球体をスピンダウンし、1ミリリットルのトリプシンで摂氏37度で20分間インキュベートし、ペレットを単一細胞懸濁液に解離します。次に、先ほど示したように、細胞をさらに7日間膨張させて、活性酸素種または解離後のROS産生を測定するための球体を準備し、球体をスピンダウンし、適切なプローブを含むHBSSにペレットを再懸濁します。摂氏37度の暗闇で20分間インキュベートした後、フローサイトメトリーによる分析まで細胞を氷上に置いて、酸素消費量を測定するための球体を準備します。

まず、96ウェルの細胞培養プレートに細胞および組織接着剤を塗布し、室温で少なくとも20分間コーティングします。次に、示されているように球体とトリプシンを解離します。次に、プレートを水で2〜3回洗浄して余分な粘着プレートを取り除き、1ウェルあたり10〜5番目の細胞の3倍の単数セルを1ウェルにします。

150マイクロリットルの酸素消費アッセイ培地にグルコースとピルビン酸ナトリウムを含有し、Gの100倍に達するまで遠心分離により細胞をウェルの底に接着します。遠心分離機をブレークオフで停止させます。次に、プレートの向きを逆にして、スピンを繰り返します。

次に、二酸化炭素なしで細胞を摂氏37度で30分間インキュベートします。その間、アッセイカートリッジのインポートをロードします。A、B、およびC.目的の薬物の3、6、および9ミリモル濃度のそれぞれ25マイクロリットルを注入し、ミトコンドリア阻害剤ロンの1マイクロモル濃度の25マイクロリットルでDを輸入する。

細胞の準備ができたら、カートリッジをキャリブレーションし、細胞培養プレートをロードします。最後に、混合と測定の標準的なプロトコルでアッセイを実行します これらの代表的な実験では、メトホルミンによる膵臓癌幹細胞の治療により、腫瘍球のサイズと数が大幅に減少しました。さらに、これらの減少は、二次および三次圏の文化によって示されました。

一次球体培養のみがメトホルミンで処理されていた場合でも、メトホルミンはミトコンドリア阻害剤として作用すると報告されています。実際、この実験では、この薬物は、ROS産生を誘導する能力と相関する腫瘍細胞内の酸素消費量の急速かつ用量依存的な減少を誘発することが観察されました。重要なことに、メトホルミンで処理したマウスは、対照動物と比較して、短期間ではあるが膵臓腺癌の進行が大幅に減少します。

このビデオを見た後、あなたは新鮮な人間の腫瘍を解離する方法をよく理解しているはずです。初代がん細胞を単離し、球体形成培養として設定し、膵臓がん幹細胞の代謝活性を評価します。