移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

本手順の全体的な目的は、熱産生異化細胞株のカプセル化と、そのin vitroおよび潜在的なin vivoにおける応用を実証することです。まず、アルギン酸ナトリウム細胞懸濁液を調製し、5 mLシリンジに移します。次に、カプセル化装置を使用してアルギン酸マイクロビーズを作製します。

次に、マイクロビーズを陽イオン性ポリL-リジン溶液でコーティングし、続いてアルギン酸コアを除去することで、細胞懸濁液の周囲に半透膜を形成させます。最終ステップとして、封入された細胞を他の細胞株と共培養するか、マウスの脂肪組織に注入します。最終的に、免疫血液分析により、アルデヒド脱水素酵素欠損脂肪細胞を含むマイクロカプセルと共培養した脂肪細胞において、より高い脂質分解活性が示されます。

免疫組織化学により、カプセル化された細胞がマウスの脂肪組織に正常に移植されたことが示されましたが、この手法は熱産生および褐色組織に関する知見を得るために有用です。また、他の既存の動物モデルにも適用可能であり、生体内での細胞サブセットを検証するための低コストな実験モデルシステムを提供できます。生物医学的発見のため、すべての操作は層流を備えたレベル2のバイオセーフティキャビネット内で行ってください。

まず、細胞培養フラスコから古い培地を取り除き、前駆脂肪細胞を10 millilitersのPBSで洗浄します。PBSを取り除き、細胞を2 millilitersの0.25%tripsin EDTAに再懸濁します。細胞懸濁液から10 microliter分を分注し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。

製造元の指示に従い、適切な細胞数にするために残りの細胞にDMEMを加え、室温で480 ×gで5分間遠心分離します。プロトコルの本文にある指示に従って必要な細胞数を決定した後、細胞ペレットを適切な量の2%アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁します。このアルギン酸ナトリウム細胞溶液を5 mLシリンジに移します。

溶液中の気泡を取り除き、シリンジを反転させて1 mLのエアポケットを作ります。カプセル化の準備として、100 mMの塩化カルシウム溶液144 mLを入れた小型ビーカーを用意します。カプセル化装置のニードル口の下で、電極を封入物に接続し、チップが塩化カルシウム溶液の表面から約2.5 cm上の位置に来るように調整します。

アルギン酸ナトリウム細胞懸濁液が入ったシリンジを、シリンジポンプにしっかりと固定します。シリンジの開口部にゴムチューブを取り付けます。アルギン酸ナトリウム細胞懸濁液がチューブの半分まで入るまで、プランジャーを押し込みます。

電圧を5.4 kilovoltsに調整し、シリンジポンプの直径を12.06 millimetersに設定します。速度を3 milliliters per hourに調整します。ポンプを起動し、エンカプセル装置をオンにして、電圧を5.4 kilovoltsに維持します。

アルギン酸マイクロビーズの形成が完了するまで、フードのウィンドウを閉め、不要な振動を避けてください。溶液がすべてニードルを通過した後、ポリアニオン性ポリリジン（PLL）でコーティングする前に、塩化カルシウム溶液中で球状のアルギン酸マイクロビーズをさらに20分間凝固させます。ナトリウムアルギン酸の球状マイクロビーズが凝固したら、マイクロビーズの入ったビーカーをカプセル化装置から取り出してください。

マイクロビーズを50 mLの遠心チューブに移します。マイクロビーズのペレットから塩化カルシウム溶液を除去します。0.9%塩化ナトリウム溶液を30 mL加え、チューブを手で静かに振ってマイクロビーズを洗浄します。

マイクロビーズを重力で沈殿させます。次に、25 mLピペットを使用して、このように塩化ナトリウム溶液を除去します。マイクロビーズを計3回洗浄してください。

次に、0.05% PLL溶液をマイクロビーズに加えます。アルギン酸ナトリウム溶液1 mLに対して、PLL溶液を10 mL使用してください。1000 rpmで10分間ボルテックスしますが、通常、これでPLLコーティングには十分です。

PLLコートの形成を確認後、PLL溶液を取り除き、前述の手順に従ってカプセルを0.9%塩化ナトリウム溶液で3回洗浄します。まず、PLLコートされたマイクロビーズから代替コアを除去するため、50 mLチューブに50 mMクエン酸ナトリウム溶液を30 mL加えます。5分間、またはアルギン酸ナトリウムが完全に溶解するまで待ちます。その後、前述の手順に従ってカプセルを0.9%塩化ナトリウム溶液で3回洗浄します。

20 mLの培地による3回目の洗浄後、細胞を含むすべてのカプセルを細胞培養フラスコに移し、標準的な細胞培養条件下で封入細胞を処理します。本手順に用いる宿主細胞は、コンフルエントになるまで24ウェルプレートで培養してください。付属のプロトコルに従って調製した線維芽細胞増殖培地を使用します。

前脂肪細胞の培養の手順です。コンフルエントな宿主細胞を含む24ウェルプレートにマイクロカプセルを移し、各ウェルで単層となるようにマイクロカプセルを添加します。分化培地1を用いて前脂肪細胞の分化を誘導し、48時間インキュベートします。

48時間後、培地を分化培地2（Differentiation Medium Two）に交換します。その後、48時間ごとに新鮮な分化培地2に交換します。また、48時間ごとに細胞からタンパク質を回収し、ウェスタンブロッティングにより解析します。

マイクロビーズ作製における各工程は、顕微鏡下で観察できます。20倍の倍率でアルギン酸マイクロビーズを示します。PLLコーティング前、PLLコーティング後、および定量的研究においてジネットコアを溶解させた後の状態で、脂肪組織トリグリセリドリパーゼ（ATGL）の発現を、無細胞の野生型またはアルデヒド脱水素酵素1（ALDH1）欠損脂肪細胞を含むマイクロカプセルと共培養した3T3-L1脂肪細胞の間で比較しました。

L DH one A one欠損細胞と共培養した脂肪細胞においてA TGLの発現が高まっていることは、より高い脂質分解活性を示しています。in vivo研究において、GFPで標識したカプセル化細胞をマウスの腹腔内脂肪組織に注入しました。80日後、注入した脂肪組織にはカプセル化細胞の脱色したクラスターが認められました。

ヘマトキシリン・エオジン染色を施した腹腔内脂肪貯蔵所のパラフィン包埋切片では、移植されたマイクロカプセル封入細胞のクラスターと宿主の脂肪細胞が観察されます。同一の切片を蛍光光で解析すると、円形で完全なカプセルの内部にGFP標識された移植細胞が認められます。GFPの発現は、移植後の細胞生存能の指標でもあります。

この封入技術により、代謝性疾患分野の研究者が、モデル生物を用いて、肥満、2型糖尿病におけるインスリン抵抗性、炎症、および癌の潜在的な治療法を探索することが可能となりました。