小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法熱帯熱マラリア原虫

ヒトマイクロRNAは、宿主赤血球から熱帯熱マラリア原虫に移行します。ここでは、合成マイクロRNAを宿主赤血球にトランスフェクションし、熱帯熱マラリア原虫からすべてのRNAを単離するために使用される技術について説明します。 さらに、この論文では、寄生虫転写産物のリボソーム占有率と翻訳電位を決定するための熱帯熱マラリア原虫のポリソーム単離方法について詳しく説明します。

この手順の全体的な目標は、熱帯熱マラリア原虫転写産物の転写後遺伝子調節における赤血球マイクロRNAの役割を研究することです。この方法は、宿主または寄生虫の低分子RNAとのRNAスプライシングイベントが融合mRNAの翻訳電位にどのように影響するかなど、マラリア分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、1つのプールで全RNAと低分子RNAをまとめて捕捉できることであり、1つの細胞に低分子RNAと融合RNAが存在することを実証します。

さらに、この手順ではポリソームプロファイリングを利用して、これらの低分子RNAが融合mRNA産物の翻訳にどのように影響するかを示します。まず、完全なマラリア培地に300マイクロリットルの赤血球をセンチフで800倍Gで5分間トランスフェクションします。赤血球をRPMI培地で2回洗浄し、細胞を50%ヘマトクリットで完全な細胞混合物に再懸濁します。

次に、細胞をエレクトロポレーションベテに移し、10μgのDYSビオチン標識マイクロRNAまたは非標識ネガティブコントロールマイクロRNAを添加します。細胞をエレクトロポレーションするには、veteをエレクトロポレーションに入れ、単一のパルスを送達します。次に、細胞をプレートし、テキストプロトコルに記載されているように、4時間後に熱帯熱マラリア原虫に感染させます。

次に、50マイクロリットルのパックされ、ストリップされたAvidおよびビーズを10マイクログラムの寄生虫RNAにマイクロセンターチューブで加え、チューブを4°Cで1時間回転させてインキュベートします。ストリップダバンとビーズをGの800倍で30秒間遠心分離し、次に1〜1000希釈のRNA阻害剤を含む500マイクロリットルのRNPバッファーでペレットを洗浄します。次に、ResusによるビーズからのRNAを溶出し、それらを200マイクロリットルのRNAに懸濁します。

過剰なビオチンを含む溶出バッファーを捕捉します。ビーズを回転させながら、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、ビーズをGの800倍で30秒間遠心分離し、上清RNAを収集します。

過剰なビオチンで溶出し、適切な特異的溶出を確保するためには、溶出性溶出剤と溶出剤を最小限にすることが重要です。これにより、バックグラウンドRNAの濃縮が減少します。最後に、ポリソーム分離を開始するためのテキストプロトコルに記載されているように、定量的なR-T-P-C-Rによる熱帯熱マラリア原虫転写産物およびマイクロRNA濃縮の濃縮度を決定します。

まず、50%スクロース溶液の5ミリリットルを超遠心チューブに入れます。次に、50%溶液の上に15ミリリットルのスクロース溶液を慎重に重ねます。次に、グラジエントチューブをパーフィルで密封し、チューブをベンチトップに水平になるまで慎重に傾けます。

転がりを防ぐために、チューブが安定した位置にあることを確認してください。グラジエントが形成されるまで、チューブをこの位置に少なくとも2時間保持します。その間に、マラリア原虫に感染した血液の非同期培養液を約100ミリリットル採取し、3〜5%パーシットで採取します。

次に、2ミリモルのシクロハイデを含む10ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、細胞をGの500倍で7分間遠心分離し、次いで200マイクロモルのシクロハイデresusを含む80ミリリットルのPBSで2回洗浄する。ペレットをシクロヘキシミドを含むPBSに懸濁し、氷の上に置きます。

細胞をペレット化し、上清を除去してペレット量を推定します。次に、最終容量の4.25ミリリットルの溶解液で細胞を溶解し、緩衝し、回転しながら摂氏4度で10分間インキュベートします。ポリソームプロファイリングとマラリアの原因種に関する以前の試みでは、ポネント溶解がポリソームをモノゾーンに分解するため、ほとんどがモノであることが明らかになりました。

ここでは、赤血球と寄生虫を同時に溶解して熱帯熱マラリア原虫のポリソームパターンを維持し、溶解物をマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度でGの16,000倍で10分間回転する溶解バッファーを利用します。別の事前に冷却した5ミリリットルの超遠心チューブに、27ゲージの針が付いたシリンジを使用して、1.25ミリリットルの冷たい0.5モルのショ糖クッション溶液を追加します。スクロースクッションの上に3.75ミリリットルのライセート上清を慎重に重ねます。

サンプルをGの366,000倍、摂氏4度で146分間遠心分離します。この間、ショ糖を殺した超遠心チューブをゆっくりと垂直位置に戻し、少なくとも15分間氷の上に放置します。超遠心分離機から溶解物を取り除いた後、上清を15ミリリットルの円錐形の2つに慎重に収集します。

上清をマイナス80°Cで保存し、リボソームに結合していないRNA画分を保存します。次に、リボソームペレットを500マイクロリットルのResus懸濁液に再懸濁し、5分間ピペッティングして緩衝液にし、サンプルを摂氏4度でGの16,000倍で10分間遠心分離します。不溶性物質を除去するには、グラジエントチューブのパラムシールを慎重に取り外してグラジエントを妨げないようにし、その上にリボソーム懸濁液を注射器と27ゲージの針で重ねます。

チューブを摂氏4度でGの200,000倍で180分間遠心分離した後、フラクショネーターにロードする準備ができるまでグラジエントを摂氏4度で保存します。空の超遠心チューブをグラジエントフラクショネーターに入れ、システムをRNAフリー水で5分間洗浄します。洗浄中は、UV吸光度検出器の感度を254ナノメートルから0.2に設定します。

ただし、信号によっては調整が必要な場合があります。次に、水が検出器を通過するときのベースライン信号をゼロに設定します。コレクターを洗浄した後、フラクショネーターを通る流体の流れを逆にしてラインを空にしてから、空の超遠心チューブを取り外します。

60%スクロース溶液をFRACTIONATORに通し、針装置から出るまで実行します。次に、ロードされたグラディエントチューブをローディングチャンバーの上部に置き、シールを締めます。チューブの底に針を刺します。

次に、分留装置の流速を12.5 x 10にリセットし、マイクロ遠心分離管に18秒のフラクションを収集します。60%スクロース溶液の順方向の流れを開始して、グラジエント溶液の最初の滴がマイクロ遠心チューブに入る前にフラクションを溶出します。254ナノメートルの信号での吸光度の収集とライブ録音の両方を開始します。

吸収性信号が50%と60%のショ糖溶液の界面で急激に低下した場合は、流れと記録を停止します。勾配分数は摂氏マイナス80度で保存します。次に、60%溶液が超遠心チューブから空になるまで、流体の流れを逆にします。

チューブを取り外し、次のグラジエントの分析を開始します。マイクロRNA4 5 1による赤血球のトランスフェクションと、それに続くビオチン化マイクロNAmRNAハイブリッドの回収により、PKAR融合転写産物の濃縮が明らかになりました。模擬または無関係のマイクロRNAトランスフェクションは、PKAR転写産物を濃縮しなかった。

データは、40 sおよび60 sリボソームサブユニット、a DSリボソーム、および示された数のリボソームを含むポリソーム画分のエルーシアンピークを示しています。リボソームは、赤血球内に存在するPCIから単離された転写産物と関連していました。ノーザン血液分析により、リボソームとポリソームは18 Sと28 SRNAと関連していることが示されました。

この手順に加えて、R nase H消化、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティングなどの他の方法を実行して、microRNA MRの存在をさらに検証することができます。NAフュージョン。このビデオを見れば、マイクロRNAを赤血球にトランスフェクションし、その後、キメラ転写産物を含むトータルRNAを含む低分子RNAを捕捉する方法を十分に理解できるはずです。また、ポリソームを回収して、リボソームの占有率、したがってこれらの融合転写産物の翻訳電位を決定できる必要があります。