栄養細胞の標的溶解によって環境サンプルからの内生胞子の物理的な分離

この手順の全体的な目標は、堆積物などの複雑な微生物群集サンプルから細菌の内胞子を分離することです この方法は、天然サンプル中の内生胞子の存在と豊富さに関する微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、化学物質と熱に対する内乳子と栄養細胞の間の抵抗性の違いに基づいています。この技術の主な利点は、この方法が内生胞子に対して非破壊的であるため、培養、定量化、代謝試験などの下流実験に使用できることです。

この方法は、内胞子形成細菌の生態学に作用するように設計されていますが、胞子が有益または有害である可能性のある外生生物学や食品産業などの分野でも使用できます。テキストプロトコルに従って溶液と機器を調製した後、UV滅菌バイオセーフティキャビネットの下で、エタノール燃焼金属スコップを使用して、事前に計量された滅菌済み50ミリリットルチューブに3グラムの沈殿物サンプルを追加します。滅菌済みの目盛り付きビュレットを使用して、ろ過された滅菌済みの1%ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液またはSHMP溶液15ミリリットルをサンプルに加えます。

液体分散器またはホモジナイザーと滅菌分散ローターを使用して、サンプルを17, 500 RPMで1分間均質化します。サンプルを2分間休ませ、均質化を繰り返します。サンプルを10分間休ませて、最も重い粒子が沈殿します。

細胞バイオマスを含む上清を、ペレットを乱さないように注意しながら、きれいな50ミリリットルのチューブに移します。沈殿したペレットにさらに15ミリリットルのSHMPアリコートを追加し、均質化を繰り返してから、上清を収集して最初のアリコートと組み合わせます。サンプルをGの20倍で1分間遠心分離し、上清を新しい50ミリリットルのチューブに移してから、ペレットを廃棄します。

ろ過ユニットと真空ポンプがテキストプロトコルに従って準備されたら、エタノール炎を使用して鉗子を滅菌し、滅菌ニトロセルロース膜をろ過ユニットに追加します。調製したばかりの上清サンプルの半分をメンブレンフィルトレーションユニットに加え、真空ポンプを使用してメンブレン上の細胞を回収します。液体がフィルターを完全に通過したら、真空ポンプを停止します。

滅菌した鉗子を使用してメンブレンを慎重に取り除き、滅菌ペトリ皿に入れます。滅菌メンブレンの新鮮な部分で、溶液の残りの半分でろ過を繰り返します。採取したばかりのバイオマスの栄養細胞から内胞子を分離するには、膜が凍結している場合は解凍し、エタノールで炎上滅菌したハサミを使用して細かく切ります。

メンブレン片を滅菌済みの2ミリリットルチューブに移し、900マイクロリットルの1X TEバッファーを追加します。ボルテックスして完全に混合し、バイオマスを膜から放出します。チューブを摂氏65度、80RPMで10分間インキュベートします。

次に、インキュベーターからチューブを取り外し、15分間冷まします。調製したばかりのリゾチーム100マイクロリットルを最終濃度2ミリグラム/ミリリットルまで加え、サンプルを摂氏37度、80RPMで60分間インキュベートして栄養細胞を溶解します。溶解が完了したら、250マイクロリットルの3つの正常水酸化ナトリウムと250マイクロリットルの6%SDS溶液をサンプルに加えます。

室温、80 RPMで60分間インキュベートします。次に、オートクレーブにより直径25mmの膜を保持する滅菌ろ過ユニットを準備します。ろ過ユニットが冷えたら、直径25ミリメートルの0.2マイクロメートルのニトロセルロースメンブレンをその上に置きます。

サンプルをメンブレンに加え、真空ポンプを使用して液体をろ過し、メンブレン上の内胞子を捕捉し、栄養細胞材料が通過します。残留洗剤を洗い流すには、2ミリリットルの滅菌生理液をメンブレンに加え、真空ポンプを塗布します。液体が完全にろ過されたら、ポンプの電源を切り、メンブレンをろ過ユニットの上に置きます。

メンブレン上で直接DNase処理を行うには、450マイクロリットルの滅菌水、50マイクロリットルの1X DNase反応バッファー、および0.5マイクロリットルのDNase酵素をメンブレンに添加し、約25°Cで15分間放置します。溶解した細胞から以前に放出された細胞外DNAは酵素的に消化され、その後洗い流されます。これにより、最終的な内胞子調製物に外部DNAが含まれていないことが保証され、これは分子分析などのダウンストリーム分析の鍵となります。

フィルター装置に漏れがあってはならず、サンプルが乾燥しないことを覚えておくことが重要です。インキュベーション後、1ミリリットルの生理液を加え、ポンプをオンにしてサンプルから残留酵素を洗い流します。滅菌鉗子を使用して、内胞子を含む膜を滅菌ペトリ皿に移します。

テキストプロトコルに従ってサンプルを分析します。このビデオで示されている栄養細胞の標的溶解のプロトコルは、精製された内胞子サンプルと内生胞子形成体の割合の大幅な増加をもたらします。アンプリコンでは、未処理のサンプル中の16SリボソームRNA遺伝子フィルミキュートは、配列の8%から19%にしか対応していません。

対照的に、治療後のフィルミキュートは、エンドスポリンが豊富なサンプルの90.6%と83.9%を占めていました。フィルミキュートを形成する内乳子の2つの主要な目、バチルスとクロストリジウムは濃縮されましたが、乳酸バチルのような非内乳子形成フィルミキュートは存在しませんでした。また、純粋な培養物を用いて、処理の効率性も実証されました。

内胞子調製物および栄養細胞培養物を処置し、全ての細胞をインキュベートし、600ナノメートルの光学密度で増殖を測定した。このように、内胞子培養では増殖が観察されましたが、処理した大腸菌培養では増殖は観察されず、栄養細胞が不可逆的に損傷を受けていることが示唆されます。一度習得すると、また、溶液と機器が事前に準備されている場合、この手法は約5時間で完了します。

無菌条件下で作業し、溶液とすべての機器の無菌性を確保することにより、すべての汚染を回避することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、培養、単離、代謝試験などの他の方法を実行して、内生胞子の菌株同定と代謝の可能性に関する追加の質問に答えることができます。また、下流のDNA抽出とメタゲノムシーケンシングを行って、種の多様性と遺伝子の存在を解析することもできます。

このビデオを見れば、環境サンプルから内胞子を分離する方法を十分に理解できるはずです。SDSなどの洗剤の使用は非常に危険であることを忘れないでください。個人用保護具の着用を忘れないでください。