ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

このELISAベースの方法の目的は、まずサイトカインの受容体への結合親和性を決定し、次に阻害ペプチドによるリガンド-受容体相互作用の阻害効果を測定することです。この方法は、サイトカイン-受容体結合など、タンパク質間相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。結合親和性とその阻害は、相互作用力学の一般的な理解を深める可能性があります。

この技術の主な利点は、実行が簡単で、ラベル付き受容体を生成し、ELISAリーダーなどの容易に利用可能なアクセスにより比較的安価であることです。この方法はサイトカイン受容体相互作用への洞察を提供できますが、一般的なタンパク質間相互作用や特定の相互作用を阻害するためのブロッキング化合物の設計など、他のシステムにも適用できます。テキストプロトコルに記載されているように溶液を調製してください。

炭酸コーティングバッファーを0.22ミクロンのPES膜でフィルタリングしてください。真空を使用してください。また、各リガンドまたはペプチドの10種類の濃度を作ってください。

このビデオでは、2つのアッセイが説明されています。1つ目は直接的なリガンド受容体相互作用ELISAです。これは、受容体-リガンド解離定数を測定するために使用でき、受容体-リガンドの結合親和性を表します。2つ目のアッセイは、最近最適化された競合リガンド-受容体相互作用ELISAです。

これにより、受容体-リガンド相互作用を妨害するペプチドやその他のブロッキング化合物のスクリーニングが可能になります。効率のために、96ウェルプレート用に多チャンネルピペットを用意し、デカンティング時には内容物を捨ててください。この手順は、組換え受容体でプレートをコーティングすることから始めます。

まず、受容体を炭酸バッファーで100ナノグラム/マイクロリットルに希釈します。次に、プレートのウェルに100マイクロリットルの受容体溶液をロードします。プレートの端の効果を避けるために外壁は除外してください。

プレートをカバーし、4度セルシウスで一晩インキュベートします。プレートのインキュベーションはすべて、ゆっくりと振って行います。翌日、コーティング溶液を取り除き、プレートを洗浄溶液（PBSに少量のTween 20を加えたもの）で3回洗浄します。

次に、200マイクロリットルの5％PSAを加えて、受容体の遊離結合部位をブロッキングします。プレートを室温で2時間インキュベートしてブロッキングを完了させます。後でウェルを空にし、以前のようにプレートを洗浄します。

次に、ウェルに組換えヒス-タグリガンドの様々な希釈液を100マイクロリットルロードします。各濃度を複製でロードします。ブランクウェルにはPBSのみをロードします。

その後、プレートを室温で2時間インキュベートします。リガンドとのインキュベーションの後、プレートを洗浄溶液で3回洗浄します。次に、各ウェルに一次抗ヒスマウスモノクローナル抗体を100マイクロリットルのアリコートをピペットで入れ、プレートを室温で2時間インキュベートします。

抗体を洗い流した後、各ウェルに100マイクロリットルのHRPカップリングヤギ抗マウスIGG二次抗体溶液を加えます。プレートをアルミホイルで包み、光を避けます。その後、プレートを室温で45分間インキュベートします。

標準的な洗浄技術を使用して二次抗体を除去します。次に、各ウェルに新鮮に調製したTMB（等量の基礎溶液AとBから作られる）を100マイクロリットル加えます。次に、プレートを室温で15〜30分間保持します。十分な色が現れたら、各ウェルに50マイクロリットルの基礎溶液を加えます。

プロトコルは、メッセージ信号が特定の結合から上昇するという仮定に基づいています。信号への非特異的結合の寄与を推定する必要がある場合があります。次に、プレートの吸光度値を450ナノメーターで読み取り、KD値の計算に進みます。

競合LRA手順は、直接LRA手順と同じステップに従いますが、いくつかの重要な変更があります。プレートから過剰なコーティングリガンドを洗い流した後、プレートウェルをブロッキングします。各ウェルに200マイクロリットルの5％BSA溶液を加えて、プレートを室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション中、PBSで組換えヒス-タグリガンドを10ナノグラム/ミリリットルの固定濃度で準備します。次に、10ナノモラーから100マイクロモラーの範囲で、ブロッキングペプチドをPBSで異なる濃度で準備し、用量反応曲線を確保します。このようにして、ブロッキングペプチドのIC50値を見つけることができます。

コントロールウェルでは、最大結合を得るためにペプチドなしの固定リガンド濃度をロードします。ブランクウェルでは、リガンドやペプチドなしのPBSのみを加えます。他のウェルでは、リガンドを50マイクロリットルと各ペプチド濃度を50マイクロリットル加えます。

その後、プレートを室温で2時間インキュベートし、通常通り進めます。直接LRAを使用して、3つの異なるインターフェロンリガンドペプチドと受容体アルファサブユニットIL28R-aの間の解離定数が決定されました。占有結合部位の割合を、対応するインターフェロン濃度の対数に対してプロットします。これらの結果は、ヒル方程式にデータを当てはめてKD値を推定するために分析できる結合曲線を示しています。

Scatchardプロットは、リガンド結合における協調性を示しており、最終的にインターフェロンリガンド1が最も高い結合親和性を持ち、次いでインターフェロンリガンド2、インターフェロンリガンド3が続きます。1を超えるヒル係数値は、初期のリガンド受容体相互作用後に追加のリガンドに対する親和性の増加を示唆しています。次に、競合LRAを使用して、インターフェロンリガンドペプチドと受容体サブユニット間の相互作用に対するブロッキングペプチドの影響を定量化しました。

インターフェロンリガンドペプチドの10ナノグラム/ミリリットルでの占有結合部位の割合を、インターフェロンペプチド濃度の対数に対してプロットします。これらのデータから、IC50値が推定されました。計算された値によると、ブロッキングペプチドはインターフェロンリガンド3とIL28R-aの間の相互作用を最も大きく阻害しました。

この技術を習得すれば、適切に実行すれば8時間で完了します。この手順を試みる際には、この手順に従って、各リガンド受容体結合の飽和濃度を測定し、他の方法を用いてより詳細なKD値を得ることも重要です。

この技術の開発後、リガンド-受容体相互作用の分野の研究者が、これらの相互作用をブロックする阻害物質を探索する道を開きました。