Name: ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶELISAベースの結合法と競合法を用いて、サイトカインと受容体の結合親和性と阻害ペプチドの効果を測定する方法。タンパク質間相互作用の動態理解に有用です。

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ETHチューリッヒ工科大学バイオシステム科学・工学部（スイス、チューリッヒ）およびスイス生物情報学研究所（スイス、バーゼル）のJ. Stelling教授に、原稿の批評的レビューに感謝します。

1.試薬の調製<ol><li>炭酸塩コーティング緩衝液を調製するために、蒸留水100ml中のNa 2 CO 3 0.84 gでのNaHCO 3 0.36グラム溶解します。滅菌フィルター使用するまで室温で0.22μmのポリエーテルスルホン（PES）膜フィルターとストアを駆動真空を使用してバッファ。 </li><li>リン酸0.05％（v / v）のトゥイーン20を添加することにより、洗浄溶液を調製するには、緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> 4°Cで100 mlのPBSとストアに5gのBSA（≥98％）を溶解させて、PBS溶液中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）（ブロッキング溶液）を準備します。 </li><li>組み換え受容体、リガンドと遮断ペプチド<ol><li> Reconstitutethe組換えヒトインターロイキン受容体αサブユニット（IL28RA）および-80℃でのメーカーの指示や店舗に従って、ヒトIFN（IFNL1-3）の組換えHisタグ付きリガンド。 Synthetizeは、ペプチドを遮断し、以前4に記載されているように使用します。リガンドの種々の濃度を調製するためにPBSを使用してsおよびアッセイにおける使用のためのペプチド。 </li></ol></li><li>一次抗体を調製する1において、0.1％BSAを含むPBSで6×彼のマウスモノクローナル抗体を希釈する：1,000希釈。 ：10,000希釈した二次抗体を調製するために、1に0.1％BSAを含むPBS中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗マウスIgG（H + L）を希釈します。 </li><li>製造業者の指示に従って試薬A及びBを混合しTMB溶液を調製します。 </li><li>室温で蒸留水と店舗5 N硫酸（H 2 SO 4）を添加することにより停止溶液を調製します。 </li></ol> 2.酵素免疫測定法（ELISA） 注：ELISA（直接的LRA、 図1）は、受容体-リガンド結合親和性の測定値として、受容体-リガンドの解離定数（K D）を測定するために使用することができる直接リガンド-受容体相互作用。競争リガンド-受容体相互作用をELISA（競争LRA、 図2）すべてリガンドと受容体との間の相互作用を妨害するように作用するペプチド（および他のブロッキング化合物）、のスクリーニングOWS。以前は5公開された基本的なプロトコルをさらに最適化しました。 注：方法は、各工程において、96ウェルプレートのウェルに溶液を添加するためのマルチチャンネルピペットを使用するELISAの両方で。ソリューションのデカントまたは洗浄工程では、シンクに直接ソリューションを捨てます。 <ol><li>直接リガンド - 受容体相互作用アッセイ（直接LRA） 注：ワークフローの説明のために（ 図1を参照）。 <ol><li>組換え受容体を有するコーティングプレート<ol><li> 100 ngの/μlの最終濃度になるように炭酸緩衝液中の組換え受容体を希釈します。よくマルチチャンネルピペットを使用して、それぞれに100μlのピペッティングすることによって固定された受容体濃度（100 ngの/μl）を96ウェルマイクロタイタープレートのコートウェル。よくエッジアーチファクトを回避するために、プレートの外側の壁を除外します。蓋付きのプレートをカバーし、インキュベート4°CO / Nでプレート。 </li></ol></li><li>ブロッキングとリガンドの追加<ol><li>翌日、シンクに対してプレートを傾けることによってコーティング溶液を除去し、洗浄溶液（PBS + 0.05％（v / v）のツイーン20）でプレートを3回洗浄します。 </li><li>よくマルチチャンネルピペットを使用して、それぞれに5％BSA溶液200μlを使用してコーティングされたプレート中の遊離受容体結合部位をブロックし、室温で2時間静置します。 </li><li>ブロッキング溶液を捨て（ステップ2.1.2.1を参照してください。）及び洗浄液でプレートを3回洗浄します。 </li><li>異なる濃度（ 例えば、8 / mlの、4 / mlの、2 / mlの、1 / mlの、0.5μgの/ mlの、0.25μgの/ mlで、0.125μgの/ mlで、0.063μgので組換えHisタグリガンドを準備/ PBS mlの、0.031 / mlの、0.0 / mlの）。ブランクウェルにPBSのみを追加します。 </li><li>二連のウェルに各リガンド濃度の100μlを添加して、受容体 - リガンドを可能に室温で2時間プレートをインキュベートインタラクション。 </li></ol></li><li>抗体とのインキュベーション<ol><li>リガンドとのインキュベーション後、洗浄溶液でプレートを3回洗浄します。 </li><li>ピペット一次抗Hisマウスモノクローナル抗体溶液（1：1,000）を100μl各ウェルに。 </li><li>室温で2時間プレートをインキュベートします。インキュベーション後、（ステップ2.1.2.1を参照）。抗体溶液を捨て、洗浄溶液でプレートを3回洗浄します。 </li><li> HRPの100μlのを追加したヤギ抗マウスIgG二次抗体溶液（1：10,000）連結された各ウェルに。 RTで45分間プレートをインキュベートします。 </li><li>抗体溶液を捨てる（ステップ2.1.2.1を参照してください。）及び洗浄液でプレートを3回洗浄します。 </li></ol></li><li>基板開発の追加<ol><li> RTにTMB基質溶液を持参し、1でTMB基質溶液AとBを準備：1の比率。各ウェルに100μlのを新しく調製した基質を加え、15〜30分間、室温でプレートを保持します。十分COL後<html>または開発は、50μlの停止溶液を追加します。 </li></ol></li><li>プレートおよびデータ分析を読みます 注：記載されたプロトコルは、測定された信号は、特異的な結合から上昇するという仮定に基づいています。信号に非特異的結合の寄与を推定する必要があるかもしれませんが、これは、このプロトコルの範囲外です。 <ol><li>直接450nmでの吸光度（光学密度、OD）を読みます。 </li><li>測定されたOD値からバックグラウンド信号を減算し、それらを正規化します。対数目盛（ベース10、10をログに記録）にリガンド濃度のすべての値を変換します。 </li><li> （X軸、10 logスケール）リガンド濃度の対数に対して正規化し、バックグラウンドOD値（Y軸は、占有受容体結合部位の割合に相当する）を補正プロット。 </li><li> K D値を推定するために、Hillの式の次の形式にデータをフィット： tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; 注：ここでYは、占有受容体結合部位およびY maxの最大結合の割合を示し、 [L]は遊離リガンドとヒル係数の濃度を意味します。リガンドのための唯一の結合部位が存在する場合は、ヒル係数nは、複数のリガンド結合部位を備えたシステムの場合= 1、結合展示正の協同である場合はN&gt; 1、負の協同場合はN &lt;1かつnがない場合は、協同= 1微視的解離定数と呼ばれ、最大半減有効濃度EC 50 6に相当します。見かけの解離定数K D =（K D）nです。最も簡単な場合はn = 1で、受容体結合部位の半分が占有及びK D = K Dされるときのリガンド濃度の解離定数に相当します。このモデルは平衡条件下で結合質量作用を想定し、同様のごく一部こと追加されたリガンドは、受容体に結合している、すなわち、[L] &gt;&gt; [RL]。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> 図1. 直接リガンド-受容体相互作用アッセイ（直接LRA）。直接LRAのためのステップバイステップのプロトコル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>競争リガンド - 受容体相互作用アッセイ（競争LRA） 注：ワークフローの図については、 図2を参照してください競争LRA手順は、リガンドにおける重要な変更点を除いて直接LRA（プレートをコーティングし、抗体インキュベーション、プレートの開発）と同じ手順に従っており、追加のステップをペプチド。適切なネガティブコントロールは、このアッセイのために不可欠です。前のスクリーニング研究では&lt;SUP&gt; 4、スクランブルブロッキングペプチドは拮抗作用を示しませんでした。 <ol><li>ブロッキング - リガンドと遮断ペプチドの追加を<ol><li>翌日、コーティング溶液を除去し、（2.1.2.1を参照）、プレートを洗浄します。 </li><li>各ウェルに、5％BSA溶液200μlを加えることによって、コーティングされたプレートをブロックし、室温で2時間、プレートをインキュベートします。 </li><li> PBS中の固定濃度（2X-20 ngの/ mlの）で組換えHisタグ付きリガンド（IFNL1-3）を準備します。 </li><li>用量反応曲線を保証するために10 nMでから、PBS中100μMの範囲の異なる濃度のブロッキングペプチド（ 表3参照）を準備します。 注：これは、ブロッキングペプチドのIC 50値のその後の決意を可能にします。対照ウェルでは、最大（100％）の結合を誘導するためにペプチドなしのみ固定リガンド濃度を追加します。ブランクでは、リガンドまたはペプチドなしでPBSのみを追加します。 </li><li>リガンド（IFNL1-3）50μlの各PEの50μLを追加重複のウェルにptide濃度。 </li><li> RTで2時間静置します。 </li></ol></li><li>プレートおよびデータ分析を読みます 注：記載されたプロトコルは、測定された信号は、特異的な結合から上昇するという仮定に基づいています。信号に非特異的結合の寄与を推定する必要があるかもしれませんが、これは、このプロトコルの範囲外です。 <ol><li>直接450nmでの吸光度（光学密度、OD）を読みます。 </li><li>測定されたOD値からバックグラウンド信号を減算し、それらを正規化します。対数目盛（ベース10、10をログに記録）にペプチド濃度のすべての値を変換します。 </li><li> （X軸、10 logスケール）リガンド濃度の対数に対して正規化し、バックグラウンドOD値（Y軸は、占有受容体結合部位の割合に相当する）を補正プロット。 </li><li> IC 50値を推定するために、以下の式にデータをフィットします。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> 注：ここでは[P]ペプチド濃度及びヒル勾配です。ヒルスロープは、用量反応曲線の勾配を記述する。 IC 50は、リガンドと受容体との結合の50％阻害が観察された阻害剤濃度に相当します。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> 図2.競争リガンド-受容体相互作用アッセイ（競争LRA）。競技LRAのためのステップバイステップのプロトコル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A.E.は「SNSFAmbizione Score」プログラム（PZ00P3_154709）、「Forschungsfond、Förderung strategischer Projekte」バーゼル大学、Stiftungsinfektionskrankheiten Basel、およびBangeter Rhyner Stiftungからの研究助成金によってサポートされました。J.L.は、システム生物学プログラム（9thコール）のSystemsX.chイニシアチブのiPhDフェローシップによるサポートを認めています。

ELISAは多くの研究室のための標準的かつ十分に確立された方法です。我々はさらに修正され、以前に発表された方法5,7を改善しています。実証ステップバイステップのプロトコルは、リガンド-受容体相互作用のK D値を決定するための簡単な方法で使用することができる方法を示しています。また、リガンド - 受容体相互作用を妨害するブロッキングペプチドのIC50を決定することができます。 ほとんどの研究者が前にELISAプロトコルを使用していたとして主な利点は、迅速なセットアップ、試薬およびおなじみの取り扱いの容易な準備です。直接LRAプロトコルは非常に柔軟であり、多くのタンパク質 - タンパク質相互作用を測定するように適合させることができます。 His6-または代替タグを持つ組換えタンパク質が固定化されたパートナーへの結合パートナーとして使用されるべきです。 LRAは、（i）のスクリーニングツールとして活用することができる競争が阻止化合物（ペプチド、抗体、または小モルの阻害能力を決定しますecules）および（ii）受容体またはリガンドを模倣するよ...

シグナル伝達経路の包括的な理解は、リガンド - 受容体相互作用についての詳細な知識が必要です。その特定の受容体と特定のリガンドとの相互作用を評価するためのほとんどの方法は、高価な、時間がかかり、労働集約的であり、特定の機器と専門知識1を必要とします 。 直接リガンド - 受容体相互作用アッセイ（LRA）と競争LRA：この記事では、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）に基づいて、リガンド - 受容体相互作用を調査するために、2つの高速かつ信頼性の高いポイントバイポイントプロトコルについて説明します。 ELISAは、日常的にほとんどすべての研究室で使用される高度に敏感な特定の、容易に入手できる技術です。 ELISAを実施し、様々な様式で適合させることができます。提示プロトコルは異なるラムダインターフェロン（INFLs）とその受容体との間の相互作用の調査のために最適化されています。 直接LRAはquantificatiを可能にしますリガンド - 受容体のリガンド濃度に対して結合し、従って、結合曲線が得られます。リガンド-受容体相互作用のための適切なモデルを使用して、データは、さらに、解離定数（K D）を推定するために分析することができます。 提示されたプロトコルでは、一般的に使用されるHillの式は、リガンド - 受容体結合をモデル化するために適用されます。このような表面プラズモン共鳴技術2,3のような他の方法は、2つのタンパク質間の結合親和性の決意を可能にするが、この技術は、しばしば、労働集約的で、高価であり、特別な実験装置を必要とします。 競争LRAは、阻害ペプチドのスクリーニングを可能にします：リガンド - 受容体結合は、ペプチド濃度に対して定量化されます。これは、ペプチドの阻害効果を説明する用量応答曲線をもたらします。データはさらに、半最大阻害濃度（IC 50を推定するために分析することができます</サブ&gt;）ブロッキングペプチド。 両方のELISAプロトコルを使用するのは簡単であり、研究課題の広い範囲に適合させることができます。任意の種類の組換えタンパク質は、確実かつ迅速な相互作用部分を決定することができます。また、競争LRAは、リガンドまたは受容体のいずれかを模倣するように設計されたブロッキングペプチドを用いて、リガンドと受容体の重要な相互作用部位を決定するために用いることができます。ブロッキングペプチドが効率的かつ特異的阻害を示した場合、ペプチドは、リガンド（ペプチド模倣受容体の場合）またはリガンド（ペプチド模倣リガンドの場合）のの重要な相互作用部位を占めています。 最初のプロトコルが異なるINFLsのK D値の決意と直接LRAを使用して、それらの受容体、 すなわち、インターロイキン28受容体（IL28RA）のαサブユニットを説明します。次に、第二のプロトコルは、20アミノ酸長のペプチドの能力を決定する方法を示していますINFL-IL28RAの相互作用を阻害します。ペプチドは、それらの受容体結合部位でIFNLsと競合するように設計され、したがって、相互作用の分子的理解を可能にします。さらに、このペプチドは、下流のシグナル伝達の効果4への影響を決定するためのin vitro実験においてIL28RAをブロックするために使用することができます。

```html
<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>ELISAプレート</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>ELISAプレートコーティングバッファー用</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>ELISAプレートコーティングバッファー用</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>ブロッキング用PBS中の5% BSA</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>組換えヒトインターロイキン-28受容体アルファ</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>組換えヒトインターロイキン-29/キャリアフリー/C末端10-Hisタグ</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>組換えヒトインターロイキン-28A/キャリアフリー/C末端6-Hisタグ</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>組換えヒトインターロイキン-28B/キャリアフリー/C末端6-Hisタグ</td></tr><tr><td>6x His Monoclonal antibody (Mouse)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Hisタグ付きリガンドを捕捉する一次抗体</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>メチレンペルオキシダーゼ共役二次抗体</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reagent set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA - TMB基質溶液</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H2SO4（酵素反応停止溶液）</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Microplate reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>ELISAプレートリーダー</td></tr></tbody></table>
```

elisaベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

シグナル伝達経路を包括的に理解するには、リガンド-受容体相互作用に関する詳細な知識が必要です。この記事では、リガンド-受容体相互作用の研究のための酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）の2つの迅速で信頼性の高いポイントバイポイントプロトコルについて説明しています：直接リガンド-受容体相互作用アッセイ（LRA）と競合LRAです。症例研究として、異なるラムダインターフェロン（IFNL）とその受容体のアルファサブユニット（IL28RA）の相互作用についてのELISAベースの分析が提示されています：直接LRAは受容体とIFNリガンド間の解離定数の（KD 値）の決定に使用され、競合LRAはIFNリガンドの受容体結合部位で競合するように設計されたオリゴペプチドの阻害能力の決定に使用されます。KDと半数阻害濃度（IC50）値を推定するための分析ステップが説明されています。最後に、この方法の利点と欠点を強調し、結果がリガンド-受容体相互作用のより良い分子的理解をどのように可能にするかを議論しています。

INFL1-3とその受容体αサブユニットIL28RA間の解離定数は、直接LRAを用いて決定しました。結果を図3に示されている：占有結合部位の割合は、各IFN濃度の対数に対してプロットしました。データのスキャッチャードプロットは、右下隅に表示されます。結果は、直接LRAは、さらにK D値を推定するために分析することができる結合曲線を生じることを示しています。 K D値は、Hillの式（式1）にデータを当てはめることによって決定しました。 IFNL1はIFNL2とIFNL3続い最も高い結合親和性を持っています。ヒル係数n&gt; 1は、初期のリガンド - 受容体相互作用（説明を参照）した後、追加のリガンドに対する親和性を増加させたことを示唆しています。推定された解離定数及びヒル係数は、表にまとめられています<html> ...

提示されたプロトコルは、リガンド-受容体相互作用の迅速な調査のための酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）ベースの技術を2つ記述しています：最初のアッセイは、リガンドと受容体間の解離定数の決定を可能にします。2番目のアッセイは、リガンド-受容体相互作用のブロッキングペプチドの迅速なスクリーニングを可能にします。

ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

このELISAベースの方法の目的は、まずサイトカインの受容体への結合親和性を決定し、次に阻害ペプチドによるリガンド-受容体相互作用の阻害効果を測定することです。この方法は、サイトカイン-受容体結合など、タンパク質間相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。結合親和性とその阻害は、相互作用力学の一般的な理解を深める可能性があります。この技術の主な利点は、実行が簡単で、ラベル付き受容体を生成し、ELISAリーダーなどの容易に利用可能なアクセスにより比較的安価であることです。この方法はサイトカイン受容体相互作用への洞察を提供できますが、一般的なタンパク質間相互作用や特定の相互作用を阻害するためのブロッキング化合物の設計など、他のシステムにも適用できます。テキストプロトコルに記載されているように溶液を調製してください。炭酸コーティングバッファーを0.22ミクロンのPES膜でフィルタリングしてください。真空を使用してください。また、各リガンドまたはペプチドの10種類の濃度を作ってください。このビデオでは、2つのアッセイが説明されています。1つ目は直接的なリガンド受容体相互作用ELISAです。これは、受容体-リガンド解離定数を測定するために使用でき、受容体-リガンドの結合親和性を表します。2つ目のアッセイは、最近最適化された競合リガンド-受容体相互作用ELISAです。これにより、受容体-リガンド相互作用を妨害するペプチドやその他のブロッキング化合物のスクリーニングが可能になります。効率のために、96ウェルプレート用に多チャンネルピペットを用意し、デカンティング時には内容物を捨ててください。この手順は、組換え受容体でプレートをコーティングすることから始めます。まず、受容体を炭酸バッファーで100ナノグラム/マイクロリットルに希釈します。次に、プレートのウェルに100マイクロリットルの受容体溶液をロードします。プレートの端の効果を避けるために外壁は除外してください。プレートをカバーし、4度セルシウスで一晩インキュベートします。プレートのインキュベーションはすべて、ゆっくりと振って行います。翌日、コーティング溶液を取り除き、プレートを洗浄溶液（PBSに少量のTween 20を加えたもの）で3回洗浄します。次に、200マイクロリットルの5％PSAを加えて、受容体の遊離結合部位をブロッキングします。プレートを室温で2時間インキュベートしてブロッキングを完了させます。後でウェルを空にし、以前のようにプレートを洗浄します。次に、ウェルに組換えヒス-タグリガンドの様々な希釈液を100マイクロリットルロードします。各濃度を複製でロードします。ブランクウェルにはPBSのみをロードします。その後、プレートを室温で2時間インキュベートします。リガンドとのインキュベーションの後、プレートを洗浄溶液で3回洗浄します。次に、各ウェルに一次抗ヒスマウスモノクローナル抗体を100マイクロリットルのアリコートをピペットで入れ、プレートを室温で2時間インキュベートします。抗体を洗い流した後、各ウェルに100マイクロリットルのHRPカップリングヤギ抗マウスIGG二次抗体溶液を加えます。プレートをアルミホイルで包み、光を避けます。その後、プレートを室温で45分間インキュベートします。標準的な洗浄技術を使用して二次抗体を除去します。次に、各ウェルに新鮮に調製したTMB（等量の基礎溶液AとBから作られる）を100マイクロリットル加えます。次に、プレートを室温で15〜30分間保持します。十分な色が現れたら、各ウェルに50マイクロリットルの基礎溶液を加えます。プロトコルは、メッセージ信号が特定の結合から上昇するという仮定に基づいています。信号への非特異的結合の寄与を推定する必要がある場合があります。次に、プレートの吸光度値を450ナノメーターで読み取り、KD値の計算に進みます。競合LRA手順は、直接LRA手順と同じステップに従いますが、いくつかの重要な変更があります。プレートから過剰なコーティングリガンドを洗い流した後、プレートウェルをブロッキングします。各ウェルに200マイクロリットルの5％BSA溶液を加えて、プレートを室温で2時間インキュベートします。インキュベーション中、PBSで組換えヒス-タグリガンドを10ナノグラム/ミリリットルの固定濃度で準備します。次に、10ナノモラーから100マイクロモラーの範囲で、ブロッキングペプチドをPBSで異なる濃度で準備し、用量反応曲線を確保します。このようにして、ブロッキングペプチドのIC50値を見つけることができます。コントロールウェルでは、最大結合を得るためにペプチドなしの固定リガンド濃度をロードします。ブランクウェルでは、リガンドやペプチドなしのPBSのみを加えます。他のウェルでは、リガンドを50マイクロリットルと各ペプチド濃度を50マイクロリットル加えます。その後、プレートを室温で2時間インキュベートし、通常通り進めます。直接LRAを使用して、3つの異なるインターフェロンリガンドペプチドと受容体アルファサブユニットIL28R-aの間の解離定数が決定されました。占有結合部位の割合を、対応するインターフェロン濃度の対数に対してプロットします。これらの結果は、ヒル方程式にデータを当てはめてKD値を推定するために分析できる結合曲線を示しています。Scatchardプロットは、リガンド結合における協調性を示しており、最終的にインターフェロンリガンド1が最も高い結合親和性を持ち、次いでインターフェロンリガンド2、インターフェロンリガンド3が続きます。1を超えるヒル係数値は、初期のリガンド受容体相互作用後に追加のリガンドに対する親和性の増加を示唆しています。次に、競合LRAを使用して、インターフェロンリガンドペプチドと受容体サブユニット間の相互作用に対するブロッキングペプチドの影響を定量化しました。インターフェロンリガンドペプチドの10ナノグラム/ミリリットルでの占有結合部位の割合を、インターフェロンペプチド濃度の対数に対してプロットします。これらのデータから、IC50値が推定されました。計算された値によると、ブロッキングペプチドはインターフェロンリガンド3とIL28R-aの間の相互作用を最も大きく阻害しました。この技術を習得すれば、適切に実行すれば8時間で完了します。この手順を試みる際には、この手順に従って、各リガンド受容体結合の飽和濃度を測定し、他の方法を用いてより詳細なKD値を得ることも重要です。この技術の開発後、リガンド-受容体相互作用の分野の研究者が、これらの相互作用をブロックする阻害物質を探索する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶELISAベースの結合法と競合法を用いて、サイトカインと受容体の結合親和性と阻害ペプチドの効果を測定する方法。タンパク質間相互作用の動態理解に有用です。

ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

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