Name: （A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶBSL-4実験室での安全なプラークアッセイ操作手順。クラスIIバイオセーフティキャビネットの清掃、消毒、廃棄物処理、オートクレーブ滅菌の方法を含む。研究者が高封鎖環境でウイルス検査を安全に実施するためのプロトコルです。

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この出版物の内容は、必ずしも米国保健社会福祉省(DHHS)または著者と提携する機関や企業の見解や方針を反映しているわけではありません。この研究は、バテル記念研究所と米国国立アレルギー感染症研究所(NIAID)との一次契約を通じて部分的に資金提供されました。HHSN272200700016I。M.R.H.、D.P.、L.B.、K.J.、J.W.は、バテル記念研究所の従業員としてこの仕事をしました。この作業を行ったバテル記念研究所の下請け業者は、MRI Globalの従業員としてのS.M.です。MGLはLovelace Respiratory Research Institute、Inc.の従業員として。J.H.K.は、Tunnell Government Services, Inc.の従業員です。

1.研究室のエントリ<ol><li>前BSL-4実験室への参入実験のためのBSL-2実験室（ 例えば 、細胞、培地、および消耗品）からすべての電源を収集します。 </li><li> （参照7に詳細に概説）BSL-4エントリの手順を実行します。 </li></ol> BSL-4実験室のクラスII安全キャビネットの調製<ol><li>一度BSL-4実験室の内部で、毎日の内部チェックリスト（ 図1）が完了していることを確認します。チェックリストは、以前に記入し、ウイルスが使用されるかを示すされていない場合は、チェックリストを完了します。チェックリストは既に完了している場合は、名前を追加し、そのウイルスがリストに使用されます。 </li><li> （5％重四級アンモニウム消毒液で、例えば 、n-アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、n-アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム（サッシなど）BSCの内部全体を下方噴霧によるクラスII BSCを清掃塩化物または使用されているエージェントの他の消毒剤の適切な）とペーパータオル10,11で拭いてください。粘着性の消毒液を除去するために、キャビネット及びサッシの内側70％エタノール溶液を噴霧します。 </li><li>着席した場合、キャビネットの背面に到達することができることと研究室の専門家の顔が前面開口（ 図2）11 の上方に位置していることを確実にするために快適な高さでクラスII BSCの前に椅子を設定します。 </li><li>安全キャビネットのための廃棄物容器を準備します。廃棄物容器内の二重の四級アンモニウム消毒液の最終濃度がノー5％未満であることを確認してください。それに応じて計画し、廃棄物の消毒剤を希釈することが追加される10％溶液を作ります。また、中およびアッセイの完了後に前に除去し、手袋をはめた手に任意の項目を噴霧するクラスII BSC内部の5％デュアル四級アンモニウム消毒液でスプレーボトルを置きます。 </li> &lt;李&gt;は空気の流れ11のクラスII BSCと混乱の中に繰り返される材料の導入を回避するためにまでさかのぼる可能な限りキャビネットのクラスII BSCで全体の実験のために必要な適切な材料を配置します。 </li></ol> 3.例：プラークアッセイ<ol><li>手で記憶場所からウイルス含有試料及び対照ウイルスを取り出し、37℃のインキュベーター中で材料を解凍。 </li><li>計画されたウイルスの希釈に従って使用する6ウェルプレートのウェルにラベルを付けます。ふたと本体が分離されている場合は成功したマッチングを確実にするために、プレートの蓋と本体をマークします。 </li><li>クラスII BSCへのステップ3.1から3.2から材料を持参してください。持っていない、または他の側（「汚れた側」）上の1つの側面（「クリーンサイド」）上のウイルスや廃棄物に接触して来ることはありませんすべての項目を配置します。可能な場合、エアロゾル発生の活動の1の間に離れて「汚れたアイテム」から「クリーンなアイテム」は、少なくとも30センチメートルを保ちます1。 </li><li>内部の中心が身11を保護する最も効果的な位置になるように設計されているように、できるだけクラスII BSCの内部中央に近い動作します。 </li><li>ウイルスサンプルの50μlのを削除し、ウイルスを制御し、2％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地450μlの中に置きます。必要に応じて（ 図3A）外にまで段階希釈液を作るに進みます。 </li><li>試料中の気泡発生を最小化しようとしたときの希釈液中に、ゆっくりと慎重にピペットチップでウイルスサンプルを少なくとも5回混ぜます。次の希釈ウェルにそれぞれ添加した後にピペットチップを変更します。 </li><li>最後の希釈では、サンプルを5回混合した後、希釈液の等容量を確保するために、廃棄物容器へのウイルスのサンプルを50μlを捨てます。 </li><li>ヒントを廃棄する場合は、追放する前に、先端の内側と外側を除染するために廃棄物のバケツからの消毒液で各チップをすすぎ廃棄物のバケツに先端をる。 </li><li>希釈が行われた後、脇希釈ウェルを設定し、6ウェルプレートの各ウェル内の培地を500μlを残し、細胞培養プレートのウェルから培地を吸引し始めます。 </li><li>マニュアル、調整可能なボリュームを使用して、ピペットの上部に廃バケットからピペットチップ、吸引消毒液が終了したら、プッシュボタンのピペットを、ピペットの内側の適切な除染を確実にします。実験終了まで廃棄物バケツにチップを置きます。 </li><li>メディアがプレートから除去された後、各サンプルのためのヒントそれぞれを変え、二重に予め標識プレートに適切なウェルに正しい100μlの試料を追加します。 </li><li>プラークアッセイの接種が完了すると、消毒液で手袋をはめた手をオフにスプレーし、手でインキュベーターに戻し、プレートを配置する前に、すべてのプレートの外側を拭いて消毒液を染み込ませた紙タオルを使用しています。リすべてのプレートがバックインキュベーターになるまで、このプロセスを泥炭。 </li><li> 1時間ごとに15分の細胞を超えるサンプルの適切な分散を確実にするために8の字運動でプレートを揺らし。 </li><li>ロッキングプレートが完了すると、プラークアッセイのオーバーレイに使用する2倍イーグル最小必須培地の混合物と1.6％のトラガント、アガロースよりも操作が容易である半固体オーバーレイと共にクラスII BSCにプレートを返します。 </li><li> 6ウェルプレート中の各ウェルにオーバーレイ混合物の2ミリリットルを加え、ウェルの表面全体にオーバーレイの平等な分配のための8の字運動に再び岩。よく使用されるすべてのオーバーレイの混合物でオーバーレイされるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li>血清学的ピペットの先端がオーバーレイ手順を実行する際、交差汚染を避けるために、ウェル内の任意の液体に触れていないことを確認してください。 </li></ol> 4.廃棄物の処理および清掃楽器や安全キャビネットの &lt;オール&gt; <li>完全に、少なくとも10分の接触時間の浪費バケット5％の殺菌剤溶液中のすべての廃棄物を水没。ピペットチップ、血清学的ピペット、および上記のように他の廃棄物を消毒します。また、5％の消毒液で（内と外）廃棄物のバケツをスプレー溶液を10分の接触時間のために廃棄物のバケツと接触したままましょう。 </li><li>廃棄物のために経過するの接触時間を待っている間、5％の消毒液で紙タオルを浸し、このようなマイクロピペットなどの器具を拭う、およびBSCから削除します。クラスII BSCのうち、手袋をはめた手を持って来る前に、5％の消毒液で手袋をはめた手をスプレーしてください。 <ol><li> BSCからマイクロピペットを除去した後、商品に粘着性の蓄積を避けるために、70％エタノール溶液で別々の紙タオルで拭いてください。効果的に5％の消毒剤で拭きすることはできません任意の楽器をスプレーし、10分間BSC内の溶液と接触しておきます。 </li></ol></li><li>十分な接触時間の後、BSCからすべての項目を削除します。シンクに、廃棄物を含む廃棄物のバケツを含むアイテムを取ります。消毒剤の残留物を除去するために再利用することができるアイテムをすすぎます。その記憶場所にすべての項目を返します。 </li><li>クラスII BSCの作業面、キャビネットの側面を清掃し、バック、ガラスの内部、および5％の消毒液とのサッシ1は、70％のエタノール溶液を添加しました。 </li><li>引き出して、オートクレーブ処理のために別々のピペットトレイへの廃棄物のバケツと場所の表面消毒血清学的ピペットからの血清学的ピペットをドレイン（血清学的ピペットは、鋭利物の危険性を提示することができるし、ゴミ袋を通って引き裂くことがあります。前に、ハード両面の容器にこれらのピペットを配置オートクレーブ処理）。 </li><li>ヒートシンクの下部に配置されたストレーナーに廃棄物のバケツの内容を注ぎます。 </li><li>シンクに赤バイオハザードバッグが並んでいますバイオハザード廃棄物容器を持参し、straineの内容をダンプ赤バイオハザードバッグにrを。ストレーナの内側に付着することがマイクロピペットのヒントを削除するには、ストレーナーに手を入れないでください。すべてのヒントが削除されるまで、廃棄物容器の内側に沿ってストレーナーを打つ、またはストレーナからヒントを削除するには、ピンセットを使用しています。 </li><li>シンクの横の棚に乾燥するために廃棄物のバケツと場所をすすぎます。 </li></ol> 5.オートクレーブ廃棄物<ol><li>カートにオートクレーブトレイにバイオハザード廃棄物容器と場所からバイオハザードバッグを取り出します。 </li><li>トレイに固定袋を保つためにオートクレーブトレイの側面を接続する、オープンバイオハザードバッグのままにして、袋の外側をオートクレーブテープ片を配置します。 </li><li>血清学的ピペットチップトレイにオートクレーブテープの2枚を置き、自分のイニシャルと日付で、それをラベル。オートクレーブトレイ付きカート上の血清学的ピペットトレイを置きます。 </li><li>オートクレーブを開きます。提供オートクレーブのロード/アンロードCAを接続しますオートクレーブを室温、カートに残りの部分に格納式オートクレーブプラットフォームを引き出します。 </li><li>オートクレーブから金属棒を取り外し、上部を開きます。オートクレーブ滅菌サイクルが正常に完了したことを確認するために金属棒にゲオバチルス・ステアロサーモフィラスの胞子を含む生物学的インジケータバイアルを置きます。 </li><li>オートクレーブトレイ内の廃棄物袋の中央に金属棒を置きますが、金属棒はまだ簡単にアクセス可能であることを確認してください。 </li><li>格納式オートクレーブプラットフォームに廃棄物と血清学的ピペットトレイを充填したオートクレーブトレイを置き、バックオートクレーブ内に押し込みます。 </li><li>オートクレーブからオートクレーブロード/アンロード・カートを切り離し、オートクレーブドアを閉じます。 </li><li>オートクレーブを開始します。 </li><li>サイクルが開始されるまでオートクレーブを放置しないでください。オートクレーブの操作画面は、その実行のために残り時間が表示されます。 </li><li>オートクレーブの実行が完了した後に、生物学的INDを削除icatorし、指定されたインキュベーター中で加熱することによって成長のために評価します。成長は、生物学的指標に検出された場合、オートクレーブ内のゴミを再実行し、新たに指標を評価します。全く成長が検出されない場合、施設からゴミを取り除きます。 </li></ol> 6.例：固定とプラークアッセイの染色<ol><li>合格している（使用されるウイルスに依存する）適切な日数後、研究室に戻って戻り、再びセクション1と2の手順を実行します。 </li><li>慎重にステップ3.1.2で完了インキュベーターからプラークアッセイプレートを取り外し、手でクラスII BSCに配置します。 </li><li>メディアやオーバーレイ材料のすべてをオフピペットと消毒液容器に分与し、10％中性緩衝ホルマリン、0.8％クリスタルバイオレット12,13の混合物と交換してください。混合物をプレート上のウイルスを不活性化するために30分間、プレート上に残ってみましょう。 </li><li>不活化した後、慎重に中立を削除個別の廃棄物容器内の緩衝ホルマリン/クリスタルバイオレットの混合物と場所は、廃棄前に中和されます。 </li><li>消毒剤で手袋をはめた手をスプレーし、上記のようにクラスII BSCからそれらを渡す前に、板の外側を拭いてください。 </li><li>シンクに進み、余分な汚れを除去するために、プレートを洗浄し、その後乾燥させるために、カートにプレートを配置します。 </li><li>プレートが完全に乾燥したら、プラークをカウントするライトボックスを使用します。すべてのカウントを記録し、標準式（ 図3B）からのウイルス力価を計算します。 </li></ol> 7. BSL-4実験室からのサンプルを削除します<ol><li> BSL-2実験室条件下で操作される任意のサンプルを不活性化します。 10％中性緩衝ホルマリン（NBF）またはトリゾールLS（フェノール、グアニジンイソチオシアネート、チオシアン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、グリセロール）1,14を使用して、IRF-フレデリックの内部バイオセーフティ事務所によって承認された二つの方法のいずれかに従ってください。転送SABSL-4実験室からの除去のためのパッケージングの前にBSCの外に新しい清潔なチューブまたはプレートにmples。 </li><li>バッグの内側とBSL-4実験室の外に移転を受けた試料管の外側を消毒するのに十分な5％の消毒剤または固定剤溶液を含有するヒートシール袋内チューブまたはプレート内のヒートシール不活性化されたサンプル。同様の手順で別の袋にこの袋を置きます。 </li><li>第二の袋を密封し、ヒートシールパウチの外側を消毒するために、少なくとも10分間、5％の消毒液を含むダンクタンクにヒートシールされたポーチを配置します。 </li><li> 、管の数や大きさを描くことで、ラボの内部ダンクタンクのログブックを記入し、チューブ内の容積、使用される薬剤で、使用する不活性化方法、およびサンプルが転送される場所への部屋。 </li><li>ダンクタンクから袋を取り出し、BSL-2実験室にサンプルを取るためにBSL-4実験室の外側に同僚と調整。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

BSL-4実験室での作業はかなりの時間と細部への追加の注意を払う必要があります。この環境での作業のいずれかのタイプがよく徹底し、訓練を受けた、と良心的な人が必要です。アッセイは、実験室での労働者が訓練を受けなければならない、いくつかの主要な概念を伴うような標準的なウイルスプラークアッセイは、BSL-4実験室で高結果の病原体を扱うための一般的な手順の正確なモデルを提供します。 最初の主要な概念は、高結果の病原体のための第一の格納容器として機能クラスII BSC、中の安全慣行の適切な使用およびアプリケーションです。クラスII BSCの機能が大幅に個人への曝露リスクを制限する慣行を決定する方法を理解します。クラスII BSC内の作業ゾーン全体の汚染地域（「汚れた側」）へのクリーンエリア（「クリーンサイド」）からの作業の流れは、クロスコンタミネーション11を回避するのに役立ちます。清潔で汚染された材料と補遺IEはクリーンなアイテムを超える汚染されたアイテムの移動を制限するように分離する必要があります。 <p class="jove_co...

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Nicole Joselyn
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Nicole Josleyn

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Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

高結果の病原体を扱う実験者の安全性が（何の感染の予防法や治療法の選択肢が存在しない）最も重要であるように、米国保健社会福祉省は、生物医学における病原体として作業の安全な実施のための施設建設のためのガイドラインとベストプラクティスを確立しましたバイオセーフティの観点1から臨床検査室。法律や規制を通じて、慣行や手順の多くは、これらの病原体との仕事のために従わなければならない必須の要件となっています。米国、簡単に人から人へと伝達される病原体では、高い致死率をもたらし、および/または主要な公衆衛生への影響やバイオテロの可能性を持っている、アレルギー感染の健康/国立研究所の国立研究所に分類されます病（NIH / NIAID）優先度A病原体およびまたは疾病管理予防センター（CDC）バイオテロカテゴリーAエージェント2。また、Hこれらの病原体は、潜在的なバイオテロ剤である質量死傷者や経済、重要なインフラストラクチャ、または公衆の信頼3に壊滅的な影響の可能性を持っている場合IGH-結果の病原体は、ティア1選択薬として分類されます。 BSL-4実験室での研究機関へのアクセスを含むBSL-4の操作は、より高度BSL-2月3日の操作よりも制御されています。例えば、原因で、実質的なスーツのトレーニング要件、豊富な指導の要件、および追加の医療バイオセーフティの前提条件にBSL-2またはBSL-3実験室と比較して、BSL-4実験室へのアクセスを得るために、実質的にはより困難です。また、BSL-2またはBSL-3施設4-6対BSL-4施設でより多くの物理的なセキュリティの障壁は、一般的にあります。 BSL-4入口と出口の手続き上の私たちの最初の記事で概説したように、研究室のスタッフは、BSL-4実験室7に入るために修飾するために広範囲の訓練、心理的スクリーニングを受けます。 WBSL-4実験室をithin、感染症やミスの危険性が確立された手順に従うことによって回避または軽減されます。研究は、最小限のマルチタスクや気晴らしで、注意深く慎重に進まなければなりません。正圧スーツに体を曲げすることは困難であり、フェースシールドは、顕微鏡などの手順を制限することができます。かさばる手袋は、このような小物を取り扱うまたはチューブを標識として微細運動タスクのパフォーマンスを低下させます。 BSL-4実験室で費やされる時間を最小限に抑えるために、研究室の専門家は、BSL-2実験室で先に行われ、その後、タスク（複数可）の完成のためのBSL-4実験室の中にこれらの物質を輸送することができる手順を識別するために、作業手順を確認してください。 BSL-2実験室でさらに処理するために物質を除去すると、材料が固定され、密封された第2の容器内のBSL-4実験室から削除されます。除去する必要があるかもしれないサンプルの例としては、酵素結合immunosorbeによって分析される感染物質の固定されたプレートまたはチューブNTアッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ（IFA）、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）。 BSL-2実験室におけるものと比較して、BSL-4実験室に必要な個人用保護具によって課される大きな物理的な制限に加えて、細胞培養プレートで高結果の病原体の不活性化と廃棄物処理のための手順は以下の病原性ウイルスのために必要とされるものよりも厳しいですBSL-2実験室で研究。最低でも、これらの方法は、CDCの要件を満たさなければなりません。例えば、汚染された細胞培養プレートおよび他の材料は、中性緩衝ホルマリンのような化学試薬を用いて不活性化することができます。処理された細胞培養プレートまたはチューブは、液体殺菌剤が充填されたダンクタンクを介してホルマリンを含有するヒートシール用袋に入れ、実験室から除去されます。廃棄バケットは消毒液を充填し、殺菌剤は、一時的に、実験中およびDISIために発生する廃棄物を受け取るために使用されるスプレー、手袋をnfectingそれぞれ、安全キャビネット表面や器具を洗浄します。記載されている濃度の第四級アンモニウム消毒液は、すべての米国BSL-4実験室（バールJ、私信、2015）のゴールドスタンダードと考えられています。廃棄物のバケツからの固体廃棄物は、汚染の可能性を排除するためにオートクレーブ処理されます。 視覚的に一般的なBSL-4手続きのワークフローと限界を実証するための努力で、我々は一般的に使用されるウイルスの手順の例として、標準的なウイルスのプラークアッセイを使用していました。ウイルスアッセイ法は、一般的に記載されているが、我々は、このプロトコルで実験室の人員の安全を確保するために使用されるバイオセーフティ手順を強調する。プラークアッセイ技術の8,9の追加の背景については、前の古典的なプラークアッセイの視覚化を参照してください。 ここで紹介する手順は、CDC 1で概説BMBL仕様に従ってください。しかし、提示されるプロトコルは、IRF-フレデリックに固有。各BSL-4施設は、BSL-4実験室内実験の実行に影響を与える別の標準作業手順書（SOP）や操作の方法があります。プラークアッセイの廃棄物の流れの管理と実行のための代替手順では、これらの研究室の管理や操作に基づいて異なる場合があります。それにもかかわらず、BSL-4の内部クラスIIキャビネットで作業を行うためのBSL-4スーツの研究室や手順の設定の一般的な理解は、環境は、高リスクの病原体の研究を検討する際の科学者が制約と安全性への影響を理解するのに役立ちます。 BSL-4実験室での作業を取り巻く困難の外の共同研究者の意識向上が調整された期待と研究コミュニティの医療対策の開発により容易に導くことができます。

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>National Chemical Laboratories</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 96 ディープウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清ピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清ピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td>140675</tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>シグマ</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>10%ニュートラルバッファーホルマリン</td><td>フィッシャー22-050-105</td><td></td><td></td></tr>トラ<tr><td>ガカンス</td><td>フィッシャー50-702-2000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l ピペットチップ</td><td>Fisher</td><td>21-402-550</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l ピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td>21-402-561</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu;l ピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td>21-402-581</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ロンザ</td><td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマ</td><td>F2442-500mL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>2x EMEM</td><td>品質 生物学的</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>ピペットー</td><td>ドラモンド</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu;l ピペット&nbsp;</td><td>レイニン</td><td>&nbsp;L-1000XLS+</td><td></td></tr><tr><td>200 &l ピペット&nbsp;</td><td>レイニン</td><td>&nbsp;L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル、マルチチャンネル200 &mu;l ピペッター</td><td>レイニン</td><td>L12-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>8-ウェル、マルチチャンネル 1,000 &mu;l ピペッター</td><td>レイニン</td><td>LA8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>アトストエクスプレス</td><td>メディカルサプライ&nbsp;</td><td></td><td></td>MMM12192</tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ バッグ</td><td>フィッシャー</td><td>01-828E</td><td></td></tr><tr><td>2,000 ml ビーカー</td><td>フィッシャー</td><td>02-591-10H</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ トレイ</td><td>フィッシャー</td><td>13-359-20B</td><td></td></tr><tr><td>ピペット トレイ</td><td>フィッシャー</td><td>13-361-5</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cインキュベータ</td>ー<td>フィッシャーWU-39321-00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオハザード缶</td><td>ラバーメイドコマーシャル</td><td>FG614500 RED</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブテープ</td><td>フィ</td><td>ッシャー15-903IRF</td><td></td></tr><tr><td>施設製の</td><td>オートクレーブロッド</td>N <td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>ライトボックス</td><td>フィ</td><td>ッシャーS11552</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシーラー</td><td>フィッシャー NC9793612</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシールポーチ</td><td>フィ</td><td>ッシャー01-812-25H</td><td></td></tr><tr><td>バイオハザードバッグ</td><td>フィ</td><td>ッシャー01-828E</td><td></td></tr></tbody></table>

（a）bsl-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

バイオセーフティーレベル4（BSL-4）封じ込め実験室での作業は時間と細部に大きな注意を払う必要があります。非高結果の病原体を持つBSL-2実験室で行われ、同じ仕事はBSL-4の設定にかなり長い時間がかかります。この増加した時間の要件が原因で、実験室で獲得感染症、潜在的な汚染から作業環境と高結果の病原体の可能性のあるリリースから地域社会からの研究者を保護することを目的としている多数の要因にあります。実験室の内部では、移動が必須のフルボディの安全スーツに取り付けられた空気ホースのために制限されています。また、クラスII安全キャビネット（BSCの）から削除されたすべての項目の消毒が必要です。研究所の専門家は、BSL-4実験室の慣行で訓練する必要があり、それらが実行されているスキルの高い習熟度を示さなければなりません。この記事の焦点は、研究室bを確保するために適切な手順と手法の概要を説明することです手順例として、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してiosafetyし、実験精度。具体的には、実験を行う際にBSL-4の環境で安全に作業するための適切な技術が視覚的に強調されます。これらの技術は、次のとおりです。実験では、適切な作業が終了し、クラスII BSCの清掃、廃棄物管理やBSL-4実験室の内部で発生する廃棄物の安全な廃棄、およびBSL-内部から不活性化されたサンプルを除去するためのクラスII BSCを設定しますBSL-2実験室に4研究室。

BSL-4実験室内の以下の適切な手順は、アッセイの安全かつ効果的な完了を確保するために重要です。完成した日ごとの内部チェックリスト（ 図1）を参照することにより、研究室のスタッフは、その機器が完全に動作していることを確認します。 BSCの中央に適切な体の位置は、実験が、最適な空気流条件（ 図2）で行われることを保証します。ウイルスサンプルを連続プレート当たり30-300プラーク（ 図3A）を有するプレートを取得し、ウイルス力価（ 図3B）を決定するために希釈されます。多くの要因は、宿主細胞株のウイルス向性、接種技術、ウイルス増殖は、適切な希釈範囲、オーバーレイ選択8の条件を含むプラークの形成に影響を与えます。手順中のBSCで発生した廃棄物が適正にする前にオートクレーブ処理することにより、従来BSCと再びからの除去に消毒されていますBSL-4環境を残します。これらの手順に従うことで、何の実験室に取得した感染は、IRF...

BSL-4実験室でのウイルスアッセイの実行は、BSL-2実験室での作業と比較して、追加の安全対策が必要なため、より複雑です。ここでは、BSL-4ラボ内で使用される慣行と手順の概要を示し、適切なクラスIIバイオセーフティキャビネットの使用、廃棄物の管理/廃棄、およびサンプルの除去を示します。

（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

本手順の全体的な目的は、プラークアッセイを例に、バイオセーフティレベル4（BSL-4）スーツ実験室で作業する際の安全な実践方法を実演することです。この手順では、BSL-4環境で標準的なプラークアッセイを実施するために必要な変更点について解説します。実演者は、統合研究施設（Integrated Research Facility）の技術者であるTracey Burdetteです。日次の内部システム点検リストを完了した後、サッシを含む内部を5%dual quaternary ammonium消毒液でスプレーし、クラスII生物安全キャビネットを清掃します。次に、ペーパータオルでキャビネット内を拭き取ります。この際、アッセイの最中および終了後に手袋を着用した手にスプレーできるよう、消毒液の入ったスプレーボトルをキャビネット内に残しておいてください。キャビネット内部とサッシに70%ethanol溶液をスプレーし、粘着性のある消毒液を除去します。バイオセーフティキャビネット用の廃棄物容器を準備します。追加される液量を考慮し、廃棄物容器内の第四級アンモニウム塩混合消毒液の最終濃度が5%以上になるようにしてください。5%第四級アンモニウム塩混合消毒液を入れた廃棄物容器を、クラスIIバイオセーフティキャビネット内に設置します。すべての操作は、クラスIIバイオセーフティキャビネットの内側中央にできるだけ近い位置で行ってください。内側中央は、作業者を保護するために最も効果的な位置となるよう設計されています。ウイルス試料およびコントロールウイルスを50 µLずつ分注し、2%胎児牛血清を含むDulbecco's Modified Eagle's medium 450 µLが入った希釈ウェルに加えてください。必要に応じて、連続希釈をさらに進めてください。希釈のたびにピペットチップを交換し、ウイルスサンプルを少なくとも5回ピペッティングして混ぜ合わせます。サンプル内で気泡が発生するのを最小限に抑えるため、ゆっくりと混ぜてください。完了後、希釈用ウェルを脇に置きます。チップを廃棄する際は、チップの内外を除染するため、廃棄バケット内の消毒液で各チップをすすいでから、チップを廃棄バケットに排出してください。6ウェル細胞培養プレートのウェルから培地の大部分を取り除きます。あらかじめラベルを貼ったプレートの適切なウェルに、適切なサンプルを100 µLずつ、2連（duplicate）で加えてください。完了後、手袋を着用した手に消毒液をスプレーしてください。消毒液に浸したペーパータオルを使用して、すべてのプレートの外側を拭き、手作業でインキュベーターに入れてください。1時間、15分ごとにプレートを8の字型に揺らし、サンプルが細胞全体に適切に分散するようにします。各ウェルに2 mLのオーバーレイ混合液を加え、再び8の字型に揺らして、オーバーレイがウェル表面全体に均一に分布するようにします。すべての廃棄物は、廃棄バケツ内の5%消毒液に完全に浸し、10分以上の接触時間を設けてください。廃棄物バケットの内外面、クラスIIバイオセーフティキャビネットの内部、機器の外装、および手袋を着用した手に5%消毒液をスプレーします。廃棄物バケットおよびその他の表面に、溶液を10分間接触させたままにします。その後、バイオセーフティキャビネットから物品を取り出し、シンクまで運びます。使用済みのピペットをオートクレーブ用のピペットトレイに入れます。廃棄バケットの中身をシンクのストレーナーに注ぎます。次に、赤色のバイオハザード袋がセットされたバイオハザード廃棄物容器をシンクまで運び、ストレーナーの中身を赤色のバイオハザード袋に捨てます。バイオハザードバッグをカート上のオートクレーブ用トレイに置きます。蒸気がバッグ内に入るよう、オートクレーブバッグの口をテープで緩く閉じます。そして、オートクレーブ用テープの1枚に、各自のイニシャルと日付を記入します。オートクレーブから穴あき金属ロッドを取り出し、上部を開けます。オートクレーブの滅菌サイクルが正常に完了したかを確認するため、Geobacillus stearothermophilusの胞子を含むバイオロジカルインジケーターバイアルを金属ロッド内に配置します。廃棄物が入ったオートクレーブトレイをオートクレーブに入れます。オートクレーブを始動し、サイクルが開始されたことを確認します。オートクレーブの操作画面に、その回の残り時間が表示されます。必要なインキュベーション期間が経過した後、プラークアッセイプレートをインキュベーターから慎重に取り出し、手で清潔なクラスIIバイオセーフティーキャビネット内に移動させます。ピペットを用いて培地およびオーバーレイ材料を吸引し、消毒液容器に廃棄します。10%中性緩衝ホルマリンと0.8%クリスタルバイオレットの混合液を培地の代わりに追加し、30分間接触させてウイルスを不活化させます。不活化後、中性緩衝ホルマリン／クリスタルバイオレット混合液を慎重に取り除き、廃棄前に中和処理を行うため、別の廃棄物容器に移します。シンクでプレートをすすぎ、余分な染料を除去した後、トレイに置いて完全に乾燥させます。ライトボックスを使用してプラーク数をカウントします。すべてのカウント数を記録し、標準式を用いてウイルス力価を算出します。不活化済みのサンプルをBSL-4ラボから搬出する場合、チューブまたはプレートをヒートシールバッグに入れます。バッグ内部に5%消毒液または固定液をスプレーし、バッグ内部およびサンプルチューブの外側を消毒します。その後、バッグをヒートシールで密封します。同様の手順に従って、このポーチを別のポーチに入れます。2枚目のポーチを熱シールし、二重に密封されたポーチを5%消毒液を含む浸漬タンクに少なくとも10分間浸し、ポーチの外側を消毒します。ラボ内の浸漬タンク記録簿に、チューブの数とサイズ、チューブ内の液量、使用した薬剤、使用した不活化方法、およびサンプルを転送する部屋を明記して記入します。バイオセーフティーレベル4実験室において適切な手順に従うことは、アッセイを安全かつ効果的に完了させるために不可欠です。実験室スタッフは、完了済みの日常内部チェックリストを参照することで、機器が完全に動作していることを確認します。ウイルスサンプルを段階希釈し、1ウェルあたり30から300個のプラークが得られるプレートを作成して、ウイルス力価を決定します。プラークの形成には、宿主細胞株に対するウイルスの向性、接種技術、ウイルスの増殖条件、適切な希釈範囲、およびオーバーレイの選択など、多くの要因が影響します。操作中にバイオセーフティキャビネット内で発生した廃棄物は、2回消毒します。また、廃棄物をバイオセーフティキャビネットから取り出す前に、一度適切に消毒してください。その後、廃棄物は動物バイオセーフティーレベル4環境から搬出される前にオートクレーブで滅菌されます。これらの手順に従うことにより、フレデリック統合研究施設における動物バイオセーフティーレベル4研究において、ラボ感染の記録はありません。適切に実施すれば、この手法はサンプル数に応じて3〜4時間で完了できます。この手順を行う際は、安全で成功裏に実験を完了させるため、希釈を正確に行い、適切にプラーク数をカウントし、すべての安全上の注意事項を遵守してください。このビデオを視聴することで、陽圧服によって課される物理的な制限と、標準的なプラークアッセイを完了するために必要となる追加の時間について、十分な理解が得られるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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ネズミ鞭虫感染症：腸内のタイプ2免疫と炎症のモデル

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（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス

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