（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス

本手順の全体的な目的は、プラークアッセイを例に、バイオセーフティレベル4（BSL-4）スーツ実験室で作業する際の安全な実践方法を実演することです。この手順では、BSL-4環境で標準的なプラークアッセイを実施するために必要な変更点について解説します。実演者は、統合研究施設（Integrated Research Facility）の技術者であるTracey Burdetteです。

日次の内部システム点検リストを完了した後、サッシを含む内部を5%dual quaternary ammonium消毒液でスプレーし、クラスII生物安全キャビネットを清掃します。次に、ペーパータオルでキャビネット内を拭き取ります。この際、アッセイの最中および終了後に手袋を着用した手にスプレーできるよう、消毒液の入ったスプレーボトルをキャビネット内に残しておいてください。キャビネット内部とサッシに70%ethanol溶液をスプレーし、粘着性のある消毒液を除去します。

バイオセーフティキャビネット用の廃棄物容器を準備します。追加される液量を考慮し、廃棄物容器内の第四級アンモニウム塩混合消毒液の最終濃度が5%以上になるようにしてください。5%第四級アンモニウム塩混合消毒液を入れた廃棄物容器を、クラスIIバイオセーフティキャビネット内に設置します。

すべての操作は、クラスIIバイオセーフティキャビネットの内側中央にできるだけ近い位置で行ってください。内側中央は、作業者を保護するために最も効果的な位置となるよう設計されています。ウイルス試料およびコントロールウイルスを50 µLずつ分注し、2%胎児牛血清を含むDulbecco's Modified Eagle's medium 450 µLが入った希釈ウェルに加えてください。

必要に応じて、連続希釈をさらに進めてください。希釈のたびにピペットチップを交換し、ウイルスサンプルを少なくとも5回ピペッティングして混ぜ合わせます。サンプル内で気泡が発生するのを最小限に抑えるため、ゆっくりと混ぜてください。

完了後、希釈用ウェルを脇に置きます。チップを廃棄する際は、チップの内外を除染するため、廃棄バケット内の消毒液で各チップをすすいでから、チップを廃棄バケットに排出してください。6ウェル細胞培養プレートのウェルから培地の大部分を取り除きます。

あらかじめラベルを貼ったプレートの適切なウェルに、適切なサンプルを100 µLずつ、2連（duplicate）で加えてください。完了後、手袋を着用した手に消毒液をスプレーしてください。消毒液に浸したペーパータオルを使用して、すべてのプレートの外側を拭き、手作業でインキュベーターに入れてください。

1時間、15分ごとにプレートを8の字型に揺らし、サンプルが細胞全体に適切に分散するようにします。各ウェルに2 mLのオーバーレイ混合液を加え、再び8の字型に揺らして、オーバーレイがウェル表面全体に均一に分布するようにします。すべての廃棄物は、廃棄バケツ内の5%消毒液に完全に浸し、10分以上の接触時間を設けてください。

廃棄物バケットの内外面、クラスIIバイオセーフティキャビネットの内部、機器の外装、および手袋を着用した手に5%消毒液をスプレーします。廃棄物バケットおよびその他の表面に、溶液を10分間接触させたままにします。その後、バイオセーフティキャビネットから物品を取り出し、シンクまで運びます。

使用済みのピペットをオートクレーブ用のピペットトレイに入れます。廃棄バケットの中身をシンクのストレーナーに注ぎます。次に、赤色のバイオハザード袋がセットされたバイオハザード廃棄物容器をシンクまで運び、ストレーナーの中身を赤色のバイオハザード袋に捨てます。

バイオハザードバッグをカート上のオートクレーブ用トレイに置きます。蒸気がバッグ内に入るよう、オートクレーブバッグの口をテープで緩く閉じます。そして、オートクレーブ用テープの1枚に、各自のイニシャルと日付を記入します。

オートクレーブから穴あき金属ロッドを取り出し、上部を開けます。オートクレーブの滅菌サイクルが正常に完了したかを確認するため、Geobacillus stearothermophilusの胞子を含むバイオロジカルインジケーターバイアルを金属ロッド内に配置します。廃棄物が入ったオートクレーブトレイをオートクレーブに入れます。

オートクレーブを始動し、サイクルが開始されたことを確認します。オートクレーブの操作画面に、その回の残り時間が表示されます。必要なインキュベーション期間が経過した後、プラークアッセイプレートをインキュベーターから慎重に取り出し、手で清潔なクラスIIバイオセーフティーキャビネット内に移動させます。

ピペットを用いて培地およびオーバーレイ材料を吸引し、消毒液容器に廃棄します。10%中性緩衝ホルマリンと0.8%クリスタルバイオレットの混合液を培地の代わりに追加し、30分間接触させてウイルスを不活化させます。不活化後、中性緩衝ホルマリン／クリスタルバイオレット混合液を慎重に取り除き、廃棄前に中和処理を行うため、別の廃棄物容器に移します。

シンクでプレートをすすぎ、余分な染料を除去した後、トレイに置いて完全に乾燥させます。ライトボックスを使用してプラーク数をカウントします。すべてのカウント数を記録し、標準式を用いてウイルス力価を算出します。

不活化済みのサンプルをBSL-4ラボから搬出する場合、チューブまたはプレートをヒートシールバッグに入れます。バッグ内部に5%消毒液または固定液をスプレーし、バッグ内部およびサンプルチューブの外側を消毒します。その後、バッグをヒートシールで密封します。

同様の手順に従って、このポーチを別のポーチに入れます。2枚目のポーチを熱シールし、二重に密封されたポーチを5%消毒液を含む浸漬タンクに少なくとも10分間浸し、ポーチの外側を消毒します。ラボ内の浸漬タンク記録簿に、チューブの数とサイズ、チューブ内の液量、使用した薬剤、使用した不活化方法、およびサンプルを転送する部屋を明記して記入します。

バイオセーフティーレベル4実験室において適切な手順に従うことは、アッセイを安全かつ効果的に完了させるために不可欠です。実験室スタッフは、完了済みの日常内部チェックリストを参照することで、機器が完全に動作していることを確認します。ウイルスサンプルを段階希釈し、1ウェルあたり30から300個のプラークが得られるプレートを作成して、ウイルス力価を決定します。

プラークの形成には、宿主細胞株に対するウイルスの向性、接種技術、ウイルスの増殖条件、適切な希釈範囲、およびオーバーレイの選択など、多くの要因が影響します。操作中にバイオセーフティキャビネット内で発生した廃棄物は、2回消毒します。また、廃棄物をバイオセーフティキャビネットから取り出す前に、一度適切に消毒してください。

その後、廃棄物は動物バイオセーフティーレベル4環境から搬出される前にオートクレーブで滅菌されます。これらの手順に従うことにより、フレデリック統合研究施設における動物バイオセーフティーレベル4研究において、ラボ感染の記録はありません。適切に実施すれば、この手法はサンプル数に応じて3〜4時間で完了できます。

この手順を行う際は、安全で成功裏に実験を完了させるため、希釈を正確に行い、適切にプラーク数をカウントし、すべての安全上の注意事項を遵守してください。このビデオを視聴することで、陽圧服によって課される物理的な制限と、標準的なプラークアッセイを完了するために必要となる追加の時間について、十分な理解が得られるはずです。