（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：3.空中生物学

本プロトコルの全体的な目的は、研究者の安全を確保するための動物バイオセーフティレベルIV（BSL-4）キャビネット室におけるエアロゾル操作に関する一般的な理解を提供することです。このプロトコルを視覚化することで、同様の施設の設計を検討している保健行政担当者や、高病原性病原体の研究に従事する外部協力者に対し、その複雑さと安全構成要素を示すことができます。エアロゾル実験に陰圧式のクラスIIIバイオセーフティキャビネットを用いるこの手法の主な利点は、研究スタッフが陽圧服を着用せずに安全にエアロバイオロジー研究を実施できることです。

主導的なエアロバイオロジストとして、当研究室のエアロゾルエンジニアであるKyle Bohannonと共に、本手順を実演します。搬送カートのドアや、壁を介して搬送カートとクラスIIIバイオセーフティキャビネット（BSC）を接続するRTPなど、エアロバイオロジーの手順に関わる高速移送ポート（RTP）装置の機能をテストします。RTPを所定の位置にロックしてください。

非ヒト霊長類（NHP）ごとのチャートに、あらゆる身体的操作、投与、またはルーチン手順をモニターし、記録してください。追加の麻酔が必要な場合は、取り外したキャップ、使用済みの針、鋭利物、およびシリンジをすべて鋭利物廃棄容器に廃棄してください。使用後の針にキャップを戻さないでください。

麻酔をかけたNHPを、輸送箱の蓋にあるラッチで固定された透明な容器に入れて運搬します。完全防護服を着用した研究者が、気圧耐性ドアへと続く呼吸用エアラインを使用して自由に移動できるよう、輸送容器を移動式カートに載せてください。エアロゾル曝露が完了したら、NHPを輸送カートに入れ、ホームケージに戻します。

比較医学スタッフによる動物の準備と並行して、除染済みのバイオセーフティキャビネットの機能を確認します。クラスIII BSCの陰圧が規定範囲内に維持されていることを検証してください。また、クラスIII BSCに漏れや亀裂がないか点検します。

除染済みのクラスIII BSCに取り付けられている合成ゴム手袋およびOリングに、弱点、破れ、裂け目、または経年劣化（ドライロット）がないか検査します。この段階では、クラスIIIバイオセーフティキャビネットは汚染されていません。損傷しているクラスIII BSCの合成ゴム手袋および/またはOリングを交換します。

ダンクタンクを点検し、消毒液が規定のレベル（浸漬バッフルから3インチ上の位置、またはダンクタンク内部の標線まで）まで満たされていることを確認してください。導電率計を使用し、ダンクタンク内の消毒液の濃度が最低3,500 microsiemens（または3.5 millisiemens）であることを確認してください。実験終了後に汚染廃棄物や器具を受け取ること、または実験に必要な器具で出し忘れがあった場合に、オートクレーブポータルからクラスIII BSC内へ一度だけ通過させることができるよう、クラスIII BSCオートクレーブが正常に機能していることを確認してください。

オートクレーブ処理に耐えうることが確認されている器具のみを滅菌してください。その他のエアロバイオロジー機器、例えば電子接続部やコンセントなどの機能を確認してください。

クラスIII BSCに取り付けられた合成ゴム手袋の中に、手袋をはめた手を入れます。NHP頭部専用曝露チャンバー、コンディショニングチューブ、およびエアロゾル管理プラットフォームを組み立てます。エアロゾル発生装置をコンディショニングチューブに、エアロダイナミック粒子径分析装置をNHP頭部専用曝露チャンバーに取り付けます。

装着した合成ゴム手袋から、手袋をはめた手を抜きます。合成ゴム手袋から手を抜くたびに、使用した使い捨て手袋をバイオハザード廃棄物として廃棄してください。次に、ノートパソコンでエアロゾルプロトコル用ソフトウェアを起動します。

適切なNHP頭部専用曝露チャンバー、エアロゾル発生装置、およびバイオサンプラーの流量に加え、管理情報をソフトウェアメニューに入力します。迅速移送ポートを通じて準備済みの病原体を受け取り、エアロゾル発生装置に病原体を充填します。これでクラスIIIバイオセーフティキャビネット内が汚染された状態になります。

エアロゾルソフトウェアを使用して、エアロゾル発生装置をオンにします。エアロゾル発生装置からの病原体が曝露チャンバーを満たします。エアロゾル発生装置をオフにした後、チャレンジ物質を排出し、クラスIIIバイオセーフティキャビネット内のバイオハザード廃棄物袋に廃棄してください。

次に、バイオサンプラーに回収用培地を満たし、満たしたバイオサンプラーを非ヒト霊長類（NHP）頭部専用曝露チャンバーに取り付けます。バイオサンプラーに適切な真空ラインを接続します。外部刺激への無反応、筋緊張、および呼吸数と心拍数の安定によって、NHPの麻酔深度が十分であることを確認してください。

麻酔したNHPをRTP経由でクラスIII BSC内に移動させます。NHPを仰臥位にして曝露ランプの上に配置します。NHPのバイタルサインが安定していることを、視覚的におよび携帯型被験者モニターを用いて確認します。

実験前に、メーカーのプロトコルに従って呼吸誘導プレチスモグラフィー（RIP）のキャリブレーションを行ってください。非ヒト霊長類（NHP）の腹部と胸部に呼吸誘導プレチスモグラフィーバンドを装着します。これらのバンドが適切にフィットしており、電子接続部がしっかりと固定されていることを確認してください。

次に、NHPの鼻口部にNumatechキャリブレーションマスクを装着します。その後、NHPの鼻口部の周囲が密閉されていることを確認してください。コンピューターソフトウェアを用いて、NumatechキャリブレーションマスクでRIPバンドの校正を行います。

完了後、キャリブレーションマスクを取り外します。呼吸パラメータを記録し、互換性のあるプログラムを用いて各動物の呼吸データをエクスポートします。NHPの頭部を、NHP頭部露出チャンバーのヘッドポータルに取り付けられたゴム製デンタルダムにゆっくりと通します。

エアロゾル曝露中、ラバーダムがNHPの頸部の周囲を密閉していることを確認します。ソフトウェアに目標エアロゾル累積量および各曝露ランに関連する必要な装置識別子を入力し、エアロゾル処作を開始します。NHPが目標累積量を吸入すると、システムが停止します。

RIPバンドを外し、NHPの隣のベッドの上に置きます。1〜2%のクロルヘキシジン溶液に浸したガーゼでNHPを拭き、NHPの目の周りを拭く際は注意してください。NHPの頭を軽く叩き、余分な溶液を取り除きます。

NHPをRTP経由でABSL-4エアロバイオロジー・スーツ研究室内の研究者に戻します。エアロゾル発生器および残ったチャレンジ物質を、ゴミ、使い捨て器具、および3/4まで充填された鋭利物容器が入ったバイオハザード廃棄物袋の中に空にします。エアロゾルバイオサンプラーから回収培地を、適切にラベル付けされた回収チューブに移します。

推定吸入量を決定するための適切なバイオアッセイに合わせて、回収チューブをバケツに入れた砕氷上に配置します。その後、サンプル回収チューブとバケツをRTP（高速転送ポート）で通過させます。クラスIIIバイオセーフティキャビネットは、動物バイオセーフティレベル4（BSL-4）実験室内の陰圧に保たれた、密閉型ステンレス製キャビネットです。

材料は、ABSL-4（動物生物安全レベル4）キャビネットラボで勤務するスタッフによって、5%の第4級アンモニウム塩複合消毒液が入ったキャビネット下部に設置されたステンレス製タンク（ダンクタンク）を介して、バイオセーフティキャビネット内に導入されます。BSCはキャビネットラボとABSL-4スーツラボを隔てる壁に組み込まれているため、搬送カートとRTPを使用して、スーツラボ側から材料、動物、およびウイルス病原体をBSCに移動させることも可能です。搬送カートの扉がABSL-4スーツラボ側に開かれた時点で、クラスIIIバイオセーフティキャビネットは汚染されたものとみなされます。

BSC内の物品は、さまざまな種類の合成ゴム手袋を着用したスタッフによって外部から操作できます。感染性サンプルを除くこれらの物品は、二重扉オートクレーブによる滅菌またはディッピングタンクによる消毒の後、BSCから取り出されます。クラスIIIバイオセーフティキャビネットおよびバイオエアロゾル設備が適切に機能していることを確認することで、スタッフの安全に不可欠な、安全で適切に運用可能な環境が維持されます。

これらの手順と慣行を厳格に遵守することで、フレデリック統合研究施設でのバイオエアロゾル研究において、研究室感染の記録はありません。この手法を習得すれば、効率的に実施することができ、1日で複数の非人間霊長類への曝露を行うことが可能です。この手順を行う際は、適切な麻酔深度を維持することを忘れないでください。

定常状態の鎮静が行われていない場合、プレチスモグラフィによるデータ収集ははるかに困難になります。本手順に続き、ウサギやマウスなどのより小動物を用いた他のエアロバイオロジー実験を実施することが可能です。この手法により、エアロバイオロジー研究者は、温度、相対湿度、バイオサンプラーの効率など、線量測定に影響を与える変数を制御し、正確な吸入投与量を投与することが可能になります。

このビデオを視聴することで、エアロバイオロジー（空気生物学）実験において用いられるバイオセーフティ上の予防措置について十分に理解することができます。手袋を複数回交換するといった予防措置により、実験室感染の潜在的なリスクを低減させることができます。