Name: マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してスキップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶマルチエクソンスキッピング法を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療。カクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドでイヌモデルに全身性ジストロフィン発現を回復させ、毒性評価も実施した革新的アプローチを解説します。

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この作業は、アルバータ大学医学部および歯学部、The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund、HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund、Muscular Dystrophy Canada、Canada Foundation for Innovation (CFI)、Alberta Advanced Education and Technology (AET)、Canadian Institutes of Health Research (CIHR)、Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapyによって支援されました。 女性と子供の健康研究所(WCHRI)。

この記事のオープンアクセス料金は、Gene Tools, LLC によって提供されました。

エクソンスキッピングは、DMDの治療のための有望な治療技術です。 in vitroおよびin vivo実験の両方で 、マルチエクソンスキッピングが可能であることを示しています。ここで、CXMD犬モデルの使用が議論されています。 8. 2&#39;OMePS AON化学はCXMDの筋芽細胞トランスフェクションに使用し、モルフォリノAONの骨格化学は、in vivo実験のために選択した-まず、のAONは、 ジストロフィンのエクソン6を標的とするレスキュー-ESEとESEfinderプログラムを用いて設計しました。 VPMOSは変更されていないPMOをより効率的であるが、その高い毒性のために、彼らは、全身注射に適していません。 RNA抽出、RT-PCR、およびcDNA配列は、CXMD筋芽細胞で行いました。 PMOカクテルを注入したイヌは、臨床的に臨床症状の任意の改善を評価するために等級付けしました。イヌを人道的に安楽死させた後、筋肉試料を採取し、凍結切片用に調製しました。 Aによって誘導されたジストロフィンタンパク質の半減期2ヶ月 - ONを約1であると考えられています。これらの実験は新生児の犬や古い犬（&gt; 5歳）で行うことができますが、若い成犬は、本研究で使用しました。調製された筋肉切片を組織病 ​​理学を評価し、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織48を通してジストロフィンタンパク質の救助を評価しました。 PMO溶液の体積は、注射の前に正しいことを保証することが重要です。そうしないと、結果に大きな影響を持つことになります。筋肉内注射時には、十分な圧力が筋線維を入力する必要があります。犬の健康と手術部位の検査の監視、トラブルシューティングのために重要です。動物の健康を監視するには、毎週の血液検査と計量を行うべきです。動物および筋肉サンプルの調製の安楽死の後、ジストロフィンタンパク質を検出する感度を確保するための重要なステップは、トリス - 酢酸ゲル、半乾燥ブロッティング法の両方を使用することですウェスタンブロッティング手順中。 代表的な結果に示されるように、Ex6A、Ex6B、Ex8A、そしてカクテルで処理した筋芽細胞（Ex6A、Ex6B、Ex8A、およびEx8Bを含む）がインフレームDMDの製品を生産しました。 Ex8Bはないエクソンスキップされた製品を生産していないので、in vivo実験で 、後続に使用されませんでした。 DYS-2染色で9スキップ発生し、免疫細胞化学処理された試料に復元されたジストロフィン発現を示した - のcDNA配列決定は、6つのエキソンがあることを示しました。 AON処理された犬はジストロフィン陽性線維の有意な増加を示しました。 8スキップされ、短縮タンパク質が産生された - これは、エクソン6があることを示します。ジストロフィン陽性繊維の量は、AONのカクテルを使用したときに増加し、AONの用量に比例しました。イムノブロットは、全身モルホリノ処置したイヌにおけるジストロフィン発現の増加を示しました。骨格筋はジストロフィン繊維の可変レベルを有していました。しかし、モルホリノ処理された心臓組織は少しを示しましたジストロフィン発現の改善。ジストロフィンは、高分子量（427 kDaの）を有しているため、ジストロフィンの少量の検出は困難であり得ます。最良の結果を得るには、トリス - 酢酸ゲル、半乾式転写法を用いました。 HE染色は、モルホリノ処理されたイヌにおいて、改善された組織病理を示しました。中心部有核繊維（CNFの）不健康な筋肉の兆候であり、筋変性と再生のサイクルを表します。モルホリノ処置CXMD犬は、非処理CXMD犬と比較して、CNFの割合の減少を示しました。臨床グレーディングは、モルホリノ処置動物におけるこのような増加ウォーキングや実行能力のような症状の改善を、明らかにしました。筋肉の硬さは、したがって、それは格付けスキーム59に含まれていた、筋萎縮を反映すると考えられます。腿（後肢）の筋肉の硬さを評価しました。彼らはCXMDに肥大よりもむしろ萎縮を示す傾向があるので、しかし、我々は頭蓋縫工筋を除外しました。処理された犬は表示します低い等級のスコアを編と15メートル走行試験に速い時間を持っていました。 15メートルテストに改善された時間が改善された筋肉機能40を示しています。全体的により高い等級のスコアは、貧しい人々の健康と増加した筋萎縮を示しています。 これらの結果は有望であるが、マルチエクソンスキッピングは、まだ技術が臨床応用性を持って前に克服する必要があります多くの課題を提示します。心臓組織は依然としてによる心筋および骨格組織との間の細胞輸送の違いによる可能性が高い、AONの取り込みの減少が表示されます。毒性効果は、現在の投薬レジメン下の動物において観察されませんでした。 AONのカクテルの使用は、臨床試験へ移動する前にしかし、より多くの仕事は、長期の毒性を評価するために行われる必要があります。規制当局は、一意薬として各AONの配列を定義するので、AONカクテル薬の承認を得ることは困難です。これは、カクテル中の各シーケンスは、個別safetについて試験する必要があることを意味しますyは、より多くの時間とより多くのお金を必要とします。臨床の現場でのマルチエクソンスキッピングの使用に対する別の障壁は、未知の機能で生成された中間タンパク質生成物の大規模な量です。これらのタンパク質は、潜在的に、個々の突然変異22に応じて、予測できない副作用につながることができます。さらに、現在のジストロフィー犬のモデル内で利用可能な変異パターンが限られています。そこにいくつかの天然に存在する変異があり、すべての変異は、マルチエクソンスキッピングを研究するために有用ではありません。ジストロフィーのブタモデルは、将来のDMDエクソンは研究33、34をスキップするための良い代替であることを約束します。 DMDの犬のモデルは、他のDMDモデルの上にいくつかの利点を持っています。大きな動物モデル、臨床グレーディングおよびMRIであることは、より詳細な分析を可能にする、ことが可能です。犬は大型動物であるため、彼らはまた、毒性試験のために、より適しており、より密接にマウスモデルと比較して、ヒトの疾患を表します。犬メートルodelsはまた、ヒト23、34、45に類似しているDMD遺伝子配列を有します。 技術的に困難が、マルチエクソンスキッピングのアプローチは、最終的にはDMD患者24の&gt; 90％に利益を得ることができます。単一エクソンスキッピングは、患者の小さなサブセットにのみ適用されるように、これは、その単一エクソンスキッピングへのより良い代替手段になります。また、マルチエクソンスキッピングを短縮ジストロフィン蛋白質の機能を最適化し、削除パターンを選択することが可能となります。例えば、DMDのエクソンの欠失45から55は、非常に軽度の症状または無症候性の個人14,19,60-63に関連付けられています。エクソン45のマルチエクソンスキッピング- 55はすでにVPMOS 22,26の全身注射を用いて、エクソン52の欠失（mdx52）とDMDのマウスモデルで実証されています。カクテルVPMOSの使用は、例えば、筋ジストロフィーの他の形態で実証されています福山先天性筋ジストロフィー（FCMD）など。 FCMDは、異常なmRNAスプライシングは、レトロトランスポゾンの挿入によって引き起こされたエクソントラッピングによって引き起こされます。 VPMOS両方FCMDマウスモデルおよびヒト細胞系64にスプライシングパターンをレスキューすることが示されています。高い有効性と低い毒性を発揮する次世代AON​​化学は臨床応用へのマルチエクソンスキッピングアプローチの効果的な翻訳を容易にするであろう。さらに、マルチエクソンスキッピングは、潜在的にそのようなdysferlinopathies 24、65のような他の遺伝性疾患に適用することができます。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、最初の博士ギヨーム・ベンジャミン・アマンデュシェンヌ型（デブローニュ）1によって説明、進行性の筋力低下によって特徴付けられるX連鎖劣性筋疾患です。 DMDは、毎年2,3生まれた約2万影響を受けた子供たちと、全世界で約1 3500で男の子に影響を与える一般的な遺伝性疾患です。運動発達が遅れ、歩行障害を早期に十代の若者付近で車椅子の依存が続く、幼児4に見られます。死は、一般的に起因する呼吸や心不全5-8に20と30歳の間に起こります。 DMDの治療法は現在ありません。グルココルチコイドを用いた治療は、ある程度筋変性の進行を遅らせることができるが、肥満および糖尿病2,7,8を含む重大な副作用と関連します。 DMDは、機能的なジストロフィンproteiの損失につながる、 ジストロフィン （DMD）遺伝子の突然変異に起因しますn個。DMDは、200万以上の塩基対と79個のエクソン9,10に非常に大きな遺伝子です。フレーム外の突然変異につながる欠失、ナンセンス、及び重複変異は、DMD表現型の最も一般的な原因です。 9及びエクソン45 - -エクソン3領域ほとんどの患者は、DMD患者3,9,11-16に非機能的ジストロフィンをもたらす、遺伝子のこれらの部 ​​分内に欠失変異を持つように55を「突然変異ホットスポット」と呼ばれます。筋膜安定化に大きな役割を持っているジストロフィン - 糖タンパク質複合体（DGC）、内ジストロフィン機能。中央ロッドドメインはそれほど重要な役割3,9,17を果たしながら、N末端 ​​およびC末端は、機能のための最も重要なドメインです。主にDMD遺伝子内のインフレーム変異から生じるベッカー型筋ジストロフィー（BMD）、関連付けられている軽度の表現型の遵守は、DMDを治療するためのエクソンスキッピングのアプリケーションに影響を与えました。 BMD患者は短く、しかし、関数Aています末端3,6,18の両方を維持リットル、ジストロフィンタンパク質。エクソンスキッピングは、理論的には、BMD 3,19に見られるものと同様の機能短縮-しかし、ジストロフィン蛋白質で、その結果、リーディングフレームを復元することができます。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（AONは）複数の種類が2&#39;-O-メチルホスホロチオエート（2&#39;OMePS）およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMOS）を含む臨床試験において試験されてきました。これらのAONを用いてスキップエクソン51と53が検査され、結果は有望であるが、それは、変異特異3、19、20,21、22〜26であるように、単一エクソンスキッピングは、適用性を制限しています。質問はまた、単一エクソン22,23をスキップから生産結果の短縮ジストロフィン蛋白質の安定性について残ります。さらに、一部の患者は、読み枠3を回復するためにスキップする単一エクソン以上が必要です。技術的にはより困難にしながら、マルチエクソンスキッピングは、1つの方法であることこれらの問題3,19に対処することができます。マルチエクソンスキッピングは、以前ジストロフィー犬及びインビトロでのヒト細胞系において実証されています。さらに、mdx52マウスおよびイヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）犬のモデルは、生体内に使用されてきた22、24-27を研究しています。犬X連鎖筋ジストロフィー日本（CXMD J）CXMD Jのリーディングフレームがエクソン6,8、または追加のエクソン（ 例えば 、エクソンは、3から9）のマルチエクソンスキッピングによって復元することができるようビーグル犬は、ここで使用された（ 図1）。ビーグルベースCXMDはゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（GRMD）モデルと同じ変異パターンを共有するが、ビーグル犬は、このようにDMD 28,29のための有用なモデルを提供し、それらの体の大きさに維持するために小型で安価です。 CXMD犬は、より密接に齧歯類のように、小さい動物モデルよりも人間のDMD表現型を模倣する、と毒物学的評価3,22,30,31のために、より信頼性が高いです</s（ 図2）&gt;アップ。 CXMD犬は、DMDに見られるものと類似の漸進的筋崩壊、歩行障害、心臓や呼吸器系の問題を表示します。単一エクソンスキッピングと比較して、マルチエクソンスキッピングは、患者のはるかに大きな割合にも適用可能です。最も一般的な3つの変異型（欠失、ナンセンス、および重複）のうち、80 -すべてのDMD患者の45％は特にエクソン45をスキップしてから利益を得ることができる一方で、患者の98％は、14,32,33をスキップするマルチエクソンを通じて治療することができます- 55 3,19,22,34。 修正されたモルフォリノの発展に伴い、エクソンスキッピングを容易にAONカクテルの効率が向上しました。アルギニンリッチ細胞透過性ペプチドコンジュゲートのPMO（PPMOs）、およびin vivo-モルフォリノ（VPMOS）が有意に細胞透過性と安定性3,35-38が改善されたAONの化学的性質です。懸念は、長期的AON毒性について残ります。しかし、重要な進展なされています。モルフォリノに作られた化学修飾を大幅にオフターゲット効果を減少させ、前臨床研究では、有意な毒性作用3,22,39,40を報告しませんでした。マルチエクソンスキッピングのための残りの課題は、各単一AONの現在の要件はカクテル3,19,22,41,42としての代わりに、一緒に、単一の薬剤として、単独の毒性について試験されます。シングルと心をターゲットに飛びマルチエクソンの両方を含むDMDの研究では、ジストロフィー心臓組織でほとんど改善がありました。心臓内のモルフォリノの有効性は乏しいため、細胞透過性能力の低いものと考えられています。ペプチド結合PPMOs心臓3,19,38にレスキュー機能性ジストロフィンタンパク質の量を増加させる、心臓細胞に浸透するAONの能力を改善しています。 ここでは、私たちのAONカクテルアプローチはESEfinderソフトウェア43を使用してAON配列の設計を含め、長さで議論されています。 Protocマルチエクソンスキッピングと犬の実験のためのオールも記載されています。 CXMD Jのビーグル犬は、エキソン6,8スキップ実験に使用しました。 CXMD犬モデルでスキッピングマルチエクソンは、有望な結果を示しているが、課題は、彼らが臨床的に適用される前に、その必要性が克服されずに残っています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS犬の筋芽細胞のトランスフェクション&nbsp;</ストロング></td></tr><tr><td>3ml 6ウェルプレート</td><td>イワキ</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」中程度(DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)&nbsp;</td><td>ハイクローン</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>リポフェクチン&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>リポフェクチンの比率が 2:1 の opti-MEM 培地中の 100 ml の総容量&nbsp; 5 mg RNAに対して10 mlリポフェクチン。</td></tr><tr><td>2フィートOMePS</td><td>ユーロジェンテック&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A(GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG)、Ex6B(ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU)、およびEx8A(CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC)です。</td></tr><tr><td>ウマセラム&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956;g/ml</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">犬の筋芽球のモルフォリノトランスフェクション 
Antisense morpholinosの培養のための犬の筋芽細胞のMePSトランスフェクションからのすべての資料</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>遺伝子ツール</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; opti-MEM培地で最終容量100 Lまで希釈します。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 120&ndash;生理食塩水</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グアニジン チオシアン酸フェノール-クロロホルム</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp;ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4">RNA抽出および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)</td></tr><tr><td>グアニジンチオシアン酸フェノールクロロホルム</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp;ml /プレート</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P3803</td><td>200 &#956;l&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5mlチューブ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%エタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>UV分光計&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エクソンのフォワードプライマー 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1.5 &#956;l 10 &#956;</td></tr><tr><td>M エクソンのリバースプライマー 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1.5 &#956;l 10 &#956;M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>ワンステップ RT-PCR キット&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr>サー<tr><td>モサイク</td><td>ラーScinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Complementary DNA(cDNA)シーケンシング&nbsp;</ストロング></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ターミネーターv3.1サイクルシーケンシングキット&nbsp;</td><td>アプライドバイオシステムズ&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">筋肉内注射または開腹筋生検</td></tr><tr><td>手術用具</td><td></td><td></td><td>はさみ、メス、針、手術用糸&nbsp;</td></tr><tr><td>獣医軟膏&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨードフォア&nbsp;</td><td></td><td>webtextiles12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>クロロヘキシジン</td><td>Peridex12134</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクラブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェイシャルマスク&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用手袋&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘッドカバー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チオペンタールナトリウム&nbsp;</td><td>田辺三菱製薬&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン・</td><td>アボット研究所&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>アンチセンスモルフォリノス&nbsp;</td><td>遺伝子ツール</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; opti-MEM培地で最終容量100 Lまで希釈します。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 120&ndash;生理食塩水 27</td></tr><tr><td>&nbsp;Gニードル</td><td>テルモ&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン塩酸塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>舌圧子&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セファレキシン</td><td></td><td>15 から 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>セファゾリン</td><td></td><td>15 - 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン&nbsp;</td><td></td><td>0.01 mg / kg</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ブプレノルフィン&nbsp;</td><td>0.02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">全身注射剤</td></tr><tr><td>シリンジ輸液ポンプ&nbsp;</td><td>室町&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp;G 留置針</td><td>テルモ</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp;Gニードル&nbsp;</td><td>テルモ&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>大塚製薬</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Clinical Grading of Dogs</strong</td></tr><tr><td>>Video Camera&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストップウォッチ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">磁気共鳴画像法(MRI)&nbsp;</strong</td></tr><tr><td>>3テスラMRI l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直径18cm/長さ18cmの人間の四肢コイル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">筋肉のサンプリングと準備(剖検)</td></tr><tr><td>チオペンタールナトリウム&nbsp;</td><td>田辺三菱製薬&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン・</td><td>アボット研究所&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>トラガカンスガム</td><td></td><td></td><td>10-20ml</td></tr><tr><td>液体窒素&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コルクディスク岩</td><td>井化学&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-リジン&ndash;コーティングスライド</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Microsystem&nbsp;</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td>CM1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>ノボカストラ&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150希釈&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>ノボカストラ&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>1:150希釈</td></tr><tr><td>Alexa 594ヤギアンチマウスIgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2,500希釈</td></tr><tr><td>Alexa 594 ヤギ抗マウスIgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2,500希釈</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>ヤギ血清&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モイスチャーチャンバー&nbsp;</td><td>科学デバイス研究室&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド&nbsp;</td><td>ラボテック&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>カバーグラス&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-540A</td><td></td></tr><tr><td>疎水性バリアペン&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td></td><td></td><td>倍率20倍で594nm。</td></tr><tr><td colspan="4">ウエスタンブロッティング&nbsp;</ストロング></td></tr><tr><td>蒸留水&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンドホモジナイザー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2回;Laemmli SDSローディングバッファ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris&ndash;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28&nbsp;M) β-メルカプトエタノール、20% グリセロール、0.01% ブロモフェノール ブルー&nbsp;</td></tr><tr><td>SDSゲル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>161-1210</td><td>5% 分解能</td></tr><tr><td>SDS ゲル</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>3-8%</td></tr><tr><td>PVDF メンブレン&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ランニングバッファー (10回;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM の Tris-Base、1,920 mM の Glycine</td></tr><tr><td>Running buffer (1&times;)</td><td></td><td></td><td>10% 10&times;緩衝液、20%メタノール&nbsp;</td></tr><tr><td>0.05% PBS/トゥイーン 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2,000ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3回;</td></tr><tr><td>PBST / 5%粉乳の洗浄用200ml&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>プロテインアッセイキット</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>ベータメルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロッティング用ローディング/サンプルバッファー</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼカクテル阻害剤&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>カソードバッファー</td><td></td><td></td><td>0.025 M トリスベース + 40&nbsp;mM 6-アミノカプロン酸 + 20% メタノール</td></tr><tr><td>陽極緩衝液</td><td></td><td></td><td>0.03 M トリス塩基 + 20% メタノール</td></tr><tr><td>中心陽極緩衝液</td><td></td><td></td><td>0.3 M トリス塩基 + 20% メタノール</td></tr><tr><td>デスミン抗体&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>ノボカストラ&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150希釈&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マルチエクソンイヌx連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）はジストロフィン （DMD）遺伝子の突然変異によって引き起こされる、世界的に最も一般的な致死性の遺伝性疾患の一つです。エクソンスキッピングはリーディングフレームを復元し、短いが、機能性タンパク質を産生するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AONは）と呼ばれる短いDNA / RNA様分子を採用しています。 （単一AON薬で治療することができる患者のわずか13％まで）限定された適用性、および短縮型タンパク質の不確かな機能：しかし、エクソンスキッピング治療は、2つの主要なハードルに直面しています。これらの問題は、カクテルAONのアプローチで対処されました。 DMD患者の約70％が単一エクソンスキッピングにより（結合されたすべてのエキソン）で処理することができるがカクテルアンチセンス薬剤を使用してスキップ複数のエクソンを実現することができる場合、一方は、潜在的にDMD患者の90％以上を治療することができました。イヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）犬のモデル、その表現型人間のDMD患者に、より似ているが、全身efficを試験するために使用しましたエクソン6と8のマルチエクソンスキッピングのACYと安全性がCXMD犬のモデルは、 ジストロフィン mRNAにおけるエクソン7の欠如につながる、イントロン6のスプライス部位突然変異を保有します。 CXMDに読み枠を復元するには、エクソン6と8のマルチエクソンスキッピングが必要です。したがって、CXMDは、マルチエクソンスキッピングの有効性と安全性をテストするための良い中型動物モデルです。現在の研究では、エクソン6及びエクソン8を標的とするアンチセンスモルホリノのカクテルを設計した、それは身体全体の骨格筋でジストロフィン式を復元しました。 CXMD犬モデルでカクテルオリゴとマルチエクソンスキッピングの有効性と安全性の評価のトランスフェクション/注入するための方法が提示されています。

インビトロ実験で 筋芽細胞は、各AONの有効性を比較するために、様々な2&#39;OMePS処理条件を用いてトランスフェクトしました。 600 nMのEx6A、Ex6B、Ex8A、またはEx8Bのそれぞれと単一AON処理は、600 nMのすべての4 AONの配列の各々でのカクテル治療と同様に、行われました。 RNAサンプルを、トランスフェクションの4日後に採取しました。 RT-PCR後、各治療のためのサンプルは、非処置（NT）のサンプルと一緒にゲルに流しました。ゲル上の高いバンドは、アウトオブフレームDMDの製品を表します。これらのバンドは、NT、Ex8Aで見られた、とEx8Bは筋芽細胞を処理しました。 Ex6A、Ex6B、Ex8A、そしてカクテルで処理した筋芽細胞は、インフレームの製品を示しました。 Ex8Aはインフレーム製品（ 図7）のみ30％を示したカクテルとEx6A / Bは、インフレームの製品100％を示しました。エクソンスキッピングとの復元を確認するために、リーディングフレームは、cDNAの配列決定を行いました。 9実際に（ 図7）はスキップされていた-結果は、エクソン6があることが示されました。免疫組織化学は、AON処理された犬はNTサンプル（ 図8）と比較して、ジストロフィン陽性線維が増加したことを示しました。 in vivo 実験 様々なAON処理条件の効率を比較するために、CXMD犬（0.5から5歳）は1.2 mgのEx6Aまたは様々な用量でEx6A、Ex6B、およびEx8Aのカクテルで一回注射しました。二週間注射後、筋肉試料を集め、ジストロフィン陽性線維の数を比較するDYS-1で染色しました。全てのカクテルで処理したサンプルは、NTのサンプルと比較して増加したジストロフィン発現を示しました。ジストロフィン陽性繊維は、AONの投与量（ 図9）と増加しました。次のシステムIC注射、野生型（WT）、NT、およびカクテル処置CXMD筋肉試料をDYS-1（ 図10）を用いて染色しました。カクテルで処理したCXMD犬は、CTや心臓の筋肉サンプルの両方のNT CXMD犬、と比較して増加ジストロフィン発現を示しました。しかしながら、AON処理した骨格筋（CT）は、処理された心筋に比べジストロフィンの非常に高い発現を示しました。 WT、NT、および様々なモルホリノカクテルで処理した筋肉を比較するイムノブロットは、同じ結論に至りました。処理された骨格筋サンプルにおけるジストロフィン発現の大規模な範囲は、（ 図10）もありました。ヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）染色は、CXMDをあしらったことを明らかにしました 犬はNT CXMD犬（ 図11）と比較して中央に有核繊維（CNF）の有意な減少で、改善された組織病 ​​理を示しました。これは、NTの犬で発生した複数の変性/再生、ジストロフィー筋病理の兆候があることを示します。さらに、処理された犬は速くていました臨床評価スケールで時間と改善されたスコアを実行しています。処理されたCXMD犬はすべてのカテゴリでNT CXMD犬（ 図12）よりも良好なスコアを示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> CXMD犬とエキソン6の図1.変異パターン- 。アンチセンスカクテルを使用した8スキップ戦略 CXMD犬は、ジストロフィー犬mRNAにおけるエクソン7の損失につながるエクソン6における点変異を持っています。これはmRNAがアウトオブフレームであるとジストロフィンタンパク質の産生が失われることになります。 AONカクテルで処理されたイヌの灰色のバーが短いAONシーケンスを表す8 - ショートAON配列が効果的に6個のエクソンをスキップmRNAスプライシングをもたらす6,8を、エクソンに結合するように設計されています。エクソン9は、ヒンジドメインをコードし、時には自然に短くなっているタンパク質が、機能ジストロフィンのためのエクソン6,8に対してのAONで得られたmRNAのコードをスプライシングされますal。は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> 1歳のイヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）動物の図2.主な臨床症状。1歳の野生型ビーグルとCXMD犬が示されています。近位、四肢、および一時的な筋肉の関与は通常、生後2ヶ月から観察されています。共同拘縮や骨盤のずれは、生後4ヶ月から顕性である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> 犬。A）Intramuscul図3.全身麻酔arの注射と筋肉生検をイソフルランで全身麻酔下で行われています。 B）全身注射のための動物の開催。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> 図4.磁気共鳴イメージング野生型の（MRI）、CXMD非処理、および WTおよびNT CXMD犬に3ヶ月と5ヶ月で後肢のCXMD。MRIスキャンを処理しました 。 AONのポスト噴射（最初の注射の前に1週間）で処理CXMD後肢MRIの前の2つのサンプル画像が表示されます。 2703MAは200ミリグラム/キログラムカクテルモルフォリノで7倍毎週処理しました。 2001MA 120ミリグラム/ kgのカクテルモルホリノの5X毎週のIV注射で処理しました。対照および処理の犬は、年齢をマッチさせました。処理された犬は減少T2信号を示しています。画像はADAPです<html>横田らの許可を受けてテッド。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> 犬のための図5.筋肉生検手順。A）下肢が筋生検のために固定されています。 B）鉗子の助けを借りて、下肢が保持されています。 C）CTの筋肉を露出させます。開放生検技術は、注入部位の筋肉サンプルを得るために使用されます。スレッドは、生検試料を保持するために使用されています。解剖後トラガカントゴム上D）筋サンプル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; 図6.セミドライ転送方式。ウェスタンブロッティング用のセミドライ転写法の表現が提示されています。濃縮された陽極バッファーに浸した3つの論文は、負端子に敷設されています。陽極緩衝液に浸漬した3論文は、この上に積層されています。 MbのPVDF紙6紙の上に置かれる前に、メタノール、次いで、陽極緩衝液に浸漬されています。カソードバッファー中に浸漬されたゲルを、PVDF紙の上に静かに置かれます。最後に、陰極バッファーに浸し3論文は、ゲルの上部に配置されています。正端子は上に設定されています。 1時間、400ミリアンペアは、システムを介して実行されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> 図7. CXMD筋芽細胞におけるエクソンスキッピング。 </stチョロン&gt; CXMDの筋芽細胞はEx6A、Ex6B、Ex8A、または単独でEx8B、またはすべての4のカクテルでトランスフェクトしました。 600 nMの合計は、個々の配列のために使用し、カクテル、各配列の600 nMで使用しました。 A）CXMD犬の筋芽細胞で治療を2&#39;OMePS。 Ex6A、Ex6B、そしてカクテルで処理したサンプルは、インフレームエクソン・スキップ転写産物の予想される位置での強いバンドを示します。 Ex8AはEx8Bが弱いバンドを示し、中間バンドを示し、およびNTは、インフレームの位置にバンドが表示されません。単独Ex6Aから、4日間トランスフェクション後B）のcDNA配列決定。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> 図8.増加Dystrop2&#39;-O-メチルホスホロチオエート（2&#39;OMePS）トランスフェCXMD筋芽細胞に発現しホアヒン。CXMD筋芽細胞を単独でEx6Aまたはカクテル2&#39;OMePSをトランスフェクトしました。 DYS-2（赤色）及びDAPI（青）染色を示します。処理された筋芽細胞は、野生型（WT）および非処理（NT）筋芽細胞と比較されます。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> CXMD犬のモルフォリノの筋肉内注射でジストロフィン発現の図9.レスキュー。単独Ex6AまたはEx6A、Ex6B、およびEx8Aのカクテルは、CXMD犬のCTの筋肉に注射しました。野生型のジストロフィン（DSY-1）染色（WT）、無処理（NT）、およびCXMD犬が示されている処理されました。犬は単独で1.2ミリグラムのEx6Aまたは1.2 mgのカクテルで処理しました。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> CXMD犬。ジストロフィンにおける全身カクテルモルホリノ治療 （DYS-1）の後 、 図10の増加ジストロフィン発現は染色は、（NT）（陰性対照）、無処理、野生型（WT）（陽性対照）でジストロフィンの発現を比較するために使用されました120ミリグラム/ kgのモルホリノカクテル（各AONを40mg / kg）で処理し、CXMD犬。モルホリノカクテルはEx6A、Ex6B、およびEx8Aを含んでいました。犬は、静脈内に5回注射した私たちこのカクテルでekly。 A）ジストロフィンWT、NTの頭蓋脛骨（CT）の筋肉内での発現、および処理された犬との比較。 B）NTおよびモルホリノカクテルで処理された犬との間に心臓組織におけるジストロフィン発現の比較。ローディングコントロールとしてデスミンとジストロフィンのためのC）イムノ​​ブロットは、WT、NT、およびモルホリノカクテルで処理された犬のために示されています。以下の筋肉が処理された犬のために示されている：上腕三頭（TB）、上腕二頭筋（BB）、ダイヤフラム（DIA）、食道（ESO）、CT、内転筋（ADD）、長指伸筋（EDL）、咬筋（MAS）、そして、心。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=200μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> フィギュア11. CXMD犬における組織病 ​​理240ミリグラム/キログラムモルホリノカクテルで7週間処理の改善。一度半年から5歳までのCXMD犬が240ミリグラム/キログラムモルホリノカクテル（Ex6A、Ex6B、およびEx8A）を静脈内注射しました7週間の週。 14日最後の注射後に、食道の筋肉を採取し、ヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）染色を行いました。 HEの非処理（NT）から食道の筋肉の染色およびモルホリノカクテルで処理した（処理された）CXMD犬（40X対物レンズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> 図12は、臨床成績評価のスコアを改善し、15メートルは、モルホリノ処理後の時間を実行している。モルホリノ処理された犬は、非処理（NT）同腹仔と比較しました秒。グラフ中のエラーバーはSEMを示します。 A）は、臨床グレーディング試験で合計スコアが治療前と後に計算し、処理した動物NT同腹子と比較しました。 B）で処理し、NT犬の15メートル走行時間の比較。 Bと同様にC）;しかし、若い犬を使用しました。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> アンチセンスオリゴヌクレオチド </td><td> ヌクレオチド配列 </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> 表1アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計。

エクソンスキッピングは、現在、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のための最も有望な治療選択肢です。 DMD患者のための適用性を拡大し、切り捨てられジストロフィン蛋白質の安定性/機能を最適化するために、カクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いたマルチエクソンスキッピングアプローチが開発された、我々は犬のモデルで全身ジストロフィンの救助を実証しました。

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

本実験の全体的な目的は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のイヌモデルを用い、カクテルアンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）によるマルチエキソンスキッピングの有効性と毒性を検討することである。本手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが大型動物モデルにおいてマルチエキソンスキッピングを誘導し、ジストロフィン発現の異常を解消できるかなど、アンチセンスエキソンスキッピング療法のトランスレーショナルリサーチにおける重要な疑問への回答に寄与し得る。本研究でイヌモデルを使用する主な利点は、大型動物における治療成果の方が、DMD患者への外挿性がより高いことである。エクソンスキッピングはDMDにとって非常に有望な治療法ですが、先天性筋ジストロフィーや肢帯型筋ジストロフィーなどの他の遺伝性疾患にも適用可能です。in vitro実験のデモンストレーションは、当研究室の責任者である青木佳嗣博士が、in vivo実験のデモンストレーションは、当科のポストドクターである倉岡睦月博士が行います。テキストプロトコルに従ってAONを設計した後、6ウェルプレートを用いて、10%FBSおよび1%pen-strepを含む3 mLのDMEMで、1 cm²あたり1～5×10³個のCXMD筋芽細胞を播種します。細胞を37 °Cでインキュベートし、コンフルエンシーが60〜80%になるまで培養します。細胞が目的のコンフルエンシーに達したら、低血清培地を用いてカチオン性リポソーム・トランスフェクション試薬を合計100 µLになるように希釈し、室温で30〜45分間静置します。その後、低血清培地を用いてAONsを最終容量100 µLに希釈します。希釈したトランスフェクション試薬と希釈したAONsを混合し、室温で10〜15分間インキュベートします。その間に、細胞から培地を除去し、新鮮な培地を用いて細胞を3回洗浄します。次に、トランスフェクション混合液に0.8 millilitersの培地を加え、その後、溶液全体を洗浄後の細胞に添加します。37°Cで3時間インキュベートします。その後、細胞に分化培地（DM）を添加し、分化が起こるまで最大10日間インキュベートします。3日目あたりから、分化の有無を確認してください。イヌ筋芽細胞にモルフォリノを導入するには、本ビデオの前半で示した通りにCXMD筋芽細胞を培養します。カクテルモルフォリノを65°Cで10分間加熱します。その後、ペプチドデリバリー試薬を加え、モルフォリノの最終濃度が3〜6 µMになるように調整します。次に、DMを用いて筋芽細胞の培地を交換し、各ウェルに最終濃度1 µMとなるようにモルフォリノを添加します。16〜18時間インキュベートします。その後、RNA抽出用の細胞を回収するため、1 mLのグアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムを細胞に加えてプレートから剥離させます。細胞を室温で10分間インキュベートした後、1.5 mLチューブに移します。各チューブに200 µLのクロロホルムを加え、RNA層、タンパク質層、DNA層の3つの独立した層が見えるまで、室温で2分間インキュベートします。12,000 ×g、4 °Cで15分間、チューブを遠心分離します。次に、上清の最上層を取り除き、500 µLのイソプロパノールを含むチューブに移します。上清チューブをスピンダウンさせてから上清を取り除き、RNAペレットを回収します。エタノールでペレットを洗浄し、8,000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。チューブを15分間転倒混和させ、残留エタノールを蒸発させた後、15～30 µLのRNaseフリー水を加えます。次に、260 nmでのUV-Vis分光法を用いてRNA量を定量します。RT-PCRを行うには、以下の試薬を混合し、水を加えて最終容量を25 µLにします。サンプルをサーモサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行します。ランが完了したら、生成物を4°Cまたは20°Cで保存します。筋肉内注射を行うには、テキストのプロトコルに従って動物の手術準備と麻酔を行った後、メスを用いて前脛骨筋（CT）上の皮膚を縦方向に約5cm切開します。注射部位をマークするために、外科用針と外科用縫合糸を使用して深筋膜に縫合し、2cm間隔で2か所のステッチマーカーを作成します。より正確な生検を行うために、注入部位を糸でマークしておくことが非常に重要です。次に、27ゲージの針を使用して、目的の濃度のAONsを筋肉内に注入し、針を1分間そのままにしておきます。その後、開筋生検を行うため、外科用メスを用いてCT筋肉から長さ約2cmの筋肉組織の一部を切り出します。筋膜を筋肉の上に被せ、000吸収性縫合糸を用いて組織を閉鎖します。次に、000ナイロン糸を用いて皮膚を閉鎖します。針を用い、塩酸ブプレノルフィンを0.02 mg/kgの用量で筋肉内投与します。テキストのプロトコルに従って動物を保持しながら、各AONを等量含んだカクテルを四肢の静脈に注入するには、留置静脈針を四肢の静脈に挿入します。輸液ポンプまたはシリンジドライバーを使用し、製造元の指示に従って、計50 millilitersを2.5 milliliters/minの速度で20分間かけて注入します。注入を繰り返すことでジストロフィン発現が蓄積するため、注入は週1回または2週に1回の頻度で繰り返してください。毒性を調べるための週1回の血液検査を行うには、針を用いて前肢または後肢の皮下静脈のいずれかから3 mLの血液を採取してください。製造元の指示に従い、以下の評価項目を含めてください。その他の解析については、テキストプロトコルに従って実施してください。各AONの効果を比較するため、さまざまな2'OMePS処理条件で筋芽細胞にトランスフェクションを行いました。ここに示すゲルは、処理から4日後に回収したRNAを用いたRT-PCRサンプルの結果です。ゲルの高い位置にあるバンドはフレームシフトしたDMD産物を示しており、未処理の筋芽細胞およびEx8A、Ex8Bで処理した筋芽細胞で確認されました。Ex6A、Ex6B、Ex8A、およびカクテル処理した筋芽細胞において、インフレーム産物が確認されました。cDNAシーケンシングにより、エクソン6から9までがスキップされたことが検証されました。本図に示されているように、免疫細胞化学の結果、AON処理したイヌ細胞は未処理のサンプルと比較してジストロフィン陽性線維が増加していることが明らかになりました。さまざまなAON治療条件の有効性を比較するため、CXMD犬にEx6A、またはEx6A、Ex6B、Ex8Aのカクテルをさまざまな用量で注射した。DYS1で染色した筋肉試料では、カクテル投与群でジストロフィン発現の増加が認められ、ジストロフィン陽性線維はジストロフィンの用量に応じて増加した。全身投与後、カクテル投与を受けたCXMD犬は、NT CXMD犬と比較して、CTおよび心筋試料の両方でジストロフィン発現の増加を示した。しかしながら、AON処理を施した骨格筋では、処理した心筋と比較してジストロフィンの発現がはるかに高くなっていました。加えて、処理を施したCXMD犬では、NT CXMD犬と比較して中心核線維が有意に減少し、組織病理学的所見の改善が認められました。習熟すれば、適切に実施することで、in vitroおよびin vivoの両方の実験を数時間で完了させることができます。この手順を行う際は、犬の健康状態を注意深く観察することが重要です。全身性エクソンスキッピングの開発により、この分野の研究者がDMD患者を対象としたヒト臨床試験を開始する道が開かれました。このビデオを視聴することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた犬の治療方法について十分に理解できるはずです。

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Medicine

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エクソン インクルー ジョン (スプライス変調) を誘導し、脊髄性筋萎縮症 (SMA) の召式を救出様々 なアンチセンスオリゴヌクレオチド (AONs) が示されています。ここでは、エーオン lipotransfection エクソン包含SMN2遺伝子の SMA...

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

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精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために

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本稿では、MYOD1変換尿由来細胞を用いてデュシェンヌ型筋の効率的なモデリングのための詳細なプロトコルを説明し、エキソンスキップ後のジストロフィンmRNAおよびタンパク質レベルの回復を評価する。...

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このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

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私たちは、犬の後肢の筋肉の強さと繰り返しエキセントリック収縮に対する筋肉の反応を測定するために低侵襲かつ無痛の方法を説明します。...

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構造化されたプロトコルは、細胞誘電分光法（CDS）を用いて、特発性脊柱側弯症の予後を予測するための機能テストのような細胞ベースのアッセイのために提示される。アッセイは、新鮮または凍結末梢血単核細胞（PBMC）を用いて行うことができ、手順は4日以内に完了する。...

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次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

学ぶマルチエクソンスキッピング法を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療。カクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドでイヌモデルに全身性ジストロフィン発現を回復させ、毒性評価も実施した革新的アプローチを解説します。

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

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