マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

この実験の全体的な目標は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはDMDの犬モデルでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはAONを使用して、複数のエクソンスキッピングの有効性と毒性を調べることです。この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが大型動物モデルで複数のエクソンスキッピングを誘導し、ジストロフィー発現を破壊できるかどうかなど、アンチセンスエクソンスキップ療法のトランスレーショナル研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。イヌモデルを研究に使用する主な利点は、大型動物の治療結果をDMD患者により確実に外挿できることです。

エクソンスキッピングはDMDの治療法として非常に有望ですが、先天性筋ジストロフィーや四肢帯型筋ジストロフィーなど、他の遺伝性疾患にも適用できます。in vitro実験のデモンストレーションは研究室長の青木義嗣先生が、in vivo実験のデモンストレーションは私の所属部署のポスドク研究員である倉岡睦樹先生が行います。テキストプロトコルに従ってAONを設計した後、6ウェルプレートを使用して、10%FBSと1%ペン連鎖球菌を含む3ミリリットルのDMEMに、1平方センチメートルあたり10〜3倍10〜3倍を播種します。

細胞を摂氏37度で60〜80%コンフルエントになるまでインキュベートします。細胞が所望のコンフルエンスに達したら、還元血清培地を使用してカチオン性リポソームトランスフェクション試薬を総容量100マイクロリットルに希釈し、混合物を室温で30〜45分間放置します。次に、減らした血清培地で、AONを最終容量の100マイクロリットルに希釈します。

希釈したトランスフェクション試薬を希釈したAONと組み合わせ、室温で10〜15分間インキュベートします。その間に、細胞から培地を取り出し、新鮮な培地を使用して細胞を3回洗浄します。次に、トランスフェクション混合物に0.8ミリリットルの培地を加え、次に新たに洗浄した細胞に溶液全体を加えます。

摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、分化培地(DM)を細胞に添加し、分化が起こるまで最大10日間インキュベートします。3日目頃から、差別化を確認します。

イヌの筋芽球のモルフォリノトランスフェクションを行うには、このビデオで前述したようにCXMD筋芽細胞を培養します。カクテルモルフォリノを摂氏65度で10分間加熱します。次に、ペプチド送達試薬を添加し、モルフォリノを最終濃度の3〜6マイクロモルに調整します。

次に、DMを使用して筋芽細胞の培地を交換し、最終濃度が1マイクロモルになるようにモルフォリノを各ウェルに添加します。16〜18時間インキュベートします。次に、RNA抽出のために細胞を収集するために、1ミリリットルのグアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルムを細胞に加えて、プレートから細胞を分離します。

細胞を室温で10分間インキュベートした後、細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。各チューブに200マイクロリットルのクロロホルムを加え、RNA層、タンパク質層、DNA層の3つの別々の層が見えるまで室温で2分間インキュベートします。12, 000倍のgと摂氏4度でチューブに15分間遠心分離します。

次に、上清の最上層を取り除き、500マイクロリットルのイソプロパノールを含むチューブに移します。上清チューブを回転させてから、上清を取り除き、RNAペレットを保存します。エタノールを使用してペレットを洗浄し、8, 000倍のgと摂氏4度で5分間遠心分離します。

チューブを15分間反転させて残留エタノールを蒸発させ、15〜30マイクロリットルのRNaseフリー水を追加します。次に、260ナノメートルのUV-Vis分光法を使用してRNAを定量します。RT-PCRを行うには、以下の試薬を混合し、最終容量の25マイクロリットルまで水を加えます。

サンプルをサーモサイクラーに入れ、次のプログラムを実行します。実行が完了したら、製品を摂氏4度または摂氏20度で保管します。筋肉内注射を行うには、動物を手術のために準備し、テキストプロトコルに従って麻酔をかけた後、メスを使用して頭蓋脛骨の上で縦方向に約5センチメートルの皮膚を切断するか、注射部位に印を付ける CT.To、手術針と手術糸を使用して、2センチ間隔で2つのステッチマーカーを作成することにより、深部筋膜を縫合します。

注射部位を糸でマークすることは、より正確な生検を可能にするため、非常に重要です。次に、27ゲージの針を使用して、必要な濃度のAONを筋肉に注入し、針を1分間放置します。次に、開腹筋生検を行うには、外科用メスを使用して、CT筋から長さ約2cmの筋肉組織片を切除します。

筋筋膜を筋肉の上に戻し、000吸収性糸を使用して組織を閉じます。その後、000ナイロン糸で肌を閉じます。針を使用して、塩酸ブプレノルフィン1キログラムあたり0.02ミリグラムの筋肉内注射を投与します。.

各AONを等量含むカクテルを四肢静脈に注入するには、テキストプロトコルに従って動物を保持しながら、静脈留置針を四肢静脈に挿入します。.輸液ポンプまたはシリンジドライバーを使用して、製造元の指示に従って、毎分2.5ミリリットルで合計50ミリリットルを20分間注入します。注射を繰り返すとジストロフィンの発現が蓄積するため、毎週または隔週で注射を繰り返します。

毒性を調べるために毎週血液検査を行うには、針を使用して前肢または後肢の皮下静脈の1つから3ミリリットルの血液を採取します。製造元の指示に従って、次の評価を含めます。テキストプロトコルに従ってさらなる分析を実施します。

筋芽細胞にさまざまな2'OMePS治療条件をトランスフェクションして、各AONの有効性を比較しました。ここに示されているゲルは、処理の4日後に採取されたRNAからのRT-PCRサンプルを表しています。ゲル上のより高いバンドは、フレーム外のDMD製品を表しており、未処理のEx8AおよびEx8B処理された筋芽細胞に見られました。

Ex6A、Ex6B、Ex8A、およびカクテル処理した筋芽細胞は、インフレーム製品を示しました。cDNAシーケンシングにより、エクソン6から9がスキップされていることが確認されました。この図に見られるように、免疫細胞化学により、AON処理されたイヌ細胞は、未処理のサンプルと比較してジストロフィン陽性線維が増加していることが明らかになりました。

さまざまなAON治療条件の有効性を比較するために、CXMD犬にEx6A、またはEx6A、Ex6B、Ex8Aのカクテルをさまざまな用量で注射しました。DYS1 について染色された筋肉サンプルでは、カクテル処理サンプルでジストロフィン発現の増加が示され、ジストロフィン陽性繊維はジストロフィンの投与量とともに増加しました。全身注射後、カクテル治療を受けたCXMD犬は、CTサンプルと心筋サンプルの両方で、NT CXMD犬と比較してジストロフィン発現の増加を示しました。

しかし、AONで治療された骨格筋は、治療された心筋と比較して、ジストロフィンの発現がはるかに高いことを示しました。さらに、治療を受けたCXMD犬は、NT CXMD犬と比較して、中央核線維の有意な減少を伴う組織病理学の改善を示しました。一度習得すれば、in vitro実験とin vivo実験の両方を、適切に行えば数時間で行うことができます。

この手順を試みるときは、犬の健康状態を注意深く監視することが重要です。その開発後、全身性エクソンスキップは、この分野の研究者がDMD患者を対象としたヒト臨床試験を開始する道を開きました。このビデオを見れば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを持つ犬の治療方法についてよく理解できるはずです。