Name: 最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶNMDG保護回復法による急性脳スライス調製法。マウスやヒトを含む様々な動物の脳領域から、パッチクランプ電気生理学に適した高品質な神経細胞を保存できます。

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この作品は、頭脳科学のためのアレンの協会によって賄われていた。著者のアレンの協会創設者、ポール g. アレンとジョディのアレン、ビジョン、励まし、サポートに感謝したいです。また、動物の世話、飼育、遺伝子型を実行するためのアレンの協会テクニカル サポート スタッフを感謝いたします。

著者が明らかに何もありません。

Na+スパイクの Gigaohm シール形成とパッチク ランプ記録の成功を向上させます。 NMDG 保護回復法の初期バージョンは、成人・高齢の動物2,5用に設計されました。一部のアーリー アダプターの少年動物脳スライスにこの方法論を適用しようとしているも (すなわち、マウス < 30 日古い)。しかし、優れた目視により確認神経保存この年齢範囲の NMDG 保護回復法を用いたと対照をなして gigaohm シール形成できます頻繁失速、パッチク ランプ失敗した試行を記録するリードが指摘されています。1 つの仮説は、NMDG 陽イオンより容易に成人の脳のスライスに対する若年脳スライスに閉じ込められているシールの形成を妨げることができます。しかし、少年の脳スライスが NMDG アプライド (データは示されていない) で完全に水中に沈む中 gigaohm シールが形作ることができる容易に、こうしてを示すその NMDG アプライド自体を妨害されていない gigaohm シール形成。
低-高 Na+ソリューション初期脳スライスの回復手順の完了時からの急速な転移神経細胞膜に損傷を引き起こすし、シールの形成過程を摂動します。低-高 Na+、冷たい・暖かい温度、および Ca2 +の劇的な上昇から Mg2 +比への移行は、総称して自発的なシナプスの大規模な復活につながることを考えれば、これは直感的。この抑制のリバウンド局面がプロシージャをスライス脳では虚血性の侮辱の後再灌流障害を反映する可能性が。したがって、さらに Na+ NMDG 保護回復培養室内濃度分布の標高はゆっくりと漸進的な Na+スパイクのプロシージャが組み込まれています最初の回復段階で神経細胞膜の損傷を軽減します。再現性をもって正確なタイミングに昇格。元の保護回復プロシージャように温度から Na+の高度と Ca2 +/Mg2 +比昇格一時的な解離は有益です。さらに、Na+スパイクの手続きが早い時点と脳組織が生じます、遅い時間ポイントに向かって大きく細胞外の Na+濃度が小さい増加につながるが、Na+濃度の上昇に合わせてより良い機会。この手順は、段階的なソリューション exchange に代わる制御灌流ポンプまたは重力によって点滴ライン Na+レベルの定数の増加につながる、流入と流出スライス チャンバーのオーバーフローを避けるために注意が必要です。特に、この Na+でスパイクの手続きスライス チャンバーに溶液の浸透圧次第にスライスは通常浸透圧溶液に返されますが、これはない健康に悪影響スライスする前に数分間の期間または、パッチク ランプ記録成功。高浸透圧切削ソリューションより良い、この一時的なパッチ クランプ記録57,58, 真正のドーパミン神経細胞を維持するために脳スライス標本で以前使用されていますhyperosmolality は、いくつかの文脈に有益である可能性があります。
NMDG 保護回復法と段階的な Na+最適化されたプロシージャを実装することで成熟した大人の動物の年齢層を介して少年をカバーするスパイクのステップこの脳スライスの方法論のユーティリティを拡張されています。この更新されたプロトコルは、単一の最適な NMDG アプライド定式化およびプロシージャを使用して動物の年齢の広い範囲に適しています今。必要に応じて、徐々 に長く遅延および/またはより古い動物から脳スライスの生存率を高める遅い時間コースと Na+スパイクの手続きを適用でき、推奨は、スパイクでのよるとスケジュールの基本的なガイドを提供しています。動物に年齢 (表 2参照)。一方、我々 は、幅広いアプリケーションに適した基本的なフレームワークを提供している、生存率と脳スライス成人・高齢の動物からの寿命をさらに強化するため追加の高度な手順を調べることができます。たとえば、グルタチオン復元戦略はこの点に特に効果的し、2,6を他の場所で説明されているように実装することができます。
実験に挑戦のためのスループットの向上 パッチ ・ クランプ記録によってシナプス結合の解析は、成功の高い信頼性を実現するために神経細胞の構造と機能の両方の優秀な保存を必要とする要求の厳しいアプリケーションです。同時に記録されるニューロンの数として上がるまで直線的にスープラ-直線的技術的な難しさのレベルが 。多数の障害モードがあります、障害の最も頻繁な原因の 1 つ 1 つまたは複数の標的細胞に十分な gigaohm 印を結びができません。進行状況、特に 3 時が大幅に低下することができますこのまたはより多くのニューロンを同時に記録する必要があります。高速の発見と一致 gigaohm 最適化された NMDG 保護回復法と形成時間をシール、トランスジェニック両方の大人と成功率と多ニューロン パッチク ランプ実験のスループットに著しい改善があったマウスの脳スライスおよび成人の脳神経外科脳スライス。効率の向上より迅速かつ信頼性の高い gigaohm シール形成とこのプロトコルとスライスの神経保存性の向上の両方にほとんど確かに起因します。このプロトコルは、パッチク ランプ記録アプリケーションを明示的に利点に焦点を当て、脳スライスの生存が最優先他の挑戦的な実験アプリケーション同様の利益が予想されます。

急性脳スライス標本は、神経科学における重要な実験系です。約半世紀のこのプラットフォームがさまざまな解剖学的な脳領域と動物種の間で動的生きている脳機能学を有効に。かどうかは、目的のアプリケーション生化学、機能イメージ投射、形態、または電気生理学は、最適な整合性とスライスした組織の生存を確保する最も重要なのです。それは、高い弾力性のある少年の齧歯動物の脳スライス標本 (すなわちマウスの生後 30 未満) の日付に最も好ましいいるこの理由です。成熟した大人からスライスの十分に健康な脳を得ることが困難とほとんどの手ごわい挑戦をあると証明した動物を高齢化し成熟した脳の機能的な建築を勉強するための厳しい制限を課しています。これは特にパッチク ランプ記録、優秀な形態および機能の保全を必要とし、特定された単一ニューロンの組み込みとシナプスの詳細なプロパティを特徴付けるために不可欠な技術に当てはまります。過去数十年間パッチ クランプ electrophysiologists の大半は少年とはるかに低い健康な脳スライスを準備するためショ糖置換低 Na+アプライド1を使用して '保護切断' メソッドに依存しています。程度、若い大人動物。このメソッドはパッシブ Na+流入とそれに続く水の侵入と細胞のスライス切断段階膨張がそれらのニューロンにあるため特にニューロンの貧しい人々 の生存につながる優勢な侮辱をあるという前提に基づいて、ブレードの動きから直接の外傷を維持する可能性が最も高い浅層。しかし、保護加工法はまだ実装されている特定のアプライドの定式化に関係なく成熟した大人の動物から脳スライス標本を望まれるべき多くを残します。
この問題にシンプルだが効果的なソリューションがされている2,3,4,5,6を説明し、'保護回復' 脳スライス法と呼ばれます。このメソッドの元のバージョンは、NMDG は、最も汎用性と様々 な他候補ナトリウム イオンの代替品 (スクロース、グリセリン、コリン、トリスなど) の間で効果的なとして同定された NMDG 置換のアプライドを使用します。メディアの定式化は、脳スライス浮腫に抵抗し、強力な pH7第をバッファリングを提供 HEPES 添加と酸化ストレス (表 1) の有害な影響を打ち消すためにサプリメントの添加によってさらに強化されました。それ、経験的に決め、最初の回復培養ステップ低 na+、低 Ca2 +、高 Mg2 + NMDG アプライド必要かつ充分にいた大人の脳組織スライス直後後が神経改善動物年齢3,5,6細胞の種類、脳の広い範囲にわたって保全。
特に、何が今保護回復法と呼ばれる以前の化身は文学1,8,9,10、11,12,で見つけることができます。13、完全な成熟した大人、動物の脳のスライスとパッチ ・ クランプ記録を高齢化はなかったが認識またはこれらの初期の作品で実証します。さらに、微妙な手順のバリエーションは、実験用途4,14,15,16を支持して出てくる続けます。これらの多数の研究グループの仕事の集合体は、改良された組織保存の保護回復法のロバスト高信頼を付与します。NMDG 保護回復法今広く採用され大人動物脳スライス標本を用いた多くの研究発表研究で実装されています。これらの急性スライス研究にまたがる新皮質3,17,18, 海馬15,19,20,21, 線条体22,23,24 日、中脳25,26,27,28,29, と後脳30,31,32,33,34領域、およびさまざまな神経伝達物質や神経調節物質のグルタミン酸作動性4,30, gaba 作動性18,20,31,35 など ,36, ドーパミン24,29,37,38, コリン作動性14,37,38, 39、40ノルアドレナリンとセロトニン27,28神経伝達。メソッドはトランスジェニック動物3,39または生体内でウイルス注射17,27、次の派生のスライスにおける神経活動の光遺伝学的制御に適しています 28,40,41,42,43, 神経活動244,の機能的な Ca2 +イメージングとして ,,4546。短期可塑性4,47,48と長期的な可塑性16,35,48の多様な形態の解析がされています。報告しました。最近の研究は広範かつ系統的な構成49を記録 octopatch を使用して成熟した成体マウスの脳スライスの視覚野のシナプス接続のプロービングを容易にする NMDG 保護回復法を適用-強力なこのメソッドの堅牢性とユーティリティのデモンストレーション。保護回復法は、血管および成人の大脳皮質脳スライス50、パッチク ランプ記録から周の保存性の向上など、以前不測の実験的コンテキストで正常に適用されているも1-1.5 歳アルツハイマー病マウス モデル20と、成人の脳スライス受容体輸送アッセイ51介在ニューロン集団を移植しました。
次のプロトコルでは、急性の脳スライスの生存率を改善するために脳スライス標本の最適化の NMDG 保護回復メソッドを実装するための手順について説明します。この複雑な多ニューロン パッチ クランプ若い大人トランスジェニック マウスの脳スライスと成熟した大人の両方の実験を記録手法の明確な利点のデモだけでなく、神経保存性の向上のための原則を紹介します。脳神経外科脳スライス。成人患者から派生した人間の脳標本はして、次のプロトコルを 1 つ以上歳 21 日古いからマウスのも検証されています。

<table><tbody><tr><td>コンプレッソーム VF-200</td><td>精密機器</td><td>VF-200</td><td>振動組織スライサー(推奨)</td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF成分</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF成分</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>チオ尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF 成分</td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモエタノール&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T48402</td><td>麻酔成分1</td></tr><tr><td>2-メチル-2-ブタノール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>240486</td><td>麻酔成分 2</td></tr><tr><td>湾曲した鈍い鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11065-07</td><td>脳解剖ツール</td></tr><tr><td>ファイン解剖ハサミ(スーパーカット)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-09</td><td>脳解剖ツール</td></tr><tr><td>大型ヘビーデューティーハサミ 7インチ</td> <td>ファインサイエンスツール</td><td>14000-18</td><td>脳解剖ツール</td></tr><tr><td>金属ヘラ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z511455-1PAK</td><td>脳解剖ツール</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>脳解剖ツール</td></tr><tr><td>ブレイン スライス キーパー-4</td><td>科学</td><td>S-BSK4</td><td>脳スライス保持チャンバー</td></tr><tr><td>ナイロン ネットを自動化&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0198</td>小さな<td>スライス回収チャンバーの構築用</td></tr><tr><td>パイレックスガラスビーカー(250mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td>小さな<td>スライス回収チャンバーの構築用</td></tr><tr><td>35 mmプラスチック皿、丸型</td><td>VWR</td><td>100488-376</td>小さな<td>スライス回収チャンバーの構築用</td></tr><tr><td>ガス拡散器石(10&micro;m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>定型カルボゲン化(微細気泡)用</td></tr> <tr><td>アガロース Type I-B</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A0576</td><td>脳試料の埋め込み用</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22491229</td><td>パッチクランプ電極の充填用</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>カスタム解剖プラットフォームを作るため</td></tr><tr><td>塩酸&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H1758-100ML</td><td>培地のpH調整用</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>221465-25G</td><td>メディアのpH調整用</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>221473</td><td>メディアのpH調整用</td></tr><tr><td>プラスチックトランスファーピペット 3mL目盛り</td>付き <td>VWR</td><td>89497-676</td><td>スライストランスファー用</td></tr><tr><td>ジルコニウムセラミックインジェクターブレード</td><td>ケイデンススペシャルティブレード</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 ホウケイ酸ガラスキャピラリーw /フィラメント</td><td>キンググラスカンパニー</td><td>カスタム見積もり</td><td>ID:0.87mm、OD1.50mm</td></tr><tr><td>バイオシチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B4261</td><td>インターピペット溶液</td></tr><tr><td>ホスホクレアチン二ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P7936</td><td>インターンピペット溶液</td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>G4500-100G</td><td>インターンピペット溶液</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E3889</td><td>インターンピペット液</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>インターンピペット液</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>インターンピペット液</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>インターンピペット液</td></tr><tr><td>温水浴 (2.5L)</td> <td>VWR</td><td>13491-060</td><td>その他</td></tr><tr><td>濾紙ラウンド</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>その他の</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>アマゾン</td><td>B000BQRBO6</td><td>その他の</td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>その他</td></tr><tr><td>10X リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>その他の</td></tr><tr><td>30 mL シリンジ</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>その他の</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>その他</td></tr><tr><td>25 5/8ゲージ針</td><td></td><td>VWR89219-292</td>その他の<td></td></tr><tr><td>サーモミキサー(1.5 mLチューブブロック付き)</td><td></td>VWR89232-908<td></td><td>アガロースを溶融に保つため&nbsp;</td></tr></tbody></table>

最適化されたnを使用して急性脳スライスの準備-メチル-d-glucamine 保護回復法

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

このプロトコルはNへの実用的なガイド-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。多くの最近の研究は、神経保存と全体的な脳スライスの生存率を高めるためのこの方法の有用性を検証しました。早期導入によるこの技術の実装は、脳機能を実験的、多様なアプリケーションを使用して、動物の年齢、脳領域、および細胞のタイプの広い範囲にわたる詳細な調査を促進しています。NMDG 人工髄液 (アプライド) メディアの最適化された定式化と強化されたプロシージャを使用して確実に入手できるパッチ クランプ電気生理学のための健康な脳スライス保護回復脳スライス技術を実施するための手順のとおりです。この更新方法は、速度の大幅な改善が観察され、gigaohm の信頼性シール対象パッチク ランプ優れた神経保存、それにより挑戦的な促進を維持しながら実験を記録中に形成実験アプリケーション。代表的な結果は、若い大人のトランスジェニック マウスと成熟した大人の人間脳神経外科標本から調製した新皮質脳スライスのシナプス接続多ニューロン パッチク ランプを試金する実験の記録から提供されています。さらに、脳スライスの最適化された NMDG 保護回復法はこのように独自の方法論の限界を解決する少年と成人の両方の動物と互換性が。要約すると、様々 な種や優れた生存率および組織の保全を達成するために年齢の間で 1 つのメディアの定式化と脳スライス手順を実装できます。

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々 な実験用の動物から健康な脳のスライスを取得する使用されます。

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

この手順の全体的な目標は、パッチクランプ電気生理学実験に適した成熟した成体動物から健康な脳スライスを調製することです。したがって、この脳スライス調製のための最適化されたNMDG保護回復法により、研究者は、多くの異なる脳領域にわたる脳細胞タイプの内因性およびシナプス特性を、事実上あらゆる年齢の動物について調査することができます。したがって、この特定の技術の主な利点は、以前の方法論と比較して、より高度なニューロン保存を持つ脳スライスを調製できることです。また、これらの脳スライスはパッチクランプ録音により適しています。この方法は、成体マウスの脳組織に最適化されています。これは、神経外科的に切除されたヒト脳組織を含む、他の様々な種に利用することができます。この手順を開始するには、ティッシュスライサーマシンと手術器具を使用してスライスステーションをセットアップします。ジルコニウムセラミックインジェクターブレードを高速接着接着剤を使用してブレードアームに取り付けます。次に、試料ホルダーを挿入し、ブレードの先端を試料ホルダーの縁に合わせます。ブレードが金属をこすらないように、小さな隙間を残します。250ミリリットルのビーカーに200ミリリットルのNMDG HEPES aCSFを入れます。そして、それを氷の上で10分以上一定のカルボギンで予冷します。次に、最初の脳スライス回復チャンバーに 150 ミリリットルの NMDG HEPES aCSF を充填してセットアップします。そして、チャンバーを摂氏32〜34度の水浴に入れます。ブレインスライス保持チャンバーを設定するには、リザーバーに450ミリリットルのHEPES aCSFを充填し、使用まで一定のカーボゲン化の下で室温まで温めます。次に、50ミリリットルの円錐形バイアルの開放端を使用して、以前に準備した皿から2%アガロースのブロックを切り取ることにより、組織包埋用の溶融アガロースを調製します。コニカルバイアルをゆるくキャップし、アガロースが溶け始めるまで10〜30秒間電子レンジで加熱します。過熱しないでください。溶融したアガロースを1.5ミリリットルのチューブに注ぎます。アガロースを42°Cに設定したサーモミキサーを使用して、激しく振とうしながら溶融状態に維持します。そして、溶融したアガロースが時期尚早に固まらないように注意深く確認してください。この時点で、スライサーの付属品の冷却ブロックを氷の上で予冷します。この手順では、頭の皮膚に切り込みを入れて頭蓋骨を露出させます。次に、細かいスーパーカットハサミを使用して、頭蓋骨の上の皮膚を切り取ります。そして、頭蓋骨の尾側腹側基部の両側に横方向に小さな切開を行います。頭蓋骨の尾側背側から始めて、背側正中線を上って吻側方向に動く浅い切り込みを入れます。下にある脳を傷つけないように注意してください。その後、嗅球のレベルで正中線に垂直な最終的なTカットを行います。続いて、丸い先端の鉗子を使用して、吻側の内側の側面から頭蓋骨をつかみ、片側で尾側方向に向かって剥がします。反対側が割れるようにこの手順を繰り返します。そして、頭蓋骨の背側の半分を取り外して、脳を露出させます。無傷の脳を、あらかじめ冷やしたNMDG HEPES aCSFのビーカーにそっとすくい取ります。そして、脳が約1分間均一に冷えるのを待ちます。次に、大きなヘラを使用して、ビーカーから濾紙で覆われたペトリ皿に脳を移します。スライスの好ましい角度と関心のある脳の領域に応じて、脳をトリミングして取り付けます。取り扱い中の酸素欠乏が長引かないように、迅速に作業してください。その後、ブレインブロックを接着剤で試料ホルダーに貼り付けます。検体ホルダーの内側の部分を引っ込めて、脳ブロックを完全に内側に引き出します。次に、脳ブロックがアガロースで完全に覆われるまで、溶融したアガロースをホルダーに直接注ぎます。その後、アガロースが固まるまで、予冷したアクセサリー冷却ブロックを試料ホルダーの周りに10秒間クランプします。試料ホルダーをスライサーマシンのレセプタクルに挿入し、適切な位置合わせを確認します。その後、250ミリリットルのビーカーから残りの事前に冷却された酸素化NMDG HEPES aCSFをリザーバーに充填し、スライス中にバブルストーンをリザーバーに入れて、適切な酸素化を確保します。次に、マイクロメーターを調整して、アガロースに埋め込まれた脳標本の前進を開始します。スライサーを始動し、前進速度と振動周波数を希望のレベルに経験的に調整します。関心のある脳領域が完全に切片化されるまで、組織を300マイクロメートル刻みで前進させ、スライスし続けます。スライス手順の合計時間は15分未満である必要があります。初期のNMDG回復用。切片作成手順が完了したら、カットオフプラスチック製の牧草地ピペットを使用してすべてのスライスを収集し、150ミリリットルのNMDG HEPES aCSFで満たされた摂氏34度の回収チャンバーに移します。急性脳スライス回復ステップのタイミングは、各ニューロンの形態学的保存と電気生理学的特性の機能回復とのバランスをとるために非常に重要です。最適なナトリウムスパイクインスケジュールを決定した後、マウスの年齢に応じて、指示された時間に指示された量のナトリウムスパイクイン溶液を添加することにより、ステップYのナトリウムスパイクイン手順を実行します。ナトリウムスパイクイン溶液を初期回収チャンバーのバブラーチムニーに直接加えて、迅速な混合を容易にします。さまざまな年齢層で提供されたナトリウムスパイクインスケジュールは、非常に良い出発点です。しかし、それはあなた自身の特定の実験デザインのために最適化され、利用されるべきです。その後、すべてのスライスを室温に維持されたHEPES aCSF長期保持チャンバーに移します。パッチクランプ記録実験の前に、HEPES保持チャンバーでスライスをさらに1時間回復させます。ここでは、神経細胞の形態学的保存を評価するために、3ヶ月齢のマウスの多様な脳領域と急性スライスから取得した代表的なIR DIC画像を示します。ここに示す結果は、保護回復ステップなしで制御NMDG保護切断法を使用した結果です。一方、これらの結果は、最適化されたNMDG保護回復法によるものです。全体として、最適化されたNMDG保護回復法により、ニューロンの保存が改善されていることが観察されます。漸進的なナトリウムスパイクイン手順による最適化されたNMDG保護回復法を、元のNMDG保護回復法と比較しました。GigaOhmシール形成とパッチクランプ記録の平均時間は、段階的なナトリウムスパイクイン手順とNMDG保護回復ステップを適用した場合、劇的かつ大幅に短縮されました。このブレインスライス法で達成されたニューロン保存の改善は、局所的なシナプス結合をプローブするための多電極パッチクランプ電気生理学を含むがこれらに限定されない、困難な実験アプリケーションを容易にします。ここで示したように、脳神経外科に由来する成人のヒトex vevo新皮質脳スライスを使用します。科学者は、このビデオを見て、パッチクランプ記録に適した脳スライスを準備するために、説明した新しいナトリウムスパイクイン手順を含む最適化されたNMDG保護回復方法を実装する方法についてよく理解しているはずです。したがって、このプロトコルをマスターした後は、毎日1時間未満で脳スライス手順を完了することが可能になるはずです。また、高品質で再現性のある脳スライスが得られ、ほぼすべての年齢の動物に効果を発揮します。したがって、この手順では、この方法は、電気生理学、ライブ光学イメージングおよび光遺伝学、受容体輸送アッセイ、および脳細胞タイプの機能を探索するための他の種類の機能アッセイなどの技術を使用して、脳機能に関する問題に対処するのに適した脳スライスを準備するのに役立ちます。したがって、この技術は、研究者が、脳スライス中の成体動物からのパッチクランプ記録に従来適していない脳領域を含む、さまざまな脳領域を機能的にプローブできるようになるため、有用でもあります。

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神経科学

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