最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

この手順の全体的な目標は、パッチクランプ電気生理学実験に適した成熟した成体動物から健康な脳スライスを調製することです。したがって、この脳スライス調製のための最適化されたNMDG保護回復法により、研究者は、多くの異なる脳領域にわたる脳細胞タイプの内因性およびシナプス特性を、事実上あらゆる年齢の動物について調査することができます。したがって、この特定の技術の主な利点は、以前の方法論と比較して、より高度なニューロン保存を持つ脳スライスを調製できることです。

また、これらの脳スライスはパッチクランプ録音により適しています。この方法は、成体マウスの脳組織に最適化されています。これは、神経外科的に切除されたヒト脳組織を含む、他の様々な種に利用することができます。

この手順を開始するには、ティッシュスライサーマシンと手術器具を使用してスライスステーションをセットアップします。ジルコニウムセラミックインジェクターブレードを高速接着接着剤を使用してブレードアームに取り付けます。次に、試料ホルダーを挿入し、ブレードの先端を試料ホルダーの縁に合わせます。

ブレードが金属をこすらないように、小さな隙間を残します。250ミリリットルのビーカーに200ミリリットルのNMDG HEPES aCSFを入れます。そして、それを氷の上で10分以上一定のカルボギンで予冷します。

次に、最初の脳スライス回復チャンバーに 150 ミリリットルの NMDG HEPES aCSF を充填してセットアップします。そして、チャンバーを摂氏32〜34度の水浴に入れます。ブレインスライス保持チャンバーを設定するには、リザーバーに450ミリリットルのHEPES aCSFを充填し、使用まで一定のカーボゲン化の下で室温まで温めます。

次に、50ミリリットルの円錐形バイアルの開放端を使用して、以前に準備した皿から2%アガロースのブロックを切り取ることにより、組織包埋用の溶融アガロースを調製します。コニカルバイアルをゆるくキャップし、アガロースが溶け始めるまで10〜30秒間電子レンジで加熱します。過熱しないでください。

溶融したアガロースを1.5ミリリットルのチューブに注ぎます。アガロースを42°Cに設定したサーモミキサーを使用して、激しく振とうしながら溶融状態に維持します。そして、溶融したアガロースが時期尚早に固まらないように注意深く確認してください。

この時点で、スライサーの付属品の冷却ブロックを氷の上で予冷します。この手順では、頭の皮膚に切り込みを入れて頭蓋骨を露出させます。次に、細かいスーパーカットハサミを使用して、頭蓋骨の上の皮膚を切り取ります。

そして、頭蓋骨の尾側腹側基部の両側に横方向に小さな切開を行います。頭蓋骨の尾側背側から始めて、背側正中線を上って吻側方向に動く浅い切り込みを入れます。下にある脳を傷つけないように注意してください。

その後、嗅球のレベルで正中線に垂直な最終的なTカットを行います。続いて、丸い先端の鉗子を使用して、吻側の内側の側面から頭蓋骨をつかみ、片側で尾側方向に向かって剥がします。反対側が割れるようにこの手順を繰り返します。

そして、頭蓋骨の背側の半分を取り外して、脳を露出させます。無傷の脳を、あらかじめ冷やしたNMDG HEPES aCSFのビーカーにそっとすくい取ります。そして、脳が約1分間均一に冷えるのを待ちます。

次に、大きなヘラを使用して、ビーカーから濾紙で覆われたペトリ皿に脳を移します。スライスの好ましい角度と関心のある脳の領域に応じて、脳をトリミングして取り付けます。取り扱い中の酸素欠乏が長引かないように、迅速に作業してください。

その後、ブレインブロックを接着剤で試料ホルダーに貼り付けます。検体ホルダーの内側の部分を引っ込めて、脳ブロックを完全に内側に引き出します。次に、脳ブロックがアガロースで完全に覆われるまで、溶融したアガロースをホルダーに直接注ぎます。

その後、アガロースが固まるまで、予冷したアクセサリー冷却ブロックを試料ホルダーの周りに10秒間クランプします。試料ホルダーをスライサーマシンのレセプタクルに挿入し、適切な位置合わせを確認します。その後、250ミリリットルのビーカーから残りの事前に冷却された酸素化NMDG HEPES aCSFをリザーバーに充填し、スライス中にバブルストーンをリザーバーに入れて、適切な酸素化を確保します。

次に、マイクロメーターを調整して、アガロースに埋め込まれた脳標本の前進を開始します。スライサーを始動し、前進速度と振動周波数を希望のレベルに経験的に調整します。関心のある脳領域が完全に切片化されるまで、組織を300マイクロメートル刻みで前進させ、スライスし続けます。

スライス手順の合計時間は15分未満である必要があります。初期のNMDG回復用。切片作成手順が完了したら、カットオフプラスチック製の牧草地ピペットを使用してすべてのスライスを収集し、150ミリリットルのNMDG HEPES aCSFで満たされた摂氏34度の回収チャンバーに移します。

急性脳スライス回復ステップのタイミングは、各ニューロンの形態学的保存と電気生理学的特性の機能回復とのバランスをとるために非常に重要です。最適なナトリウムスパイクインスケジュールを決定した後、マウスの年齢に応じて、指示された時間に指示された量のナトリウムスパイクイン溶液を添加することにより、ステップYのナトリウムスパイクイン手順を実行します。ナトリウムスパイクイン溶液を初期回収チャンバーのバブラーチムニーに直接加えて、迅速な混合を容易にします。

さまざまな年齢層で提供されたナトリウムスパイクインスケジュールは、非常に良い出発点です。しかし、それはあなた自身の特定の実験デザインのために最適化され、利用されるべきです。その後、すべてのスライスを室温に維持されたHEPES aCSF長期保持チャンバーに移します。

パッチクランプ記録実験の前に、HEPES保持チャンバーでスライスをさらに1時間回復させます。ここでは、神経細胞の形態学的保存を評価するために、3ヶ月齢のマウスの多様な脳領域と急性スライスから取得した代表的なIR DIC画像を示します。ここに示す結果は、保護回復ステップなしで制御NMDG保護切断法を使用した結果です。

一方、これらの結果は、最適化されたNMDG保護回復法によるものです。全体として、最適化されたNMDG保護回復法により、ニューロンの保存が改善されていることが観察されます。漸進的なナトリウムスパイクイン手順による最適化されたNMDG保護回復法を、元のNMDG保護回復法と比較しました。

GigaOhmシール形成とパッチクランプ記録の平均時間は、段階的なナトリウムスパイクイン手順とNMDG保護回復ステップを適用した場合、劇的かつ大幅に短縮されました。このブレインスライス法で達成されたニューロン保存の改善は、局所的なシナプス結合をプローブするための多電極パッチクランプ電気生理学を含むがこれらに限定されない、困難な実験アプリケーションを容易にします。ここで示したように、脳神経外科に由来する成人のヒトex vevo新皮質脳スライスを使用します。

科学者は、このビデオを見て、パッチクランプ記録に適した脳スライスを準備するために、説明した新しいナトリウムスパイクイン手順を含む最適化されたNMDG保護回復方法を実装する方法についてよく理解しているはずです。したがって、このプロトコルをマスターした後は、毎日1時間未満で脳スライス手順を完了することが可能になるはずです。また、高品質で再現性のある脳スライスが得られ、ほぼすべての年齢の動物に効果を発揮します。

したがって、この手順では、この方法は、電気生理学、ライブ光学イメージングおよび光遺伝学、受容体輸送アッセイ、および脳細胞タイプの機能を探索するための他の種類の機能アッセイなどの技術を使用して、脳機能に関する問題に対処するのに適した脳スライスを準備するのに役立ちます。したがって、この技術は、研究者が、脳スライス中の成体動物からのパッチクランプ記録に従来適していない脳領域を含む、さまざまな脳領域を機能的にプローブできるようになるため、有用でもあります。