Name: 腫瘍の開発の評価のためのマイクロコンピュータ断層撮影を使用し、肺癌のマウスモデルでの治療に対する応答のフォローアップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶマイクロCTを用いた肺腺がんマウスモデルの腫瘍結節検出法。リアルタイムで腫瘍サイズ変化と治療応答をモニタリングし、組織学的検証で精度を確認する非侵襲的イメージング技術です。

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この作品は、日本学術振興会AEHのための科研費（グラント番号25461196）およびTB（グラント番号23390218と15H04833）からのイン援助グラント-と国立衛生研究所HL111190（DMO）を付与することによってサポートされていました。著者らは、動物の遺伝子型決定および組織切片の準備を手伝うこと​​に彼女の努力のためのみゆき山本を承認したいと思います。我々は、技術サポートおよび試薬のための共同研究資源、医学部、慶應義塾大学に感謝しています。

動物実験は、慶應義塾大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 注：本研究では、Sftpc-のrtTA及び肺腺癌が急速にドキシサイクリン6,7を含む飼料の供給により誘導後開発したトレ- FGF9-IRES-EGFP DTマウスを使用していました。しかし、すべての評価手順は、他の肺癌マウスモデルに適用することができます。 1.実験概要： <ol><li>ベースラインでの肺の状態を特定します。 <ol><li>腫瘍誘発する前に、DTマウスは8である場合 - 12週齢、第一のマイクロCTスキャンを（下のセクション2と3を参照）を行います。これは、肺のベースラインスキャンとして機能リーキー導入遺伝子によって引き起こされる自然発生的に開発した結節がないことを確認し、腫瘍誘導前、既存の肺病変が存在しないことを文書化します。 </li></ol></li><li>腫瘍誘導を開始します。 <ol><li>正規のCHからDTマウスを切り替えますドキシサイクリン飼料にOW肺胞細胞に線維芽細胞成長因子（FGF）9発現を誘導し、腫瘍成長を開始します。ドキシサイクリン飼料（200 ppm）で自由摂取を与えます。 </li></ol></li><li>マウス肺における腫瘍小結節の発達を確認します。 <ol><li>誘導前のスキャンと比較して腫瘍結節の開発を識別するためのマイクロCTスキャンを実行します。 </li></ol></li><li>治療に対する反応を評価します： <ol><li> 、治療に応答して腫瘍結節の変化を検出FGF受容体（FGFR）阻害剤AZD4547を管理するためのマイクロCTの能力を試験するために、その後、5および10週間後に追加のマイクロCTスキャンを実行します。 </li></ol></li><li>エンドポイントの評価： <ol><li> （下記のセクション6を参照）、組織学的評価のために、すべての治療群と対照マウスとプロセス組織を安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 2.マイクロCT画像取得のためにマウスを準備します。 <ol><li>マイクロCTスキャナとコンピュータの電源を入れます。 </li><li> clicクリック「R_M CT2」という名前のソフトウェア上でkは、その後、「ウォームアップ」をクリックしてください。 </li><li>マウスは、マイクロCT室から置かれる時に、サンプル台を取り外します。ラップで床を包みます。 </li><li>顕著なレベルまで麻酔気化器にイソフルランを追加することで、麻酔導入ボックスを設定します。 3L /分でイソフルラン流量を設定します。 </li><li>インダクションボックスへの酸素の流れを開始し、1L /分の流量を設定するために酸素タンクを開きます。 </li><li>麻酔導入ボックスにマウスを置いて、それが深く、自発運動の欠如によって、および（組織損傷や皮膚のブレークが発生しない皮膚の小さな倍の穏やかなピンチ、）皮膚のピンチに応答して麻酔をかけていることを確認します。 </li><li>麻酔中に角膜の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を塗布します。 </li><li>マイクロCT室を開き、サンプルのベッドの上で背側を上にしてマウスを置きます。マウスの頭部を持ち、オードにおける下肢から下方にボディを引っ張りますrはストレッチと対称的に体をまっすぐにします。 </li><li>インダクションボックスに麻酔の流れをオフにして、マイクロCT室に接続する管に向かってそれをオンにします。 </li><li>連続麻酔薬を投与するために、マウスの鼻の中に麻酔チューブを置きます。 </li><li>位置にマウスを固定するために、マウスやプラスチックラップでサンプルのベッドを包みます。 注：深い麻酔下で、スキャン中の任意のわずかな動きや、その本体のねじれがかすんイメージと解釈することが困難になりますので、サンプル床に包まれたマウスを維持することが重要です。 </li><li>マイクロCT室を閉じます。 </li><li> 90 kVの160μAと4.5分のスキャン時間にマイクロCTシステムを調整します。 50×50×50μmである24×19ミリメートルとボクセルサイズの画像範囲を設定します。ハートビートのための同期モードを使用してください。 </li><li>そのフォルダに新しい画像を保存するために、「データベース」に新​​しいフォルダを作成します。 </li><li>スキャンを開始します。 </li><li>スキャンが完了した後、空のケージにマウスを移動し、それが意識を取り戻すまでそれを観察します。それは完全に麻酔の影響から回復するまで、他のマウスとそれを入れないでください。 </li></ol> 3.事前誘導マイクロCT画像の可視化と分析： <ol><li> ：マイクロCT画像を可視化するために、次のWebサイトから無料ImageJソフトウェアをダウンロードし<a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> 。注：すべてのマイクロCTデータファイル約500 TIFファイル（.tifファイル）のスタックです。他の画像閲覧ソフトウェアを使用することもできます。 </li><li>シリアルマイクロCT画像ファイルを開き、その逆の腹部またはに首から各マウスのすべての画像をスクロールします。 </li><li>ナイーブ野生型マウスのスキャンを使用して、マウスの解剖学の知識に基づいて、胸部内の ​​異なる領域の密度は、通常の解剖学的構造を特定する（ 図1A参照 ）。 <ol><li>でカーソルを保持しますコンピュータのマウスと白っぽい腹部内臓や横隔膜から、胸を通って首まで開始、スクロールアップ。 </li><li>骨の胸のケージのランドマーク（両側に背中と肋骨で正面に胸骨、椎骨）を特定します。 </li><li>胸の前、心臓に近いと縦隔の主要な血管に心を識別します。 </li><li>その後、より小さな気管支に分岐していき、左右の主気管支に分岐する、（首と胸の上部のレベルでの小さな暗い円として）気管内腔を観察します。各気管支が密接に2または3の血管（ 図1A）に関連付けられていることに注意してください。 </li></ol></li><li>非誘導DTマウスのスキャンを調べる起動し、異常の有無を識別します。 <ol><li>任意のさらなる実験から異常な誘導前の肺の影（ 例えば、結節、気腫性嚢胞、 等 ）を有するマウスを除外します。 （ 図1C、E、G、H </strong&gt;）。 </li></ol></li></ol> 4.腫瘍の誘導： <ol><li>正常な肺のスキャンを示した実験マウスにおける腫瘍発生を誘導するために、ドキシサイクリン含有飼料（200 ppm）でに、通常の固形飼料から自分の食べ物を切り替えます。 </li></ol> 5.フォローアップスキャン： <ol><li> 10週間後、それらの肺における腫瘍小結節の発達を確認するために、すべてのマウスの第2のマイクロCTスキャンを実行する（ 図2参照 ）。 </li><li>二つのグループにマウスを分割します。一つのグループにし、10週間以上のために他の対照群とプラセボ（10週間/週6日間、胃管を経由して125μgの/ kg /日）FGFRブロッカーAZD4547を管理します。 </li><li> 5週間後 - 4第3スキャンを実行することにより、結節性陰影の変化をフォローアップ。 </li><li>治療の10週の終わりには、第4の走査を行います。 </li><li> CO 2吸入または0.1ミリグラム/ペントバルビタールを200μlの腹腔内注射で全てのマウスを安楽死させます。 </li><li>にその後、任意の異常陰影の出現/消滅（ 図3をチェック二つ以上の異なる時点で同じマウスのシリアルスキャン画像内の同様の位置を特定し、誘導後および処理に応答した腫瘍結節の動的変化を識別）。 </li><li>異なる時点で、同じマウスにおける同一平面上の識別を容易にするために、マウスの胸部内の解剖学的ランドマーク構造に興味のある面を関連付けるしてみてください。 <ol><li>このような気管、その分岐部、左右の主気管支、大動脈、横隔膜、および大血管などのランドマークを使用してください。 注：胸椎、肋骨、胸骨を含む胸部の骨理由は、スキャン位置の誤った解釈の可能性を高めるサンプルベッドの上でマウス本体の位置合わせで共通のマイナー傾く、の位置決め目印としてあまり有用です。同様に、スキャンファイル内の画像のシリアル番号がidentifyinために信頼性がありませんグラム経時ため、別の時点からマウス本体の長さの変化の同じ位置。異なる時点で同一平面を特定するのに失敗した場合や不正確さが所見の偽陽性/陰性の解釈になることがあります。 </li></ol></li></ol> 6.マウスの安楽死と肺コレクション： <ol><li> CO 2吸入または0.1ミリグラム/ペントバルビタールを200μlの腹腔内注射でマウスを安楽死させます。 </li><li>腹壁を通って長手方向に切断することによって腹部の内臓を公開します。腹部大動脈を切開することにより、肺の中の血液の量を減らすために、マウスをブリード。 </li><li>細かいハサミで振動板をスリット。これにより、肺の崩壊、胸腔からの負圧の損失をもたらします。前胸壁のリブの部分を切断して除去することにより、肺と心臓を露出。 tracheを公開するために、皮膚および軟組織を切断することによって、首の前面部分を清掃してくださいA。 </li><li>心臓や胸腺を切り取ります。食道からそれを分離するために気管の後ろに鉗子を挿入します。 </li><li>その後、G24カニューレと気管にカニューレを挿入、挿入部分の周りに糸を締めて所定の位置に固定します。 </li><li> 25センチメートルカラムを用いて気管カニューレを介して氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して肺を膨らませると固定します。カニューレを外し、喉頭への結合から、上部気管を切断し、その後、PFAの漏洩を防止するためのスレッドを締めます。 </li><li>縫合糸から気管を引いて、その添付ファイルから、それを分析し、 -ブロックエン肺でそれを削除するには、下方向に続けています。 4％PFAの5ミリリットルを含む15mlチューブに挿入します。標準のパラフィンブロック8に組織を処理した後、完全な組織浸透、定着を確実にするために、PFA、O / Nで肺を残します。 </li><li>標準的な技術を用いてヘマトキシリンおよびエオシンでミクロトームや汚れに6μmの厚さにスライスし、パラフィンブロックをカット。 </li></オール&gt; 7.組織学的評価： 注：デジタル組織学的評価のために、「スライドスキャナ」の使用は、ここに記載されているが、評価のための定期的な顕微鏡および視覚組織学的評価を使用することも可能です。 <ol><li>スライドスキャナ装置とコンピュータの電源を入れます。 </li><li> 「NDPスキャン」ソフトウェアをクリックします。 </li><li>スライドのシリーズをスキャンするためのスキャンモード」のスライドのバッチ」と「半自動モード」を選択します。 注：順次走査中にスライドを取り出し、ロボットアームは、スライドガラスの縁部上の凹凸に非常に敏感です。 </li><li>マシンにそれらをロードする前に、すべてのガラススライドのエッジを触診します。カバーガラスまたは乾燥した封入剤のいずれかの突起がある場合は、カッターやメスでそれを清掃してください。 </li><li>スライドカセットにスライドをロードします。試料のハッチを開き、所定の位置にカセットをスライドさせて「1」;。ドアを閉める。 </li><li>コンピュータ・ソフトウェアでは、「OK」ボタンをクリックして、カセットの対応する位置にあるすべてのスライドに短い説明的な名前を付けます。 </li><li> 「明」：プロファイルモードを選択します。 </li><li>暫定スキャンを開始するには、「バッチを開始」をクリックします。 注：マシンはすべてのスライドをスキャン終了すると、ソフトウェアは自動的にすべてのスライド上の組織と領域を検出し、関心領域としてそれを提案します。 </li><li>必要な場合は、マウスの左ボタンを押しながら、地域の境界線を引くことによって、関心領域を再定義します。 注：関心領域としてスライドの過大な領域を定義することははるかに長いス​​キャン時間になります。 </li><li>すべてのスライド上の利益を地域に満足したら、すべてのスライドのスキャンを開始するには、「スキャン」をクリックしてください。 注：スキャンしたファイルは、低解像度と高解像度でデジタル的に観察することができ、画像はJPEGとしてエクスポートすることができますファイル。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

腫瘍結節の開発や、より計画する肺癌関連の実験を行っている科学者を可能にする肺癌動物モデルにおける治療に対する反応のリアルタイムの肺の異常の識別と監視のためにここで説明するマイクロCTに基づく方法正確かつ効率的な実験は、時間とリソースを節約しながら。我々は以前、同じ目的の6のためにMRIを使用しています。 MRIでの肺結節の検出のためのスキャンおよびしきい値の透明度は、この研究6に記載のマイクロCTスキャンのものに劣っていました。 （異なる遺伝的背景と腫瘍誘発法と）同様の肺腺癌のマウスモデルを使用した以前の研究では、明らかに回避またはそれらがマイクロCTスキャン9,10を使用していた改善されている可能性があり、いくつかの欠点がありました。彼らはこのように交絡を危険にさらし、任意の誘導前の肺の異常や結節を特定する手段がありませんでした不適当な動物を含めることによって、それらの結果。彼らはまた、（二次性腫瘍を誘発するために）誘導後または野生型マウスに癌細胞を増殖した後、腫瘍の発達を確認する手段を持っ...

肺癌は世界1の周りの癌死の主要な原因です。肺がんの予防、早期発見、および治療 ​​の研究は世界2,3の多くの研究センターで進行中です。肺癌のためのいくつかの動物モデルが開発されており、それらは、起源の肺発癌および細胞のメカニズムの研究において、癌幹細胞の存在を決定する際に、種々の新規な治療戦略4を検査するのに有用であることが証明されています。以前のモデルは、マウス5の感受性株に発癌物質誘発性腫瘍の開始に依存していました。具体的に操作遺伝子損傷の結果としてのノックアウトと肺がんが発生したトランスジェニックマウスモデルの開発は、実質的に腫瘍の誘導を制御し、ヒト肺癌4のいくつかの側面を模倣する能力を向上させました。しかしながら、肺癌の動物モデルの使用における主要な課題は、リアルタイムの方法が存在しないことです正確に識別して、マウスの肺の腫瘍の発症や進展を監視し、そのような治療に応答して、それらの継続的な成長または減少としてそれらのサイズ、で、それ以降の変更を文書化します。これは、腫瘍を同定するために、それらの実験の結果を評価するために、いくつかの時間、労力、およびリソースを消費する技術に頼ら研究を余儀なくされました。腫瘍の誘導に応答する固有の間マウスの変動の存在は、データのばらつきを低減するために、各実験群の動物の多数の使用を必要とします。リアルタイムで処理し、腫瘍の成長または応答を評価することができないことは、サンプルからの資源の浪費で、その結果、盲目的に彼らが正しいデータを収集することを保証するために長時間の実験プロトコルで複数の時点でマウスを安楽死させるために、研究者を余儀なくされました早すぎたり遅すぎたりしている時点で収集。 本研究では、この方法は、小動物マイクロ-Cを利用しますomputed断層撮影（マイクロCT）マウスを生きているに肺腫瘍を検出し、フォローアップするためのスキャナーが導入されています。私たちは、最近記載Sftpc-rtTAのとトレ- FGF9-IRES-EGFPのダブルトランスジェニック（DT）急速にドキシサイクリン6,7-による誘導後の肺腺癌を発症するマウスを使用しました。マイクロCTの使用は、（特に）に私たちを可能に誘導する前に、異常な肺の異常でマウスを除外し、誘導後肺の腫瘍結節の発達を確認し、実験的治療に反応して腫瘍結節の変化を観察します。エンドポイントマウスの安楽死および組織学的評価は、マイクロCTを用いて行っリアルタイム評価の精度を確認しました。私たちは、この技術は、貴重な資源を節約観測時間を短縮し、結果の正確さと理解を向上させながら肺癌動物モデルを用いて、より良い計画実験を行うための道を開くだろうと信じています。

<table><tbody><tr><td>マイクロX線&ndash;コンピュータ断層撮影</td><td>リガク</td><td>R_mCT2</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer RS デジタルパソロジーシステム</td><td>浜松&nbsp;</td><td>RS C10730</td><td></td></tr><tr><td>NDP.view2&nbsp;視聴ソフト浜</td><td>松&nbsp;</td><td>U12388-01</td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器 - 漏斗充填</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>誘導チャンバー、2リットル&nbsp;W9.5 &times;D23 &times;H9.5</td><td>VETEQUIP</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Mylan</td><td>ES2303-01</td><td></td></tr><tr><td>AZD 4547</td><td>LCラボラト</td><td>リーA-1088</td><td></td></tr>ペン<tr><td>トバルビタール</td><td>共立</td><td>SOM02-YA1312</td><td></td></tr><tr><td>G24カニューレ&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>SP-FS2419</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>和光</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>SLC 日本/PMI ニュートリション インターナショナル</td><td>5TP7</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア&nbsp;</td><td>国立衛生</td><td></td>研究所 <td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Puralube vet ointment(眼用潤滑剤)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍の開発の評価のためのマイクロコンピュータ断層撮影を使用し、肺癌のマウスモデルでの治療に対する応答のフォローアップ

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

肺がんは世界で最も致命的ながんです。肺がんの新たな治療法を特定するために、世界中で集中的な研究が進められています。肺がんのいくつかのマウスモデルを使用して、がんの発生メカニズムを研究し、さまざまな治療戦略を実験しています。しかし、マウスの肺における腫瘍結節の発生を同定し、さまざまな実験的および治療的介入に応答して腫瘍結節のサイズの変化をモニターするリアルタイム技術がないため、疾患の経過と治療に対する適時の反応について正確な説明を得る能力が妨げられています。本研究では、マイクロコンピュータ断層撮影(CT)スキャナーを用いた肺腺がんモデルマウスにおける肺腫瘍の発生検出方法について述べる。次に、マイクロCTによる毎月の追跡調査により、追加の結節の出現、以前に検出された結節のサイズの増加、治療に応じた結節のサイズの減少または完全な解消など、肺腫瘍の動的な変化を特定できることを示します。最後に、このリアルタイム評価法の精度は、エンドポイント組織学的定量化によって確認されました。この技術により、肺がん動物モデルでのより複雑な実験の計画と実施が可能になり、発がんのメカニズムとさまざまな治療法の影響をより深く理解し、時間とリソースを節約することができます。

肺の異常を有するマウスの同定は、ベースラインで行いました。 DTマウスは8であった腫瘍誘導、前 - 生後12週間、すべてのマウスの肺は、マイクロCTを用いてスキャンしました。驚くべきことに、マウスの約50％は、その後の研究に含めるためには不適切と判断する私たちを強制的に異常を示しました。これらの異常は、結節状陰影、大規模な単一または複数の小さな気腫性嚢胞および/ ​​または頭葉無気肺（ 図1A、C、DE、GH）となりました。そして、FGF9導入遺伝子および腫瘍誘導は（異常なし）正常な肺のスキャンを示したマウスは、肺胞細胞とその後の腫瘍の開発にFGF9の発現を誘導するためにドキシサイクリン飼料への定期的な固形飼料から切り替えたactivated.Onlyました。腫瘍誘導開始から10週間後にマウスの肺における腫瘍小結節の発達を確認するために、マイクロCTスキャンを実施したフォローアップ。これらは、Dを明らかにしましたすべてのマウスでの可変サイズの複数の結節のevelopment（ 図<str...

私たちは、マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて腺癌マウスモデルの肺における腫瘍結節の発生を検出する方法と、その使用を経時的な結節サイズの変化および治療に反応して監視するための方法について説明します。評価の精度は、エンドポイントの組織学的定量化によって確認されました。

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

このビデオの全体的な目的は、肺がんのマウスモデルにおける腫瘍の進展、治療反応、およびその他の実験の評価において、マイクロCTを使用する利点を明らかにすることです。この手法は、腫瘍の成長開始時期、成長速度、治療介入への反応など、マウスモデルを用いた肺がん研究分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。また、この技術を用いることで、腫瘍サイズのリアルタイムな変化を検出しながら、どの個体を研究から除外すべきかを判断することが可能になります。この手法により時間と労力が節約され、1研究グループあたりのマウス数を大幅に減らすことができます。Micro-CTスキャナーからコンピューター制御にアクセスし、「RMCT2」という名称のソフトウェアパッケージを開きます。次に、ウォームアップサイクルを開始します。続いて、マウス用のスキャナーサンプルベッドをプラスチックで包んで準備します。次に、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、皮膚をピンチして麻酔状態であることを確認します。皮膚の小さなひだを軽くつまむだけで十分です。続いて、角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。次に、マウスを背面が上になるようにサンプルベッドに置きます。マウスの頭部を固定し、下肢から体を下方へ引っ張り、体を対称的に伸ばして真っ直ぐにします。その後、麻酔ガスをチャンバーに導入し、ガスチューブを動物の鼻の横に配置して、継続的に麻酔を投与します。次に、マウスを固定するため、マウスとサンプルベッドをプラスチックで包みます。スキャン中のいかなる動きやねじれも、画像のぼけや使用不能な結果を招くため、マウスが確実に固定されていることを確認してください。ここでチャンバーを閉じ、システムの電圧を90 kilo-volts、電流を160 micro-ampsに調整し、スキャン時間を4.5分に設定します。画像範囲を 24 millimeters に設定します。次に、心拍に同期するようにシステムを同期モードに設定します。続いて、データベース内に新しい画像用のフォルダを作成し、スキャンを開始します。スキャン完了後、マウスを空のケージに移動させ、意識が回復するまで観察します。麻酔から完全に回復するまで、同居個体の元に戻さないでください。Image Jで連続マイクロCT画像ファイルを開きます。各マウスの画像を、頸部から腹部、またはその逆の方向へスクロールして確認します。次に、ナイーブな野生型マウスのスキャンを用いて、胸部の異なる領域の密度と正常な解剖学的構造を確認します。白っぽく見える腹腔内臓器と横隔膜までスクロールし、胸部から頸部にかけての領域を特定してください。胸郭の骨格上の指標である胸骨、椎骨、および肋骨に注目してください。次に、胸部の前面にある心臓と、心臓付近および縦隔にある主要血管を確認します。気管腔は、頸部および胸部上方のレベルにある小さな暗い円状の構造で、右および左の主気管支に分かれ、その後さらに細い気管支へと分岐し続けます。各気管支には、2〜3本の血管が密接に随伴していることに留意してください。次に、未誘導のDTマウスのスキャン結果を確認し、異常の有無を特定します。結節や肺気腫性嚢胞など、誘導前に肺野に異常が認められるマウスは実験から除外してください。本実験では、FGF9誘導腫瘍を形成させることが可能な、肺スキャンが正常なマウスを使用します。腫瘍を誘導するため、飼料に200 ppmのドキシサイクリンを添加します。10週間後、これらのマウスに2回目のMicro-CTスキャンを行い、肺に腫瘍結節が形成されていることを確認します。その後、マウスを2つのグループに分けます。FGFR阻害剤であるAZD4547を、胃管を用いて一方の群に投与します。これを週6日、10週間にわたって行います。もう一方の群にはプラセボを投与します。治療開始から4〜5週後に3回目のスキャンを行い、結節状影の変化を追跡します。その後、全10週間の治療終了時に4回目のスキャンを実施します。そして、異なる時点での連続スキャン画像における同様の位置を比較することにより、治療に対する腫瘍結節の動的な変化を特定します。異常な陰影の出現または消失を確認します。結果を正しく解釈するためには、同一の解剖学的位置に正確に合わせることが不可欠です。気管、気管分岐部、左右の主気管支、大動脈および大血管、横隔膜など、胸部内で容易に識別できる解剖学的指標を利用してください。体の傾きがあるため、骨を指標にするのはあまり有効ではありません。マウスを安楽死させ、頸部と肺に到達させた後、心臓と胸腺を切除します。気管の背後にピンセットを挿入し、食道から分離させます。次に、G24カニューレを用いて気管にカニュレーションを行い、気管チップの周囲に配置した縫合糸を結んでカニューレを固定します。続いて、カニューレを介して氷冷した4%PFAを注入し、25cmの水柱を用いて肺を膨張・固定します。その後、カニューレを取り外し、PFAの漏出を防ぐために気管の結び目を締め上げます。次に、喉頭への付着部を含め、上気管を切断します。縫合糸で気管を牽引しながら、気管と肺をすべての付着部から剥離します。その後、気管と肺をまとめて摘出します。組織を、室温の4% PFA 5mlを含む15mlチューブに入れます。組織への完全な浸透と固定を行うため、肺をPFAに一晩浸漬させます。その後、通常通りに組織を処理します。本研究における8〜12週齢のDTマウスの事前スクリーニングにおいて、約半数の個体にMicro-CTスキャンで肺の異常が認められ、組み入れ不適格となった。本研究では、10週間の腫瘍誘導の後、治療を行った。FGFR阻害剤であるAZD4547を10週間投与したマウスでは、治療前のスキャンで確認された結節の消失またはサイズの縮小が認められた。一方、プラセボを投与した対照マウスでは、変化が見られないか、結節サイズの増大、および／または新たな結節の出現が認められました。肺の最終点における組織学的評価により、Micro-CTスキャンで得られた所見の正確性が確認されました。肺が清浄であると判断されたマウスは、実際に正常な肺組織像を示しました。一方、異常を示したマウスでは、水疱や結節を含むさまざまな組織学的変化が認められました。ドキシサイクリンによる誘導後10〜12週間で、すべての個体において、サイズと位置が異なる複数の腺がん結節が観察されました。その後、FGFR阻害剤を10〜12週間投与したところ、結節の数とサイズが減少しました。このビデオを視聴することで、Micro-CTを用いてマウス肺における腫瘍の発達を評価する方法、およびさまざまな実験操作に対するこれらの腫瘍の変化を追跡する方法について、十分な理解を得ることができます。マウスの検体が準備できれば、1匹あたり10分未満でスキャンを行うことが可能です。この手順を行う際は、マウスを深い麻酔状態に保ち、スキャン中の動きを最小限に抑えるためにサンプルベッドにしっかりと固定することが重要です。本技術の開発により、肺がんおよびがん幹細胞分野の研究者が、腫瘍の発生範囲や進行性の退行を探索し、さまざまな実験設定を行うことが可能となりました。X線を用いた作業には危険が伴うことに留意してください。本手順を実施する際は、常に標準的な装置操作手順に従ってください。

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Medicine

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