DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

この手順の全体的な目標は、液滴デジタルPCR技術を使用して、血漿や血清などの循環中のマイクロRNAおよび体液を定量化することです。この方法は、バイオマーケット分野の質問に答えるのに役立ちます。診断および予後、バイオマーケティングの癌を特定することによって。

この技術の主な利点は、高感度です。また、存在量が少ないmicroRNAも、両性具有の参照遺伝子を必要とせずに定量化することができます。この方法の意味は、早期がんの人々を特定する可能性があるため、がんの診断にまで及びます。

また、神経障害や心臓障害などの他の疾患にも適用できます。一般に、個人は、熱サイクルステップの前に液滴の操作に注意を払う必要があります。したがって、液滴生成の視覚的なデモンストレーションは、不注意な操作や速すぎるピペッティングによって液滴が破壊される可能性があるため、非常に重要です。

この手順は、血漿または血清マイクロRNAを単離することから始めます。次に、添付のドキュメントで説明されているように、それらを逆転写および希釈します。EvaGreenマスターミックスmicroRNAプライマーセットとcDNAを冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。

解凍後、マスターミックスチューブを数回反転させます。そして、すべての試薬をスピンダウンします。添付のドキュメントの指示に従って、Droplet DigitalまたはddPCRミックスの作業溶液を調製します。

各条件にテンプレートなしのコントロールと10%を超えるサンプルを最大8個まで調製します 組み立てたら、ddPCRミックスを完全に混合してスピンダウンします。このテクノロジーは再現性が高いため、技術的な複製は不要であることに注意してください。スピン後、12マイクロリットルのddPCRミックスを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。

各ウェルに8マイクロリットルの希釈cDNAテンプレートを加えます。次に、液滴発生器カートリッジをカートリッジホルダーに挿入します。液滴発生カートリッジの中央の列に、準備した各サンプルの20マイクロリットルを慎重に移します。

井戸の底に気泡を入れないでください。一番下の列の各油井に70マイクロリットルの液滴発生器オイルを入れます。ガスケットをカートリッジホルダーに引っ掛けます。

液滴発生器に挿入し、蓋を閉めて液滴生成を開始します。液滴の発生が終了したら、蓋を開けて液滴発生器からカートリッジを取り外し、使い捨てガスケットを取り外します。カートリッジの上部ウェルには液滴が含まれています。

8つのトップウェルのそれぞれから40マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの1つのカラムにゆっくりとスムーズに移します。蒸発を防ぐために、プレートをすぐにホイルで密封してください。プレートをシールしてから30分以内に、添付文書の表3に記載されているPCRプロトコルを使用してサーマルサイクリングを開始します。

ドロップレットリーダーの電源を入れます。次に、プレートをサーマルサイクラーから液滴リーダーに移動します。PCR後の液滴を含む96ウェルPCRプレートを、液滴リーダーのプレートホルダーの基部に置きます。

プレートホルダーの上部をPCRプレートに置きます。両方のリリースタブをしっかりと押し下げて、PCRプレートをホルダーに固定します。システムPCからQuantaLifeソフトウェアを起動します。「Setup」をクリックし、サンプル、標的遺伝子、およびアッセイに関する情報を含むテンプレートデータファイルを開きます。

左側のナビゲーション バーから、実行 を選択します。[実行オプション]ウィンドウが表示されます。Dye SetメニューからEVAを選択し、OKをクリックして液滴の読み取りを開始します。

実行が完了したら、解析ソフトウェアの2D振幅プロットを使用して、正の液滴を選択します。ポジティブな液滴を選択するには、左側のナビゲーションバーからなげなわツールを使用します。次に、[イベント]タブをクリックして、ポジドロップレットと総ドロップレットの数を確認します。

通常、プローブレスddPCRでは合計18,000個の液滴が達成されます。次に、[Concentration]タブをクリックして、濃度の最終サンプルを視覚化します。最後に、エクスポートを使用します。

CSV で microRNA 濃度値をエクスポートします。mRNA miR-181a-5p は、58 °C と 60 °C のアニーリング温度で 0.5 と 1 マイクロリットルのプライマー濃度を使用して、S1 と S2 の 2 つの血漿サンプルで定量しました。この図は、各条件の増幅反応におけるマイクロリットルあたりのmicroRNAのコピーを示しています。

各サンプルのPCR陽性液滴は青色で、陰性液滴は黒色で示しています。ここでわかるように、コントロールサンプルには予想どおりの陽性液滴はありません。0.5マイクロリットルまたは1マイクロリットルのプライマーを使用して摂氏60度でPCRを実行すると、陽性と負の液滴の分離が改善されました。

この図では、エラーバーはポアソン95%信頼区間を表しています。そしてここでは、青色で示されている正の液滴の数を、緑色で示されている液滴の総数と比較しています。まとめると、これらのデータは、液滴デジタルPCRを使用して、生体液のマイクロリットルあたりのマイクロRNAのコピーの絶対数を決定できることを示しています。

このビデオを見れば、液滴デジタルPCRを使用したmRNA定量の実行方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、わずか数時間で96個のサンプルを分析でき、臨床現場に最適な出力です。開発が進むたびに、この技術は、疾患のバイオマーカーとしてマイクロRNAやその他の核酸を探求するためのリキッドバイオプシーの分野への道を開きます。