Name: カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶIgM抗体の抗原同定法。免疫沈降とウェスタンブロッティングを用いて、治療可能性のあるヒト抗体の標的を特定する手法です。神経科学や免疫学の研究に応用可能です。

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この作品は、国立衛生研究所（R01 GM092993、R01 NS048357とR21 NS073684）、国立科学財団（CAREER賞）、バイオ・医療ゲノミクスのためのミネソタ・パートナーシップ賞、全国多発性硬化症協会（CA1060A）からの助成金によってサポートされていました臨床およびトランスレーショナル科学、およびメイヨークリニックセンター（CCATS）。著者はApplebaum氏、ヒルトン、ピーターソンサンフォード財団、月とマリリン・パーク取締役基金とMcNeilusの家族からのサポートを認めます。

再髄鞘形成と中枢神経系修復を促進する抗体の特許は、メイヨークリニックによって発行され、所有されています。著者には潜在的な利益相反があります。

ヒトの天然のIgM自己抗体は、免疫療法の候補を訴えており、癌およびCNS障害1-7を含む様々な疾患の治療のための治療の可能性を実証しました。有利なことに、これらの抗体は、中和抗体の生成が実質的に効果的な治療用量および有効性を低減する免疫応答を誘発しないであろう。重要なことは、治療可能性を持つすべての抗体はIgMアイソタイプのあったとのNAbレパートリー3-5,8,9,37,40,42-45に属しています。 IgM抗体の潜在的な臨床応用のための主要な障害は、多くの場合、未決定され、それらの抗原の同定です。 IgG抗体のために使用される標準的な技術は、多くの場合、IgM抗体の抗原を同定するために適用されません。 このプロトコルは、動物モデルにおいて有効で、回生ヒトIgM抗体HIgM12のための抗原として​​PSA-NCAMの同定を記載しますMSおよびALS 15-18の。使用した方法にかかわらず、抗体のアイソタイプの、VκI軽鎖を有する特定のVκ軽鎖VκI、VκIIIとVκIVとマウス抗体とヒト抗体全てに主に適用されます。 このプロトコルにおいて最も重要な工程は、アフィニティークロマトグラフィー用途でのIgM抗体の使用です。より具体的には、成功した抗体を単離するか、複雑な組織または細胞培養溶解物から抗原を濃縮するために免疫沈降にプルダウン剤として作用するために必要とされます。濃縮された抗原の画分は、アイソタイプ対照抗体の免疫沈降と比較し、続いて質量分析による差を分析することができます。一つの必須要件またはこの工程の制限は、プロテインLアガロースに結合する抗体を有効にするために適切な抗体Vκ軽鎖および宿主（ヒト、マウス）の存在です。アガロースに結合したマンナン結合タンパク質の使用（また、カレ代わりにプロテインLアガロースのDマンノース結合レクチン）は、特定のVκ軽鎖なしのIgMを免疫沈降させる潜在的な代替手段です。 アーノルドら 35で述べたようにしかし、抗原が結合したIgM抗体は、IgM抗体は、その抗原に結合した後にターゲットグリカンはアクセスできなくなるように見えるように、マンナン結合タンパク質に結合しません。これらの知見に基づいて、マンナン結合タンパク質が抗原負荷のIgM 35を分子免疫沈降する結合マトリックスとして使用することができません。他の潜在的な代替案は、二次アガロースに結合した抗IgM IgG抗体46,47または表面活性化磁気ビーズ48の使用を使用することがあります。たIgMに対するIgG抗体は、目的の抗原とともに溶出抗体の程度を低減するために、AまたはGアガロースをアガロースに化学的に架橋することができました。首尾よく同定された抗原に対するIgM抗体の免疫沈降の異なる亜種間の適切な比較Iほとんどの免疫沈降を単離またはその抗原のさらなる関心なしのIgMを枯渇させるために行ったので、難しいですね。また、のIgMを用いた免疫沈降は、主に、精製抗原49に対する抗体の曝露を有する既知のまたは予想される単一の抗原性を確認するために使用しました。出発物質50と比較した場合、免疫沈降血清IgM分子の- （15％10）ヒトのIgMに対して指向アガロース結合IgGの欠点は、非常に低い収率です。対照的に、表面活性化磁気ビーズは、正常スクレーピー関連原線維48を免疫沈降するためにIgMを含む、異なるアイソタイプの抗体に適用しました。この方法は、特定のκ（Vκ）またはラムダ（λ）鎖、または特定のホストに限定されず、実質的に免疫沈降に使用されるIgM抗体のスペクトルを広げることができます。 プロトコルにおけるもう一つの重要なステップは、DETとして機能する抗体の能力でありますウェスタンブロットまたは他のスクリーニングプラットフォームにおける抗体（一次抗体）をecting。成功した抗体は、抗原はおそらく、非イオン性またはイオン性界面活性剤の存在下での結合を可能にするために十分に高い親和性で、その抗原を標的としなければなりません。高親和性抗体は、親和性成熟IgG抗体間で共通するが、比較的生化学設定でエージェントを検出するなど、いくつかの市販のIgM抗体が存在する理由の一つであるIgMアイソタイプの抗体の間であまり一般的ではありません。抗体の高親和性結合は、分子の抗原の免疫沈降およびウェスタンブロッティングのための必要条件です。洗剤濃度またはIPバッファおよび溶解緩衝液中の界面活性剤が完全に存在しないことを下げると、そのFabドメインを介して低親和性抗体による標的抗原を可能にします。これとは対照的に、そのFc部分を介して、プロテインLアガロースを標的とする抗体の能力は実質的に異なる洗剤concenの範囲にわたってアイソタイプコントロール間で影響を受けることはありませんtrations。しかし、溶解緩衝液およびIP緩衝液中で低い界面活性剤濃度は、細胞膜の破壊および特定の分子の単離を防止します。同様に、ウェスタンブロット洗浄緩衝液中の低洗剤濃度（ 例えば、PBS-T）は、抗原は、低親和性の抗体の結合が、同時に非特異的結合を増加させ、したがって、オプションではないことができます。 抗原タンパク質のコアの存在は、この方法のための別の要件です。翻訳後修飾（ 例えば 、糖タンパク質、リポタンパク質）および非修飾タンパク質ではなく、唯一の脂質または炭水化物とタンパク質は、ウェスタンブロットで検出可能です。界面活性剤の存在下または非存在下で組織または細胞溶解物からの脂質（ 例えば、スフィンゴ脂質）を免疫沈降することができません。同時に、洗剤が破壊するのに不可欠でありながら、界面活性剤および脂質の物理化学的性質は、選択的脂質抗体の相互作用を可能にするにはあまりにも似ています特定の分子を選択的に単離を可能にするために、膜。私たちの最高の知る限りでは、単に炭水化物から成る免疫沈降は、タンパク質コアが存在しない場合には、以前に報告されていません。 IgM抗体はしばしば、必ずしもタンパク質ユニットにリンクされていない炭水化物や糖脂質を、標的とすることから、これは特に関連になります。他のクロマトグラフィー技術は、タンパク質コアの非存在下における脂質と炭水化物の分離および免疫学的同定のために必要とされます。例えば、TLCプレート（免疫TLC）上の後続の抗体検出と細胞脂質の薄層クロマトグラフィー（TLC）は、51,52に実装することができます。 他の抗PSA抗体が市販の抗PSAのIgMならびにHIgM12と比較した以前の研究と結果に記載されている（クローン2-2B）。 PSAの分野で最も一般的に使用される抗体は、マウスmonocとして利用可能なIgG抗体（クローン735）であり、lonalまたはウサギポリクローナル抗体53。この抗PSA IgG抗体は、ミクログリア細胞41を含む種々のCNS ​​細胞型にSynCAMとNCAMのPSAを検出します。抗PSA IgG抗体とは対照的に、ヒトIgM抗体HIgM12、HIgM42および抗PSAマウスIgM（ク​​ローン2-2B）はSynCAMにPSAをターゲットにすることができない（しかしNCAM上）マウスにおける様々な胚および出生後早期の段階で非ポリシアルSynCAM 15、容易に検出可能です。使用されるIgM抗体はまた、ミクログリア細胞（ 図3 + 4）のPSAを検出することができません。抗体アイソタイプ間で観察された差異のための可能な説明は、抗PSAのIgGと比較して、IgM抗体の結合可能性の低い親和性で結合さPSA-NCAMのレベルに比べて低いPSA-SynCAMレベルであってもよいです。この仮説を検証するために、我々は&lt;SynCAM存在する膨大な量の胚段階E17でNCAM KO動物で免疫沈降を行い、「プルダウン剤」としてHIgM12を使用しましたSUP&gt; 15。 E17 WT同腹仔でHIgM12溶出した抗原を使用して、後続のウエスタンブロットにおけるデンシトメトリーによって検出されたIgM重鎖と比較して、PSA-NCAMを「プルダウン」の同様の強度を示した程度のPSA-NCAMを免疫沈降を制御します。この結果は、その標的PSAにHIgM12の少なくとも十分な親和性を示唆しました。 WT同腹子とは対照的にHIgM12はNCAM KO動物でSynCAMに取り付けられたPSAは検出されなかった制御します。同一の結果は、ヒト抗PSAのIgM HIgM42を用いて免疫沈降で得ました。 HIgM12とHIgM42、ならびにマウス抗PSA IgM抗体（クローン2-2B）は、胚および出生後の発達段階でWTとNCAM KO動物からウェスタンブロットでSynCAMにPSAをターゲットにすることができませんでした。特にCNS組織の少量を用いたウエスタンブロットにおいてNCAMに取り付けられたPSAを検出するために必要なHIgM12の少量（0.1μgの/ mlで）（ウェルあたり0.1μgのCNS ​​組織）15与えられ、単独で低親和性であることがそうであるように思われます3つの異なる方法でHIgM12によるPSA-SynCAM検出の完全な欠如を担当。 我々は、抗PSA IgM抗体としばしば公開抗PSA IgG抗体（クローン735）との間に有意差があると結論付けます。市販の抗PSA IgM抗体がHIgM12が既に異なる疾患モデルにおいて有効性を証明しているので、これは特に興味深いantiPSA IgG抗体735で得られた結果を確認するために、過去においてより頻繁に使用されなかった理由は明らかではありません。他の抗PSA IgM抗体は、同様の治療効果を有することができるが、それは、抗PSA IgG抗体（クローン735）は、MSおよびALSのモデルにおいて同様の治療結果を有するかどうかは不明のままです。 要するに、ここに記載される方法は、MS及びおそらく他の神経変性疾患のための潜在的な臨床試験をサポートするために、回生ヒト抗体HIgM12の抗原を同定するために主に使用されました。アリの識別生物学的活性を有する抗体のためのigensは、それらの作用機序を理解するとして必要不可欠なステップです。これは、現在臨床試験で安全性と有効性のためにテストされている多数のモノクローナル抗体の文脈で特に関連性になります。これまでの臨床的に試験されたIgM抗体の数が少ないが、この抗体クラス1-10,37,40,42-45の治療可能性を強調した研究の増加と共に、ハイブリドーマ技術における最近の進歩は、新規または開発を促します非タンパク質のIgM抗原を同定するために適用改変方法。

IgMアイソタイプの抗体は、癌およびCNS障害1-7を含む様々な疾患の治療のための優れた治療可能性を実証します。 Vollmers &#39;基が腫瘍特異的なバイオマーカーまたはアポトーシス経路4,8,9を誘導することによって悪性細胞を死滅させることができる積極的な治療薬としての潜在的な使用のために癌患者における多数の抗体を同定しました。興味深いことに、治療可能性を持つすべての同定された抗体はIgMアイソタイプのものであり、「自然な自己抗体」（NABS）のグループに属しています。 同様に、ロドリゲスのグループは、マウスおよび多発性硬化症（MS）のモデルでは慢性的に脱髄脊髄病変において再ミエリン化を刺激するヒト抗体を同定しました。抗癌作用を有する抗体と同じ、すべての再ミエリン化を促進する抗体がNABSであり、IgMアイソタイプ1,6,7,10の。ほとんど識別されたIgMのための正確な抗原は、まだundetermineあります人間の再ミエリン化を促進する抗体rHIgM22含むD、現在MS患者11のための第I相臨床試験インチ学術設定でと業界11とのパートナーシップの両方の脂質や糖質研究の分野の専門家による繰り返しの努力にもかかわらず、rHIgM22の抗原は成功していない識別しよう。 IgM抗体で動作するようにIgG抗体の抗原を同定するために使用される標準的な技術の失敗は、これらの抗体、最も可能性の高いターゲット炭水化物や脂質抗原に特異的な方法を改良するための重要なニーズを特定します。 本稿の焦点は、ヒト回生抗体HIgM12とその抗原を識別するために使用される実験手順です。抗体HIgM12は、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する患者から同定された、 試験管 12月14日 に神経突起伸長を刺激し、神経細胞接着分子（PSA-NCAに取り付けられたポリシアル酸（PSA）を標的M）15,16。 HIgM12は、ALS 17のマウスモデルにおいて寿命を延ばし、タイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）に感染したマウスにおける機能転帰を改善します。腹腔内の単一の低用量は、抗体18を注入した後、具体的には、HIgM12は中小直径脊髄の軸索8週間の慢性脱髄マウスと増加数の自発的な水平および垂直運動活性を刺激します。 神経細胞接着分子（NCAM）のスーパーファミリー、ニューロン、神経膠、骨格筋、およびナチュラルキラー細胞19-25の細胞表面上に発現される免疫グロブリン（IG）の糖タンパク質です。 NCAM180、NCAM140、およびNCAM120と呼ばれる三大NCAMアイソフォームは、その細胞質ドメインにのみ変化する一次転写産物の選択的スプライシング変異体です。 CNS内では、NCAMが長く、負に帯電したシアル酸のホモポリマーとの主要なポリシアル分子（&gt; 95％）です。ポリシアルAN&gt; 10とCIDは、PSAと呼ばれているが、短いオリゴマー構造はまた、生物学的に関連していることが存在します。 CNSで発現される他のポリシアルタンパク質はSynCAM1 26、ニューロピリン-2（NRP-2）27,28であり、ナトリウムチャネルサブユニット25（総説については29を参照されたいです）。 ここで説明する方法にかかわらず、抗体のアイソタイプ（ 例えば、IgG、IgM抗体の特定のカッパ（Vκ）軽鎖（ヒト抗体およびマウス抗体のためのVκI軽鎖のためのVκI、VκIIIまたはVκIV軽鎖）を含むヒトおよびマウスの免疫グロブリンのための抗原同定を可能にします、IgAの、IgDのまたはIgE）。この制限は、IgMアイソタイプの抗体での免疫沈降のためにプロテインLアガロースの使用に基づいています。代替戦略は、より多くのIgM抗体株式会社に、この方法の適用可能性を広げることができる共有結合アガロースビーズに結合マンノース結合レクチンとセカンダリのIgG抗IgM抗体を含むことができます。ラムダ（λ）軽鎖を有するものをluding（説明を参照してください）​​。 1 30：健康な個体由来のIgMλ軽鎖と比較して、血清IgMのVκ軽鎖の比率は1.5です。 、分離充実、および免疫学的に特定の分子31を検出するために、ここで使用したクロマトグラフィーの方法論に基づいて、すべての抗原は、少なくとも一つの小さなタンパク質ドメインを含める必要があります。抗体の特異的結合エピトープは（、糖タンパク質で、 例えばリポタンパク質）タンパク質ドメイン内または外であっても。潜在的な候補者のリストを絞り込むために、それぞれ、HIgM12のための特定の抗原を識別するために使用される初期の生化学的な手順は、このメソッドの中で最も重要なステップです。細胞型特異的調製物および細胞形態学に基づく特徴付けは、グリア細胞のために記載されているが、この方法は、CNS内部または外部の他の細胞型を収容するために外挿することができます。 緊急があります抗体のターゲットは、炭水化物や脂質の構造は特にこれらのケースで異なるヒトの疾患の治療の可能性を持つIgM抗体の増加（IgM型抗原の大多数）に適用可能な新規または変更された技術を開発する必要があります。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>高グルコース、グルタミン配合、ピルビン酸ナトリウム配合、500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12、HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、高グルコース</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml、100ml</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>無血清、10 ml</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>灌漑用滅菌水</td><td>Baxter Healthcare</td> <td>#2F7114</td><td>USP-1,000 ml、12/CA</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine 臭化水素酸</td><td>シグマ</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot;xHBr、分子量30,000-70,000 g / mol、50 mg</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン画分</td>V<td>シグマ</td><td>A-3294-100G</td><td>熱ショック画分、プロテアーゼフリー、pH 7,&nbsp;純度98%、100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G5767-500G</td><td>C<サブ>6</サブ>H<サブ>12</サブ>O<サブ>6</サブ>、 分子量:180.16 g / mol、ACS試薬、500 g</td></tr><tr><td>トリプシン(ウシ膵臓由来</td>) <td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>基本的に無塩、凍結乾燥粉末、9,000 BAEE単位/mgタンパク質</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Type IV、凍結乾燥粉末、2,000 Kunitz units/mg タンパク質</td></tr><tr><td>組換えラット FGF 塩基性タンパク質</td><td>R&Dシステム</td><td>3339-FB-025</td><td>キャリアタンパク質としてのBSA、25 &#181;g、凍結乾燥、> 95%、16.2 kDa</td></tr>、<tr><td>組換えラットPDGF-AAタンパク質</td><td>R&Dシステム</td><td>1055-AA-50</td><td>キャリアフリー、50&#181;g、凍結乾燥、> 97%、大腸菌由来、12.5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml、グルタミンなし、アスパラギン酸なし、グルタミン</td></tr>酸<tr><td>パラホルムアルデヒド</td>なし<td>、ΣP6148-1KG</td><td></td><td>結晶性、1 kg、試薬グレード、分子量 30.03 g/mol (モノマーとして)</td></tr><tr><td>トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg、純度 99.8%、粉末</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, 粉末</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, 分子量:75.07 g/mol, 白色結晶性粉末, 5 kg</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, 分子量:58.44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4、分子量:119.98 g/mol、500 g</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>カルシウムとマグネシウムなし、6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>60 mm Cell Culture Dish, TC-treated ポリスチレン, 20/パック, 滅菌済み</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Not TC-treated Bacteriological Petri Dish, 20/pack</td></tr><tr><td>6 well Cell Culture plates</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 well, 平底 (個別包装), ガンマ線照射, 増殖面積 9.5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 組織培養フラスコ</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2;U字型傾斜ネック細胞培養フラスコ、プラグシールキャップ</td></tr><tr><td>ピアス付き&貿易;Protein L Plus Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml、架橋6%ビーズアガロース (CL-6B)、結合能:10 to 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-well, 50 &micro;l、ミニプロティアン電気泳動細胞</td></tr><tr><td>Immobilon-Pメンブレン</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF、0.45&microで使用します。m, 26.5 cm x 3.75 m roll</td></tr><tr><td>Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 μLliters, 宿主:マウス、モノクローナル IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x premixed protein sample buffer</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 純度 98 %, 14.2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50マイクロリットル、200マイクロリットル;g/ml, 3,500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm ガラスカバースリップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Circles No. 1;厚さ:0.13〜0.17 mm;サイズ:25 mm</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630-080</td><td>100 ml、1 M</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド</td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン生化学協力</td><td>LS003119</td><td>凍結乾燥粉末、100 mg</td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩</td><td>シグマ</td><td>M-2643-500G</td><td>粉末、500 g</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml、200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

カッパ（vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（igm抗体）抗体：ポリシアル酸（psa）ケーススタディとしてncamに添付

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

IgMアイソタイプの抗体は、ヒトの試験、ヒト疾患の動物モデル、および標準的な実験室技術における検出薬剤の潜在的な治療薬としてしばしば無視されます。対照的に、いくつかのヒトIgMは、がんモデルおよび多発性硬化症(MS)や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などのCNS障害のモデルで有効性の証明を示しました。彼らが考慮されていない理由には、IgM抗体の発現、精製、安定化の難しさ、(非タンパク質)抗原の同定の難しさ、アフィニティー結合の低さ、炭水化物および脂質研究における基本的な知識のギャップなどがあります。
この原稿では、HIgM12を例に、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫細胞化学による抗原検出の詳細なプロトコールを提供しています。HIgM12は、神経細胞接着分子(NCAM)に結合したポリシアル酸(PSA)を標的としています。3つの主要な中枢神経系(CNS)スプライスバリアントNCAM180、140、および120を欠く野生型(WT)およびNCAMノックアウト(KO)マウスの出生後早期マウス脳組織を使用して、HIgM12への結合に対するNCAMの重要性を評価しました。エンドヌラミニダーゼを用いたCNS組織および培養CNS細胞のさらなる酵素消化により、PSAがHIgM12の特異的結合エピトープであることを同定しました。

このセクションでは、CNS中のヒトIgM特異PSA抗原を研究することによって得られる結果の例を示します。生化学的な設定で、蛍光免疫細胞化学により特定のVκ軽鎖を含むヒトIgM抗体の使用が示されています。 HIgM12は、脳の脳溶解物からの抗原を免疫沈降し、ウェスタンブロットで検出エージェント（一次抗体）として機能します。どちらのアイソタイプ対照抗体もアガロースLビーズは、プルダウン（ 図1）の特異性を示す類似の抗原を、免疫沈降します。 WTとNCAM KOからCNS溶解物を用いたウエスタンブロットは、マウスは、PSA-含むNCAM（ 図2A）にHIgM12結合の特異性を実証します。 ENDO-NFを使用して、WTマウスからのCNS ​​組織の酵素消化はHIgM12に対する特異的な結合エピトープ（ 図2BとNCAMに取り付けられたPSAを識別する）。本明細書に概説された方法を用いて、高純度のIBA-1陽性ラットミクログリア培養物（ 図3）が得られます。市販の抗PSA抗体（クローン2-2B）は固定で、細胞表面や内部PSAプールにラベルを付け、蛍光顕微鏡によりIBA-1陽性ミクログリア細胞を透過処理しません。 HIgM12は、精製されたラットミクログリアにおける細胞表面抗原にラベルを付けていないミクログリア16,41におけるPSA-NCAMのない細胞表面発現を報告していない、以前に発表された文献と一致し。興味深いことに、特定の細胞小器官（ 図3）に限定されるものではなく、細胞内での固定と透過処理ミクログリア結果、核周囲パターンのHIgM12ラベリング。結果は、ゴルジ体41のレベルでミクログリアにおいてPSA-SynCAMを標的とする抗PSA IgG抗体（クローン735）26を用いて得られたものとは対照的です。 ミクログリアとは対照的に、HIgM12そして生細胞の状況（ 図4）の下に高度に濃縮されたラットOPC培養物におけるA2B5の標的細胞表面抗原。 OPC培養物は、ミクログリア細胞を汚染〜5％が含まれている。 図5は、GFAP陽性アストロサイト（ 図5A）でHIgM12および抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）との間に実質的に同一の細胞表面染色パターンを示しています。 HIgM12を使用して制御処置WT星状細胞を緩衝するために比較ENDO-NF-消化WT星状細胞の免疫蛍光標識はアストロサイトのPSA（ 図5B）の存在を示しています。 インビボで PSA陽性アストロサイトの存在は、まだ確認されなければなりません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> 図1：HIgM12は免疫沈降で「プルダウン」をエージェントとして機能する免疫沈降HIgM12を使用して、3ヶ月齢のマウスの脳全体の溶解物から、ヒトアイソタイプコントロールHIgM唯一の「プルダウン」剤として126またはアガロースLビーズ。溶出したタンパク質はHIgM12に対してプローブした膜を用いたウェスタンブロットで行いました。 （ - 73 kDaの〜65）のIgM重鎖に加えて、200キロダルトン - HIgM12コーティングビーズから溶出したタンパク質の分子量は、160の範囲でした。この図は、Jから変更されていますNeurochem。15。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> 図2：HIgM12はNCAMのポリシアル酸（PSA）部分を対象としています。 P7、P13、P16とP27 NCAMの総KOマウスおよびヘテロ接合同腹子対照からA.脳ホモジネートは、ローディングコントロールとしてHIgM12、PSAおよびβアクチンに対するプローブした膜を用いたウェスタンブロットで行いました。 <stronPBS中の1％NP40で大人WTマウスの脳溶解物のグラム&gt; B。10μgの、pHは6.5で処理したendoneuraminidase N（ENDO-N）（エキソ）α2-3ポリシアル酸ポリマー特異性（シアリダーゼ）とノイラミニダーゼまたはPBSで一晩37ºCは、ウェスタンブロットでダブレットとして実行され、ローディングコントロールとしてHIgM12、PSAおよびβアクチンに対するプローブしました。この図は、Jから変更されていますNeurochem。15。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> 図3：ラットミクログリア上のPSAの不在がHIgM12ラベリングの欠如によって反映されたラットミクログリアは、ポリ-D-リジンコーティングしたカバーガラス上で48時間培養し、HIgM12と氷の上またはHIgM12または抗で固定した後、ライブの標識のいずれか。 -Psaモノクローナル抗体（クローン2-2B）。細胞は、トンでしたripleミクログリアマーカーIBA-1（緑）、HIgM12 / PSA（赤）およびDAPI（青）で標識しました。画像は、ミクログリア細胞表面HIgM12（上段）および抗PSAは、初代ラットミクログリア（下段）で、細胞表面や内部に格納する（クローン2-2B）の結合の欠如を使用して、結合の欠如を示しています。双極性形態およびIBA-1染色の欠如に基づいて、小PSA陽性細胞（下段）がOPCであることが示唆されました。固定した細胞では、HIgM12染色は、特定の細胞小器官に限定されませんでしたし、非特異的結合（中段）と考えられていたpunctated、核周囲のパターンが得られた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> 図4：HIgM12 は、ラットのOPC上の細胞表面PSA-NCAMをターゲットラットのOPCとミクログリアがcultuました。HIgM12またはA2B5（緑）、内部マクロファージ/単球マーカーCD68と氷の上で生きて標識されたポリ-D-リジンコートしたカバーガラスとトリプル上の増殖培地中で4日間、赤（クローンED-1）（赤）およびDAPI（青） 。画像は、OPCマーカーA2B5（上段）といくつかのCD68陽性ミクログリアとHIgM12（下段）（〜5％）のための細胞集団がすぎなかっ正示します。位相コントラストとDAPI画像は各集団のための細胞の完全性と細胞数を明らかにするために追加されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> 図5：HIgM12 と抗PSAモノクローナル抗体は、マウス混合グリアにおけるアストロサイトの亜集団を共同標識。アストロサイト、オリゴデンドロサイト系譜細胞およびマイクログラムを含むWTおよびNCAM総KO動物からA.マウス混合グリア細胞LIAは、3日間培養し、HIgM12（緑）、抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（赤）、続いてアストロサイトマーカーGFAP（紫）およびDAPI（青）のために氷上でのライブラベルされました。 HIgM12および抗PSAはGFAP陽性WTのアストロサイト上の仮想同一の染色パターンを明らかにしたがNCAM KOマウスから培養アストロサイトへの結合を欠いています。この図は、Jから変更されていますA.で説明し、（親切に博士マルティナMuehlenhoff提供）endoneuraminidase-NFまたはPBSコントロールで一晩処理としてNeurochem。15。B.混合グリアは、同じように培養しました。細胞をHIgM12と氷（緑）でライブ標識し、その後、内部マーカーGFAP（赤）およびDAPI（青）について染色しました。 HIgM12をPBS-コントロール処置混合膠細胞培養の細胞表面抗原を標的とするがendoneuraminidase-NFはない混合グリアを治療しました。この図は、JNSCI 16から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">PL</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックして容易になります。 すべての画像は同一の機器設定を使用して、60Xの倍率で撮影したと同じように処理しました。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> 表1：バッファおよびソリューションのレシピ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> CNS組織 </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> 溶解バッファー </td><td> 全容積 </td></tr><tr><td> 1. WTマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td> 2μL（12μgの）ENDO-NF </td><td> 7.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> 2. WTマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td> 2μlのPBS </td><td> 7.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> 3. WTマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td>無PBSまたはENDO-NF </td><td> 9.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> 4. NCAM KOマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td> 2μL（12μgの）ENDO-NF </td><td> 7.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> 5. NCAM KOマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td> 2μlのPBS </td><td> 7.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> 6. NCAM KOマウス</td><td> 67μgの（0.45μL） </td><td>無PBSまたはENDO-NF </td><td> 9.55μlの</td><td> 10μlの</td></tr></tbody></table> 表2：P7 WTとNCAM KOマウスからのCNS ​​組織のENDO-NF消化。

特定のκ(Vκ)軽鎖を持つヒトおよびマウスのIgM抗体の抗原を含むタンパク質部分を特定するためのプロトコルを提示します。このプロトコールは、IgMクラスの抗体に限定されるものではなく、免疫沈降時に抗原を十分に高い親和性で標的とするすべての免疫グロブリンアイソタイプに適用されます。

カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

この手順の全体的な目的は、IgMアイソタイプに焦点を当て、治療への応用の可能性がある抗体の抗原を特定することです。この手法はバイオメディカル分野における知識の空白を埋めるものであり、がん研究や中枢神経系疾患に対する新規のバイオマーカーおよび免疫治療薬の特定に寄与する可能性があります。この技術の主な利点は、極めて高い治療潜在能力を持ちながらも見落とされてきた抗体クラスへの道を開くことにあります。本手法の意義は、抗体ベースの治療法の標的となり得るあらゆる疾患の診断および治療へと広がります。これにより、IgM抗体の抗原や、培養組織およびサブカルチャーに関する知見を得ることが可能です。また、あらゆる種の他の抗体アイソタイプへの応用も期待できます。この手法を着想したのは、さまざまな生化学的アプリケーションにおいてIgM抗体が特異的かつ顕著に結合することに気づいた時でした。本手順のデモンストレーションを行うのは、Robert KahoudとJens Watzlawikです。まず、耳の高さで頭蓋骨の前方に向けて切開し、頭蓋骨を剥離させます。次に、脳を15 milliliterチューブに慎重に投入し、直ちにドライアイスで保存します。5分後、脳を清潔な量量紙に移し、清潔なカミソリを使用して小脳と脳幹を速やかに除去します。次に、凍結した大脳の重量を測定し、氷上の15 milliliterチューブに戻します。氷冷した溶解バッファーを、溶解バッファー1 µLあたり脳組織150 µgの最終濃度になるように加えます。次に、1 mLピペットチップでトリチュレーションを行い、続いて27ゲージの針を装着した5 mLシリンジでトリチュレーションすることで、溶解バッファー中で脳を均質化します。その後、組織を完全に溶解させるため、脳溶解物を氷上でさらに30分間インキュベートします。30分後、連続遠心分離を行い、界面活性剤、不溶性物質、および脳脂質を除去します。ミエリンと細胞残渣を含むペレットは廃棄しますが、各遠心分離ステップ後の上清は回収して保持してください。脳溶解液を分注し、-80°Cで保存します。このステップでは、BSA含有IPバッファーを200 milliliters、およびBSA非含有IPバッファーを200 milliliters準備します。免疫沈降反応のために、Protein Lアガローススラリー100 microlitersを1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。チューブにBSA含有IPバッファー1 milliliterを加えます。次に、転倒混和により手動で混ぜ合わせます。続いて、遠心分離によりProtein Lアガロースビーズを4回洗浄します。その後、アガロースペレットを乱さないように上清を除去し、洗浄手順をさらに3回繰り返します。次に、IPバッファーを含む新鮮なBSAをProtein Lアガロースに添加し、ローラーを用いて4°Cで一晩インキュベートします。BSAを含む800 µLのIPバッファーと30 mgの溶解脳組織に、20 µgの実験用抗体、コントロール抗体、またはPBSを添加します。1.5 mmマイクロ遠心チューブ内で、氷冷したIPバッファー中の30 mgの溶解脳組織とIgM抗体を、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、ベンチトップ遠心機を用いてProtein Lアガロースビーズを遠心分離します。アガロースペレットを乱さないように注意して上清を除去します。その後、冷却した抗体脳溶解液をProtein Lアガロースに加えます。抗原抗体とProtein Lアガロース懸濁液を、ローラーを用いて4 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、遠心分離によりアガロースLに結合した抗原抗体複合体を洗浄します。ペレットを乱さないように注意して上清を慎重に除き、0.2% BSAを含む氷冷IPバッファー 1 mLを添加します。0.2% BSAを含む氷冷IPバッファーを用いて洗浄ステップをもう1回繰り返し、その後、BSAを含まない氷冷IPバッファーを用いてさらに2回繰り返します。その後、アガロースLに結合した抗原抗体複合体を遠心して沈殿させます。200 µLピペットを使用して、Protein Lアガロースペレットの上に約50 µLの溶液が残るまで上清を除去します。次に、10 µLピペットを使用して、それを完全に除去します。すべてのサンプルを氷上で保持します。次に、1.5 mLマイクロセントリフュージチューブにIP溶出バッファーを40 µLずつ加えます。チューブを指で6回弾いて混ぜ合わせ、95 °Cで5分間加熱します。その後、サンプルを氷上で2分間静置し、30秒間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を35 µL取り、新しい1.5 mmマイクロ遠心チューブに移します。続いて、希釈したサンプルを少量チューブの内壁に沿わせて流し、Protein Lアガロースビーズが混入していないことを確認します。Protein Lアガロースビーズが存在する場合は、サンプルをさらに13,000 ×gで30秒間遠心分離し、上清を清潔なチューブに移します。アガロースビーズが検出されなくなるまでこの操作を繰り返します。次に、希釈したサンプルを1ウェルあたり10-20 µLずつ、SDSポリアクリルアミドゲルおよびトリス-グリシンSDSバッファーシステムにロードし、追加の冷却を行わずにベンチトップで100 Vにて約1時間電泳します。続いて、タンパク質をPVDF膜に転写します。冷室にて、冷やした転写バッファーを用い、100 Vで2時間30分間転写を行います。その後、PBS-Tで調製した10% (w/v) 脱脂粉乳を用いて、ベンチトップオービタルシェーカー上で25 °Cで1時間、膜をブロッキングします。PBS-Tを用いて、1回10分間の洗浄を2回行います。5%BSA含有PBS-Tで希釈した一次抗体でメンブレンをプローブします。コールドルーム内のオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。翌朝、メンブレンを25°Cで十分な量のPBS-Tで1回洗浄し、続いてオービタルシェーカーを用いてPBS-Tで10分間の洗浄を3回行います。次に、二次抗体およびPBS-Tで調製した5%脱脂粉乳をメンブレンに加え、オービタルシェーカーを用いて25°Cで1時間インキュベートします。その後、メンブレンを25°Cで十分な量のPBS-Tで1回洗浄し、続いてオービタルシェーカーを用いてPBS-Tで10分間の洗浄を3回行います。冷却した強化化学発光HRP基質コンポーネントA 1 mLとコンポーネントB 1 mLを25 °Cで混合します。メンブレンをペーパータオルの上に移動させ、余分な液体を取り除きます。その後、容器をペーパータオルで拭いて乾燥させてから、メンブレンを容器に戻します。直ちに、あらかじめ混合したenhance chemiluminescence HRP基質2 mLをメンブレンに加え、25 °Cで2分間インキュベートします。20秒ごとに容器を手で傾け、メンブレンを均一に湿らせます。その後、メンブレンを透明なプラスチック製スリーブに移し、ペーパータオルで過剰な液体と気泡を取り除きます。プラスチックスリーブをカセットにテープで固定し、カセットを閉じます。この図は、HigM12が大脳脳ライセートから抗原を免疫共沈させ、ウェスタンブロットにおいて検出剤として機能することを示しています。アイソタイプコントロール抗体およびアガロースLビーズのいずれも同様の抗原を免疫共沈させないことから、プルダウンの特異性が実証されます。野生型およびNCAMノックアウトマウスのCNSライセートを用いたウェスタンブロットにより、HIgMがPSA含有NCAMに特異的に結合することが示されます。野生型マウスのCNS組織をENDO-NFで酵素消化することにより、NCAMに付着したPSAがHIgM12の特異的な結合エピトープであることが特定されます。本法を用いることで、高純度のIBA-1陽性ラットミクログリア培養細胞が得られます。ミクログリアとは対照的に、生存細胞条件下でのラットOPC培養において、HIgM12およびA2B5の標的細胞表面抗原が高度に濃縮されていました。この技術を習得すれば、13労働時間以内に完了させることができます。本手順の後に、Biacoreや表面プラズモン共鳴技術などの他の手法を用いて、抗体の結合親和性、解離定数および結合定数を特定することが可能です。この技術の開発により、がん研究、免疫療法、および天然自己抗体分野の研究者が、ヒトの治療用IgM抗体の抗原となるタンパク質上の糖鎖エピトープを特定する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヒトIgM抗体を含む研究において糖タンパク質抗原を同定する方法を十分に理解できるはずです。得られたデータは、MS治療の新たな標的を提供します。我々が開発した抗体治療であるPSA ENCAPは、多発性硬化症に類似した疾患の厳格なモデルを用いてアクティビティボックスでの機能改善を示した最初期の治療法の一つです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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