カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付

この手順の全体的な目標は、IgMアイソタイプに焦点を当てて、治療可能な可能性のある抗体の抗原を同定することです。この方法は、生物医学分野における知識のギャップを埋め、がん研究や中枢神経系の疾患に対する新規のバイオマーカーや免疫療法薬の同定に役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、大きな治療可能性を秘めた、無視されたクラスの抗体への扉を開くことです。

この技術の意味するところは、抗体ベースの治療薬によって標的とされる可能性のあるすべての疾患の診断と治療にまで及びます。この問題がIgM抗体の抗原と成長する組織および継代培養に関する洞察を提供することができるもの。また、すべての生物種の他の抗体アイソタイプに対する病害となることもあります。

私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、さまざまな生化学的アプリケーションでのIgM抗体の特異的で顕著な結合を実現したときでした。手順のデモンストレーションは、Robert KahoudとJens Watzlawikです。この手順を開始するには、耳の高さで頭蓋骨を正面に向けて切り込み、頭蓋骨をはがします。

次に、脳を15ミリリットルのチューブにそっと入れ、すぐにドライアイスで保管します。5分後、脳を清潔な計量紙に移し、清潔なカミソリの刃を使用して小脳と脳幹をすばやく取り除きます。次に、凍結した大脳の重さを量ってから、氷の上の15ミリリットルのチューブに戻します。

氷冷溶解バッファーを、溶解バッファー1マイクロリットルあたり150マイクログラムの脳組織の最終濃度まで添加します。次に、1ミリリットルのピペットチップによるトリチュレーションと、27ゲージの針を備えた5ミリリットルのシリンジによるトリチュレーションにより、溶解バッファーで脳をホモジナイズします。その後、脳ライセートを氷上でさらに30分間インキュベートし、完全な組織溶解を可能にします。

30分後、界面活性剤、不溶性物質、脳脂質を除去し、連続遠心分離します。ミエリンとペレットを含む細胞破片を廃棄しますが、遠心分離ステップごとに上清を保持します。脳溶解物を分注し、摂氏80度で保存します。

このステップでは、BSAを含む200ミリリットルのIPバッファと、BSAを含まないIPバッファ200ミリリットルを準備します。免疫沈降反応では、100マイクロリットルのプロテインLアガローススラリーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。BSAを含むIPバッファー1ミリリットルをチューブに加えます。

その後、手動で反転して混ぜます。次に、Protein Lアガロースビーズを遠心分離により4回洗浄します。その後、アガロースペレットを乱さずに上澄みを取り除き、さらに3回洗浄手順を繰り返します。

次に、新鮮なBSA含有IPバッファーをProtein Lアガロースに加え、4°Cのローラーで一晩インキュベートします。BSAと30ミリグラムの溶解した脳組織を含む800マイクロリットルのIPバッファーに、20マイクログラムの実験用抗体、コントロール抗体、またはPBSを添加します。溶解した30ミリグラムの脳組織を、氷冷したIPバッファーとIgM抗体で、1.5mmの微量遠心チューブ内で摂氏4度で一晩インキュベー

翌日、Protein Lアガロースビーズを卓上遠心分離機でスピンダウンします。アガロースペレットを乱さずに上清を捨てます。次に、冷却した抗体脳ライセート溶液をProtein Lアガロースに加えます。

抗体抗原、プロテインLアガロース懸濁液を4°Cのローラー上で2時間インキュベートします。2時間後、アガロースLに付着した抗体抗原複合体を遠心分離して洗浄します。ペレットを乱さずに上清を慎重に捨て、0.2%BSAを含む氷冷したIPバッファーを1ミリリットル加えます。

0.2%BSAを含む氷冷IPバッファーを使用して洗浄手順をもう1回繰り返し、BSAを含まない氷冷IPバッファーを使用してさらに2回繰り返します。その後、アガロースLに付着した抗体抗原複合体をスピンダウンし、200マイクロリットルのピペットを使用して上清を廃棄し、約50マイクロリットルの溶液がプロテインLアガロースペレットの上に残ります。次に、10マイクロリットルのピペットを使用して完全に取り外します。

すべてのサンプルを氷の上に置いておきます。次に、1.5 mL の微量遠心チューブごとに 40 μL の IP 溶出バッファーを添加します。チューブを6回指でフリックし、摂氏95度で5分間加熱します。

その後、サンプルを氷上に2分間置き、30秒間スピンダウンします。次に、ペレットを乱さずに、35マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリメートルの微量遠心チューブに移します。次に、チューブ内壁で希釈した少量のサンプルを洗い流して、Protein Lアガロースビーズが存在しないことを確認します。

プロテインLアガロースビーズが存在する場合は、サンプルを13, 000倍gでさらに30秒間スピンダウンし、上清をきれいなチューブに移します。アガロースビーズが検出されなくなるまで、この手順を繰り返します。次に、ウェルあたり10〜20マイクロリットルの希釈サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルおよびトリスグリシンSDS緩衝システムにロードし、追加の冷却なしでベンチトップでゲルを100ボルトで約1時間泳動します。

次に、タンパク質をPVDFメンブレンに移します。タンパク質は、コールドトランスファーバッファーを使用して、コールドルームで100ボルトで2時間半移動します。ベンチトップオービタルシェーカーで、PBS-Tで10%重量の粉乳で膜を25°Cで1時間ブロックします。

PBS-Tで毎回10分間、2回洗ってください。PBS-T中の5%BSA中の一次抗体でメンブレンをプローブします。コールドルームのオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。

翌朝、メンブレンを過剰なPBS-Tで摂氏25度で1回洗浄し、続いてPBS-Tでオービタルシェーカーでそれぞれ10分間3回洗浄します。次に、二次抗体とPBS-T中の5%粉乳をメンブレンに添加し、オービタルシェーカーで摂氏25度で1時間インキュベートします。その後、過剰なPBS-Tでメンブレンを摂氏25度で1回洗浄し、続いてオービタルシェーカーでPBS-Tでそれぞれ10分間3回洗浄します。

冷やした化学発光HRP基質AとB1ミリリットルを25°Cで混合します。メンブレンをペーパータオルに移して、余分な液体を取り除きます。次に、ペーパータオルで容器を乾かしてから、メンブレンを容器に戻します。

直ちに、あらかじめ混合した強化化学発光HRP基質を2ミリリットルをメンブレンに加え、摂氏25度で2分間インキュベートします。20秒ごとに容器を手で傾けて、メンブレンを均一に湿らせます。その後、メンブレンを透明なプラスチックスリーブに移し、ペーパータオルで余分な液体と気泡を取り除きます。

プラスチックスリーブをカセットにテープで固定し、閉じます。この図は、HigM12が脳の脳溶解物から抗原を免疫沈降させ、ウェスタンブロットの検出剤として作用することを示しています。アイソタイプコントロール抗体もアガロースLビーズも、プルダウンの特異性を示す類似の抗原を免疫沈降させません。

ここでは、野生型およびNCAMノックアウトマウスのCNSライセートを用いたウェスタンブロットにより、NCAMを含むPSAへのHIgM結合の特異性が示されています。ENDO-NFを用いた野生型マウスのCNS組織の酵素消化により、NCAMに結合したPSAがHIgM12の特異的結合アピトープであることが特定されました。本明細書で概説する方法を用いて、高純度のIBA−1陽性ラットミクログリア培養物が得られる。ミクログリアとは対照的に、HIgM12およびA2B5標的細胞表面抗原は、生細胞条件下でラットOPC培養で高度に濃縮されました。

一度習得すれば、このテクニックは13労働時間以内に行うことができます。この手順に続いて、Biacoreや表面プラズモン共鳴技術などの他の方法を使用して、抗体が会合および会合定数に結合する親和性を同定できます。その開発後、この技術は、がん研究、免疫療法、および天然自己抗体の分野の研究者が、ヒトの治療用IgM抗体の抗原として類似タンパク質上の炭水化物アピトープを特定する道を開きました。

このビデオを見れば、ヒトIgM抗体を含む研究のための糖タンパク質抗原の同定方法について十分に理解できるはずです。このデータは、MS治療の新たな標的を提供します。私たちが開発した抗体治療薬であるPSA ENCAPは、多発性硬化症と同様に疾患の価値を下げる疾患にある厳密なモデルを使用して、アクティビティボックスの機能改善を最初に示したものの1つです。