Name: 突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ、CRISPR-Cas9を用いたワクシニアウイルスゲノム編集法。CV-1細胞へのトランスフェクションと蛍光顕微鏡によるプラーク同定で、従来法より100倍以上の効率で突然変異体を10日間で作成できます。

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この作業は、MRC DPFS助成金（MR/M015696/1）および中国科学技術省））によって支援されました）。

標的RNAとCas9構築と修復ドナーベクターの作製<ol><li> gRNAsのクローニング<ol><li>以前に25に述べた原則以下のワクシニアウイルスのN1L遺伝子を標的ガイド-RNA標的配列を設計します。ワクシニアウイルスのゲノムに対してガイドRNA標的配列を整列させる（この場合には、ワクシニアウイルスのLister株）は、任意のオフターゲットgRNA標的配列を排除します。 </li><li>合成し、以前に25記載されているようにgRNAクローニングベクターにgRNAオリゴクローンを作成。サンガー配列決定33によって得られたベクター内の個々のgRNAのシーケンスを確認してください。 gRNA N2 33として構築結果のgRNAに名前を付けます。 注：gRNA標的部位は、N1L遺伝子内にあり、左腕と右腕との間の領域にあることを修復ドナーベクターカバー（ 図1参照）。 </li></ol></li><li>核局在化シグナル（NLS）を欠いているCas9遺伝子をクローニングpST1374ベクトルとPST-Cas9 33のような構造体を指定します。 注：クローニングベクターの任意の哺乳動物発現がCas9発現ベクターの構築のために使用することができます。 </li><li> HRの修復ドナーベクターの構築<ol><li>修正33のための標的領域としてVVのN1L遺伝子を使用してください。左右のアームの長さが約500から600 bpのそれぞれであることを確認し、ターゲット領域に隣接します。 注：左腕/右腕は、標的領域と最大50 bpのオーバーラップを持つことができます（ 図1を参照してください）。 </li><li>以前に33、34説明したようにN1L領域修理ドナーベクターのクローンを作成し、PT-N1Lとして修理ドナーベクターを指定します。 注：修理ドナーベクターとその対象領域については、 図1を参照してください。 VVのその他の地域は、地域（遺伝子）特異的gRNA（複数可）および地域固有の修理ドナーベクターを用いて標的とすることができます。任意のクローニングベクターは、修復ドナーベクターの構築のために使用することができます。 </li> &lt;/ OL&gt; </li><li>プラスミドの拡大<ol><li>化学的コンピテントE.にプラスミドをトランスフォームコリ 、製造者の指示に従って。製造業者によって供給されたプロトコルを参照のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを精製します。 </li></ol></li></ol> 2.播種細胞（1日目） <ol><li> 5％COで37℃、5％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCV-1細胞（サル腎臓線維芽細胞）を、維持します2。 </li><li> 80〜90％のコンフルエントであるトリプシン処理CV-1細胞<ol><li> CV-1細胞を含有するT-175フラスコから細胞培養培地を除去します。残留血清を除去し、PBSを吸引する滅菌PBS 5mLで単層を洗浄します。セルをカバーし、細胞剥離を補助するために約5分間37℃のインキュベーターにフラスコを置く2.5mLの1×トリプシン-EDTA溶液を加えます。 </li><li>加えます穏やかなピペット操作によって細胞を懸濁するための細胞培養培地10ml（ステップ2.1参照）。血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li> 6ウェルプレート中の細胞を播種<ol><li> 6ウェルプレートの各ウェルに細胞培養培地2mL中のシード2×10 5 CV-1細胞のトランスフェクションの前日。 注：トリプシンを除去するための追加の遠心分離工程を必要としません。 </li></ol></li></ol></li></ol> Cas9プラスミドとgRNAプラスミドの3トランスフェクション（2日目） <ol><li> 0.5μgのPST-Cas9プラスミドで、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて、0.5μgのgRNA N2プラスミド（ステップ2.2.3.1で調製した）トランスフェクトCV-1細胞。 </li><li>インキュベーター中で24時間細胞をインキュベート（37℃、5％CO 2）、その後（ステップ2.1参照）新鮮な細胞培養培地2mlで培地を交換してください。 </li></ol> CV-1細胞およびシャトルドナーVの4感染エクタートランスフェクションHRのための（3日目） <ol><li> 2×10 5 PFU / mLの濃度にDMEM細胞培養培地でバックボーンVVL15ウイルスを希釈します。 Cas9とgRNAプラスミドのトランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされたCV-1細胞の各ウェルに希釈したウイルスの100μLを追加します。 </li><li> 2時間後、ウイルス感染、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を使用してHRためVVL15感染細胞に1.0μgのシャトルドナーベクターをトランスフェクトします。 24時間、5％CO 2で37℃インキュベーターでトランスフェクトされた細胞を置きます。 </li></ol> 5.収穫組換えウイルス（4日目） <ol><li>ステップ4.2でのHRのためのシャトルドナーベクターでのトランスフェクションの24時間後、セルスクレーパーを用いてトランスフェクションCV-1細胞を切り離します。クリオバイアルに細胞懸濁液を収集し、将来の使用のために-80℃で保存します。 注：すぐに消毒剤を有する任意の細胞培養培地のこぼれをふき取り、その後、70％エタンで再び拭きオール。 </li></ol>変更されたVV（ファーストラウンド）の6.精製<ol><li> 1日目に、各ウェル中の3×10 5 CV-1細胞を15 6ウェルプレートに播種します。 <ol><li> 2日目、3分間37℃の水浴中でステップ5.1からの凍結細胞懸濁液を解凍し、細胞残屑を除去せずに細胞溶解物を得るために、30秒間激しくクリオバイアルをボルテックス。 </li></ol></li><li> CV-1細胞の6ウェルプレートの感染のために、DMEM 3mlの細胞溶解物の1μLに希釈し、既に媒体の上に、6ウェルプレートの各ウェルに希釈した細胞溶解物の0.5 mLを加え存在。ステップ6.1で調製した全6ウェルプレートに感染します。 注：細胞破片の除去が必要とされません。 </li><li>感染の2日後（ すなわち、4日目）、プラークの位置を周回することにより、マーカーペンを使用して、プレートの下プラークを10倍対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下でRFP陽性プラークを同定し、ラベルを付けます。 メモ： <st栄&gt;代表RFP陽性プラークについては、図3。 <ol><li> 6異なるRFP陽性プラークをピックアップして、200μLの無血清DMEM細胞培養培地を含む6ラベルされたクライオバイアルを準備します。標識されたプラーク（S）（ステップ6.3）を用いてウェルから細胞培養培地を吸引。 、P200ピペットに200μLチップを取り付けて30μLで音量を設定し、1クライオバイアルから〜10μLの細胞培養培地を取ります。 </li><li>メディアを解放せず、ピペットのプッシュボタンを押しながら、1ラベルされたプラークの面積を傷つけチップを使用しています。剥離した細胞を持ち上げ、無血清DMEMの190μLを含むクライオバイアルにそれを転送するために、ピペットのプッシュボタンを放します。 </li><li> （最後のステップからの）傷細胞をバイアルから別の10μL培地を取り、できるだけ多くの傷の細胞を収集するために3回同じRFP陽性プラークを拾うの手順を繰り返します。同じバイアルにすべてのセルを転送し、-80℃でバイアルを格納します。 </ol></li></ol>変更されたVVの7.精製（2回戦） <ol><li>シード3×10 5 CV-1の各6 6ウェルプレートのウェルと文化への細胞の24時間のための細胞。 </li><li>細胞溶解物を得るために、30秒間激しくクリオバイアルをボルテックスその後、3分間37℃の水浴中で（ステップ6.3.3）から凍結クリオバイアルを解凍します。 <ol><li> 6ウェルプレートの1ウェルに混合細胞溶解液の0.5μLを追加します。各プラークのための1つの6ウェルプレートに感染します。 2日間5％CO 2（第二ラウンドのプラーク精製）を用いて37℃でVV感染6ウェルプレートをインキュベートします。その後、セクション6.3を繰り返します。 注：以上の6 RFP陽性プラークをピックアップすることができます。二つ以上の6ウェルプレートは、各プラークの精製のために使用することができます。 </li></ol></li></ol>プラークプリ8.さらなるラウンドfication <ol><li> 1陽性のプラークから形成された全てのプラークが顕微鏡下でRFP陽性であるように思われるまで、ステップ7で説明したのと同じプロトコルに従って精製の更なる3〜5回に運びます。 注：その後、このプラークが純粋であると考えられます。 </li><li>プラークが純粋になると6.3節で説明したように（ 図4、RFPを発現しているすべての感染細胞）を、-80℃で凍結バイアルとストアに正のプラークを収穫します。ステップ9および10に記載されているプロトコル以下のプラークを確認してください。 </li></ol> 9.展開し精製したプラーク（複数可） <ol><li>シード3×10 5 CV-1一日ウイルス感染前に6ウェルプレートの各ウェルへの細胞。 </li><li>細胞溶解物を得るために、3分間37℃の水浴中で8.2から凍結クライオバイアルを解凍します。 CV-1細胞の6ウェルプレートの1ウェルに（細胞破片を除去せずに）すべての溶解液を加える（ステップ9.1に播種）。 5と37℃で感染したCV-1細胞をインキュベート最大3日間％CO 2。 <ol><li>すべての精製されたプラーク（少なくとも3プラーク）を展開します。 注：感染時間は溶解液中のウイルスの量に応じて1〜3日ごとに異なります。 </li></ol></li><li> 50％以上の細胞が顕微鏡下で観察し、細胞変性効果を示す場合、細胞スクレーパーを用いて、VV感染細胞を収穫（細胞が容易に剥離しRFP陽性の、丸められています）。 15 mLのチューブに細胞培養培地と一緒に剥離した細胞を収集します。 <ol><li> 3分間300gで遠心分離により細胞をペレット。上清を除去し、さらに使用するまで-80℃で細胞ペレットを維持するか、ステップ10のためにすぐに細胞ペレットを使用します。 </li></ol></li></ol> PCRを用いた変異VVの変形例10.検証<ol><li>製造者のプロトコルに従ってDNA抽出キットを用いて、ステップ9.3.1で調製した細胞ペレットからVV DNAを抽出します。二重蒸留水200μLでDNAを溶出します。 注：DNAを抽出し、クローンが正しい修正/挿入を含むものとして検証された場合、ウイルスの生産のための残りを維持するために、ペレットの体積の半分を使用してください。 </li><li> N1L遺伝子の欠失およびN1L領域にRFP遺伝子の挿入の検証。 <ol><li> N1L遺伝子（L025）とN1L遺伝子に対して設計したプライマーを使用してL026遺伝子にわたるDNA断片を増幅します。 RFP特異的プライマーを使用してRFP遺伝子を増幅します。 A52R特異的プライマーを用いてPCRによりA52Rにわたる制御するDNA断片を増幅します。 注：特異的プライマーのためのマテリアルのリストを参照してください。 <ol><li> PCRマスターミックスキットを用いてPCRを行います。アニールその後、15秒間94℃でDNAを変性：、DNA鋳型の2μLを用いたPCR反応の25μLを設定し、2分間94℃でPCR反応を変性させ、その後、以下の手順に従って30サイクルのPCRを実行します15秒間52℃でのDNAテンプレートのプライマーは、30秒間、72℃でPCR反応を延長します。 </li></ol></li></ol></li><li> 1％アガロースゲル33を使用して、PCR産物を解決します。 UVゲルドキュメントを用いたゲル画像をキャプチャします。 N1L PCRが陰性であり、A52R及びRFPのPCRが陽性である場合には、プラークは、正確にN1L領域に変更されます。 </li></ol>

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</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

治療目的のためにVVの変更に関する二つの主な目標があります。一つは、抗腫瘍治療用ウイルスを弱毒化するチミジンキナーゼ（TK）遺伝子のような特定の遺伝子を削除することです。他には、（例えば、GM-CSFなど）、所望の治療遺伝子または（例えばルシフェラーゼ遺伝子など）マーカー遺伝子とVVを武装することです。これらのいずれかを達成することが目標領域/遺伝子の欠失を伴います。直接DNAライゲーション法35とインビトロパッケージング方法36は、TK遺伝子改変を有する突然変異体ワクシニアウイルスを生成するために以前に使用されてきました。しかしながら、これらの方法は、原因、ゲノム全体で固有の制限酵素部位がないために、ゲノムの他の領域の突然変異に関するアプリケーションが限られています。変異体VVを作成する現在のアプローチは、相同組換えincorporatiを誘導するために、2つの時間VV感染後のCV-1細胞への選択マーカー（RFP又はGFP）とシャトル（ドナー）ベクターのトランスフェクションを含みます標的領域に選択マーカーをngの。マーカー陽性プラークの選択は、それらの精製トランスフェクションの24時間後が続いています。プラーク精製プロセスは、最後の3〜4週間、10ラウンドを取ると、多くの場合、オフターゲット領域に挿入された選択マーカーとの望ましくない組換えウイルスにつながることができます。 DNA二重鎖切断を効果的に哺乳動物細胞37に相同組換えを誘導することができ、この機構を利用することにより、変異体VVの生成効率が大幅に向上させることができます。 gRNA誘導Cas9システムが正常ゲノム編集に用いられ、25、真核生物22における相同組換えの効率を高めている。最近では、宿主細胞において単純ヘルペスウイルスはgRNA誘導Cas9によって編集されたIアデノウイルスおよび型のゲノムをシステム24。最近、CRISPR Cas9システムを効率的にVVゲノムを編集し、発現させるためのVVベクターを構築するための強力なツールであることが実証されています特定の遺伝子。 N1L gRNAガイド下Cas9と伝統的な相同組換え（HR）メソッドの両方がN1Lの同じ標的部位での成功HRイベントをもたらしました。興味深いことに、しかしgRNAガイド下Cas9は、伝統的なHR法よりも効率の非常に高いレベルでのHRを誘導しました。かくして、gRNA誘導Cas9の使用は、変異のVVを得るために多くのプラークを精製する必要がなくなります。本研究では、大幅gRNAガイド式Cas9システム33を用いて、変異VVを生成するための効率と時間枠を改善しました。注目すべきは、相同組換えの高い効率を得るための1つの重要な工程は、従来の相同組換えを行う前に24時間Cas9およびgRNAを発現するプラスミドでCV-1細胞をトランスフェクトすることです。 24時間の間隔がCas9とgRNAは、合理的なレベルで発現することができます。我々は異なるgRNAはトンをシーケンスことがわかったとしてまた、特定の遺伝子を標的gRNAシーケンスを最適化する必要があるかもしれませんargeting N1L遺伝子は、その効率33、34に変化しました。 編集VVにおけるCRISPR / Cas9のための制限は、組換えの第一ラウンドでRFP陽性プラーク率の低さです。組換えウイルスを含むRFP陽性プラークの十分な数を得るために、通常は、少なくとも10 6ウェルプレートは、第一ラウンド面倒スクリーニングなりれ、必要とされています。したがって、この制限を克服するためのプロトコルを最適化する必要性が依然として存在します。 RFP陽性プラークの小さいサイズは、6ウェルプレートに感染するために使用される溶解物の高容量に起因する別の潜在的な問題です。これを克服するために、溶解物のより小さい体積は、より大きなサイズのRFP陽性プラークを得るために、6ウェルプレートを感染させるために使用されるべきです。溶解物の少量を使用すると、RFP陰性のものからRFP陽性プラークのより良好な分離のために有効になります。そのためプラーク精製の少ないラウンドは、純粋なRFP陽性プラークを得るために必要とされます。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;オフターゲット効果は、常に遺伝子編集で不要な課題です。 CRISPR-Cas9は、オフターゲット効果を示しています。 VVは、33、34のゲノム編集しかし、gRNAの注意深い設計により、オフターゲット効果を回避することができる。これは、VVのゲノムを編集するためのgRNA誘導Cas9システムを使用する特定の利点です。生物医学研究のためおよび翻訳医療における変異のVVの開発をスピードアップしますCRISPR / Cas9システムを使用して、VVの約束を与えられました。また、このようなシステムはまた、そのアクチンに基づく運動性のためのVVによって使用されるシグナル伝達経路の切開、細胞生物学の発見を促進するであろう。

ワクシニアウイルス（VV）は、ポックスウイルス科に属するエンベロープDNAウイルスで、天然痘の撲滅の医学における最大の成果の一つで重要な役割を果たしてきました。天然痘のポスト撲滅の時代では、VVはVVベクターに種々の病原体からの遺伝子を挿入することによって、HIVやその他の感染症1-7に対するワクチンのための遺伝子を送達するためのベクターとして開発されてきました。 VVも広く、特に腫瘍標的複製する腫瘍崩壊ワクシニアウイルスの開発のための癌免疫療法8-14のためのベクターとして使用されています。癌細胞のための改良された選択性を有する効率的なワクチンベクターを作成するために、ウイルスゲノム内の改変は、遺伝子欠失または治療遺伝子の導入を含む、必要とされます。 DNA技術および分子生物学およびウイルス学のより良い理解の発展に伴い、VVへの外来DNAの挿入は、もともと達成しました。D 1980 15での相同組換え（HR）を使用。この方法は、依然としてVVベクターを構築するために広く使用されています。遺伝子改変の導入は、前感染細胞におけるVVゲノムとの再結合HRためのシャトルベクターを使用することによって達成されます。しかし、この方法は、（1％未満の相同組換えの効率16）は非常に非効率的であることが証明されていると、しばしば非標的領域および/またはウイルスの拡大の際にマーカーの損失に選択マーカーのランダム挿入をもたらします。 ゲノム遺伝子座に外来性DNAを挿入するためのDNAの相同組換えの効率が飛躍的に二本鎖切断（DSB）17の存在下で増強することができます。そのため、ターゲット遺伝子座でのDSBを誘導することができる技術がVVのゲノム工学のための大きな可能性を保持しています。 最近開発されたCRISPR-Cas9システムは、任意のVV遺伝子領域でのDSBをトリガするための約束を示しています。 CRISPR-Cas9はRNA-ですファージおよび他の外来遺伝物質18-20を侵略に対する適応免疫に関与して案内されるヌクレアーゼ。微生物種21の範囲で3 CRISPR-CASシステムがあります。タイプII CRISPR-CASシステムは、真核細胞および大きなウイルスのゲノムを編集するために広く使用されています。これは、（ 化膿連鎖球菌から）RNA誘導型Cas9エンドヌクレアーゼ、単一のガイドRNA（sgRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）22-24で構成されています。 Cas9 / sgRNA複合体は、哺乳動物細胞22内の 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer隣接モチーフ（PAM）シーケンス、23の前に相補的な20ヌクレオチドゲノム配列を認識しています。それが正常に遺伝的に改変された細胞、ウイルスの効果的な生成のために使用されてきましたおよび動物モデル22-32。 CRISPR-Cas9システムは、CV-1細胞を感染させたVVの細胞質での相同組換えと組み合わせて標的ゲノムのための効率的なツールであることが証明されていますSは変異ワクシニアウイルス33、34を生成する。この方法の潜在的なアプリケーションを拡張するために、我々は、このシステムの方法論に関する詳細な情報を提示します。説明されたプロトコルは、特定の遺伝子欠失を有する変異体VV作成および/または治療的導入遺伝子を有する変異ウイルスのアームに使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA クローニングベクター</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 クローニングベクター</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>プラスミド抽出</td></tr><tr><td>Dulbecco'のイーグル」s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal wevine serum (FBS)&nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>細胞培養血清</td></tr><tr><td>ペニシリン、ストレプトマイシン</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene 低温バイアル; 2.0&nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>コレクトウイルス</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス BX51 蛍光&nbsp;</td><td>オリンパスは</td><td>RFP陽性plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &ティッシュキット</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm 培養皿</td><td>Z688819-6EA</td><td>シグマ</td><td>細胞培養&nbsp;</td></tr><tr><td>シグマ</td>細胞培養<td>Z707759</td> <td>6ウェルプレート</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞スクレー</td><td>パーC5981</td><td>シグマ</td><td>スクラップ細胞</td></tr><tr><td>1xトリプシンEDTA溶液</td><td>T4299</td><td>シグマ</td><td>トリプシン細胞</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td>消毒<td>剤</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>CLS430791-500EA</td><td>シグマ</td><td>ホールドセルサスペンション</td></tr><tr><td>N1Lフォワード5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'</td><td></td><td>シグマ</td><td>PCRプライ</td></tr><tr><td>マーN1L逆&nbsp; 5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'</td><td></td><td>シグ</td><td>マPCRプライ</td></tr><tr><td>マーA52Rフォワード5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'</td><td></td><td>シグマ</td><td>PCRプライ</td></tr><tr><td>マーA52Rリバース5'-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3'</td><td></td><td>シグマ</td><td>PCRプライ</td></tr><tr><td>マーRFPフォワード5'-GCTACCGGACTCAGATCCA-3'&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td>シグマ</td><td>PCRプライ</td></tr><tr><td>マーRFPリバース5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'</td><td></td><td>シグマ</td><td>PCRプライマー</td></tr><tr><td>アルガロース</td><td>A7431</td><td>シグマ</td><td>リゾリュートPCR産物</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UVゲルドクター</td></tr></tbody></table>

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9は、単一のガイドRNA(gRNA)によって指示される特定のゲノム遺伝子座を編集することができます。CRISPR/Cas9システムは、さまざまな生物のゲノム編集に採用されています。ここでは、RNAガイド下Cas9を使用してVV感染CV-1細胞の細胞質内のワクシニアウイルス(VV)ゲノムを編集するためのプロトコルについて説明します。RNAガイド下Cas9は、VVの標的部位において二本鎖DNA切断を誘導し、効率的かつ特異的に相同組換えを促進し、相同組換えによって導入遺伝子をこれらの部位に組み込むことができます。導入遺伝子を含む部位特異的相同ベクターを使用することにより、この領域に組み込まれた赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子を持つN1L遺伝子欠失VVが、従来の相同組換え法から得られるものよりも10倍高い組換え効率で生成されました。このプロトコルは、RNAガイド下Cas9システムを使用して、効率を高めた変異型VVを生成することを実証しています。

新しいVVベクターの構築のために、重要な出発点は、ゲノムの特定の領域を標的とすることができるドナーシャトルベクターを設計し、構築することです。この研究では、VV N1L遺伝子は、例えば、ターゲットとして使用しました。 VVにおける組換えおよび標的領域のためのドナーシャトルベクターのカセットは、 図1に示されている。相同組換えの効率を高めるために、Cas9およびN1L固有gRNAを発現するプラスミドをCVに同時トランスフェクトしました。相同組換え33を実行する48時間前に-1細胞。 1日（24時間）後、トランスフェクションは、RFPは、CV-1細胞（ 図2）で発現させました。相同組換え（ステップ5）からの全溶解物でCV-1細胞の感染後に、RFP陽性および陰性のプラークを、両方のCV-1細胞（ 図3）で観察されました。精製プロトコールに記載した後、純粋なプラークCO<html>精製の3-5ラウンド後に得られるULD。 図4に示すように、突然変異体ワクシニアウイルスの純粋なプラーク由来の細胞溶解物に感染させた後、すべてのプラークがRFP信号を提示しました。純粋な変異体VVが正しい遺伝子修飾を有していたかどうかを確認するために、PCRは、 図5に示すように、標的N1L遺伝子が存在しないことを確認した。修飾ウイルスのPCRは、RFPとN1L不在信号（のための正のシグナルを示しました図5レーンAG）、無傷のN1L領域と制御ウイルス（CTR）のためN1LのPCRの結果が正である間。 A52Rの制御DNA断片は、すべての組換えウイルスおよびセンターウイルス陽性でした。 RFP陽性プラークにおけるHR効率は、（それが前作34にまで94％であった）この実験では100％（6/6）です。本明細書に記載される方法は、従来のプロトコル33、34と比較して、100以上の倍再結合効率を向上させることができます。 コンテンツ &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> 図1：VVゲノムにおける相同組換えのためのドナーシャトルベクターのカセット、および標的領域の精製マーカー遺伝子RFPは、H5プロモーターによって駆動されます。 RFP遺伝子でN1L領域結果を標的修復ドナーベクターは、相同組換え後N1L領域に組み込まれます。 &#39;X&#39;は、ワクシニアウイルスゲノムに同一の配列を置換する修理ドナーベクター中の相同配列を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> 図2：相同組換え後のCV-1細胞1日のイメージングある日AFTER相同組換え、細胞VVに感染させ、修理ドナーベクターによってトランスフェクトは、RFP陽性であるA：位相コントラスト画像（元倍率100X）B：蛍光顕微鏡画像（元の倍率100倍）。スケールバー=50μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> 図3：変異ウイルスの最初のラウンド精製におけるRFP陽性プラーク変異ウイルスの第一ラウンドの精製では、標的領域の欠失を有する（赤線で丸で囲んだ）RFP陽性プラークをすることによって形成されたプラークに囲まれています。 （黄色の線で丸で囲んだ）は、野生型ウイルスA：位相コントラスト画像（原倍率100X）B：蛍光MICRoscopy画像（元の倍率100倍）。スケールバー=50μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> 図4：VVは 、精製の3-5ラウンドの後、純粋なプラークがすべてのプラークとして得られた純粋な変異体は、RFP陽性であったA：位相コントラスト画像（元倍率100X）B：蛍光顕微鏡像（元倍率100X） 。スケールバー=50μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> 図5：VerificatioVVから抽出した純粋な変異VV。DNAのnが、CV-1細胞を感染させました。 N1Lは、N1Lプライマーを用いてPCRにより確認した対象領域の欠失は、N1L領域へのRFPの挿入はRFPのプライマーを用いたPCRによって確認しました。レーンAFは6精製されたプラークに対応し、レーンGは前作33で検証N1L欠失を有する制御プラークで、レーンセンター（制御）（N1L地域そのままで）、野生型ワクシニアウイルスです。 A52R遺伝子は、全ての試料について対照遺伝子として増幅した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ワクシニアウイルス（VV）は、広く生物医学研究およびヒトの健康の改善に使用されています。この記事では、CRISPR-Cas9システムを使用して、VVゲノムを編集するための簡単な、非常に効率的な方法を説明します。

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

この実験の全体的な目的は、CRISPR-Cas9技術を用いて、変異型ワクシニアウイルスの作製効率を向上させることです。この手法は、生物学的研究および医学的研究、特に遺伝子治療やワクチン接種のための新しいワクシニアウイルスベクターの作製に役立ちます。陽性プラークの同定と回収は困難であるため、この手法によるウイルスの実証は極めて重要です。この手法の主な利点は、ワクシニアウイルスの変異体作製の効率を劇的に向上させられる点にあります。回収したCV-1細胞を用い、その濃度を100,000 cells/mLに調整します。次に、トランスフェクションのために、この懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ播種します。翌日、0.5 nanogramsのgRNA-N2プラスミドおよび0.5 nanogramsのpSTCas9プラスミドを細胞にトランスフェクションします。その後、24時間インキュベートします。24時間後、培地を交換します。次に、VVL15ウイルスを調製します。バックボーンとなるVVL15ウイルスをDMEMで希釈し、1ミリリットルあたり200,000 PFUにします。その後、希釈したウイルスを100 µLずつ、トランスフェクションしたCV-1細胞の各ウェルに添加します。2時間後、HR発現用のシャトルドナーベクター1 µgを細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートします。翌日、セルスクレイパーを用いてトランスフェクションしたCV-1細胞を剥離させます。その後、細胞懸濁液をクライオバイアルに回収し、将来の使用に備えて-80 °Cで保存します。修飾VVの精製第1ラウンドを開始するために、15枚の6ウェルプレートに、1ウェルあたり300,000個の未修飾CV-1細胞を播種します。翌日、トランスフェクションしたCV-1細胞の凍結懸濁液を37 °Cで3分間解凍し、その後、懸濁液を30秒間激しくボルテックスして細胞を溶解します。次に、溶解液1 µLを3 mLのDMEMで希釈します。この希釈液を、未修飾のCV-1細胞が入った各プレートウェルに0.5 mLずつ加えます。その後、プレートをインキュベーターに戻し、2日間培養します。2日後、蛍光顕微鏡を用いてRFP陽性のプラークを同定します。10倍の対物レンズで確認できます。プラークが特定されたら、マーカーペンを用いてプレート下の該当箇所に正確にラベルを付けます。次に、回収する陽性プラーク1つにつき、200 µLの無血清DMEMを入れたクライオバイアルを用意します。次に、標識されたプラークがあるウェルからすべての培地を吸引することが重要です。その後、30 µLを吸引するように設定した200 µLピペットを使用し、まずクライオバイアルから10 µLの培地をピペットに部分的に分注します。続いてプラークを掻き取り、残りの吸引量で細胞を吸い上げます。これをクライオバイアルに排出し、同じRFP陽性プラークに対してこの操作をさらに2回繰り返し、可能な限り多くの細胞を回収します。回収物は-80°Cで保存するか、2回目の精製を直ちに行う場合は、クライオバイアルをドライアイスで10分間凍結させます。修飾VVの2回目の精製は、1回目の凍結細胞を用いて、1回目と同様の手順で行います。ただし、各RFP陽性株について、6つ以上のRFP陽性プラークを選択することが可能です。1つの陽性プラークから形成されたすべてのプラークがRFP陽性となり、プラークが純粋であることを示すまで、選択プロセスを繰り返します。これにはさらに3〜5ラウンドかかる場合があります。1日前に、1ウェルあたり50万個のCV-1細胞を含む6ウェルプレートを用意します。翌日、凍結保存した精製プラークを37 °Cで3分間解凍します。次に、プラークを30秒間激しくボルテックスして溶解液を作成します。細胞の残渣を含む溶解液のすべてをCV-1細胞のウェルに加え、プレートを3日間インキュベートします。他の5つのウェルは使用しないでください。顕微鏡下で毎日細胞を観察します。細胞の半分以上に細胞変性効果（CPE）が見られたら、感染細胞を回収します。理想的には、すべての細胞が細胞変性を示している状態が望ましいです。セルスクレイパーを用いて、培養液が入った15 mLチューブに細胞を回収します。その後、300gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を廃棄し、PCRを用いて変異型VVの修飾を確認するか、あるいは後で確認するために細胞ペレットを-80 °Cで冷凍保存します。記述された本手法は、従来のプロトコルと比較して組換え効率を100倍以上向上させます。例えば、VV N1LGを標的とした改変を行いました。記載の通り、Cas9およびN1L特異的gRNAを発現するプラスミドをCV-1細胞に共導入し、相同組換えの効率を高めました。トランスフェクションの1日後、CV-1細胞においてRFPが発現しました。次に、相同組み換えによる全ライセートを用いてCV-1細胞に感染させました。その結果、CV-1細胞においてRFP陽性および陰性のプラークの両方が観察されました。精製プロトコルに従い、純粋な組換え体が得られた。変異型ワクシニアウイルス由来の純粋なプラークから得られた細胞溶解液で感染させた後、すべてのプラークにRFPシグナルが認められた。目的遺伝子の欠失を確認するためにPCRを用いた。改変されたウイルスはRFPに対して陽性シグナルを示し、無傷のN1Lコントロールとは異なりN1Lのシグナルは認められませんでした。すべてにおいて、非標的遺伝子であるA52Rは陽性でした。このビデオを視聴することで、新しいワクシニアウイルスベクターを迅速に作製する方法について十分に理解できたはずです。この手法に習熟し、適切に実施すれば、10日間で完了させることができます。本手法の開発により、生物医学分野の研究者が、がんや感染症の治療および予防のための生物学的製剤の開発において、新たなウイルスベクターを探索する道が開かれました。

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

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