突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ
2016年10月30日
ワクシニアウイルス（VV）は、広く生物医学研究およびヒトの健康の改善に使用されています。この記事では、CRISPR-Cas9システムを使用して、VVゲノムを編集するための簡単な、非常に効率的な方法を説明します。
この実験の全体的な目標は、CRISPR-Cas9技術を使用して変異型ワクシニアウイルスの生成効率を向上させることです。この方法は、生物学研究や医学研究、特に遺伝子治療やワクチン接種のための新しいワクシニアウイルスベクターの作成に役立ちます。この方法では、陽性プラークの同定と拾い上げが難しいため、ウイルスのデモンストレーションが重要です。
この技術の主な利点は、私たちの変異体をワクシニアウイルスにする効率を劇的に向上させることです。採取したCV-1細胞から始めて、その濃度を1ミリリットルあたり100, 000細胞に調整します。次に、トランスフェクションのために2ミリリットルの懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに播種します。
翌日、0.5ナノグラムのgRNA-N2プラスミドと0.5ナノグラムのpSTCas9プラスミドを細胞にトランスフェクションします。その後、それらを24時間インキュベートします。24時間後、メディアを交換してください。
次に、VVL15ウイルスを準備します。バックボーンVVL15ウイルスをDMEMで200, 000 PFU/mLに希釈します。次に、希釈したウイルス100マイクロリットルをトランスフェクションしたCV-1細胞の各ウェルに加えます。
2時間後、HRの発現のために1マイクログラムのシャトルドナーベクターで細胞をトランスフェクションし、細胞を24時間インキュベートします。翌日、トランスフェクションしたCV-1細胞をセルスクレーパーで剥離します。次に、細胞懸濁液をクライオバイアルに集め、将来の使用のために摂氏マイナス80度で保存します。
修飾VVの精製の最初のラウンドを開始するには、ウェルあたり300,000個の未修飾CV-1細胞を含む15個の6ウェルプレートを播種します。翌日、トランスフェクションしたCV-1細胞の凍結懸濁液を摂氏37度で3分間解凍し、懸濁液を30秒間激しくボルテックスして細胞を溶解します。次に、1マイクロリットルのライセートを3ミリリットルのDMEMで希釈します。
この希釈液の半ミリリットルを、未改変CV-1細胞の各プレートウェルに加えます。その後、プレートをインキュベーターに2日間戻します。2日後、蛍光顕微鏡を使用してRFP陽性プラークを同定します。
彼らは10倍の目標で見つけることができます。それらが識別されたら、マーカーペンを使用してプレートの下のプラークに正確にラベルを付けます。次に、採取する陽性プラークごとに200マイクロリットルの無血清DMEMを含むクライオバイアルを準備します。
次に、標識されたプラークでウェルからすべての培地を吸引することが重要です。次に、30マイクロリットルを吸引するように設定された200マイクロリットルのピペットを使用して、ピペットにクライオバイアルから10マイクロリットルの培地を部分的にロードし、プラークをこすり落とし、残りの吸引で細胞を引き上げます。これをクライオバイアルに排出し、この手順をさらに2回繰り返し、同じRFP陽性プラークを標的にして、できるだけ多くの細胞を収集します。
コレクションをマイナス80°Cで保存するか、2回目の精製をすぐに行う場合は、クライオバイアルをドライアイスで10分間凍結します。修飾されたVVを精製する2回目のラウンドは、最初のラウンドと同様に、最初のラウンドの凍結細胞を使用して実行されます。ただし、RFP陽性ラインごとに6つ以上のRFP陽性プラークを選択できます。
1つの陽性プラークから形成されたすべてのプラークがRFP陽性になり、プラークが純粋であることを示すまで選択プロセスを繰り返し、さらに3〜5ラウンドかかる場合があります。1日前に、ウェルあたり50万個のCV-1細胞を含む6枚の壁プレートを準備します。翌日、冷凍精製プラークを摂氏37度で3分間解凍します。
次に、プラークを30秒間激しく渦巻きしてライセートを作ります。細胞破片を含むすべてのライセートをCV-1細胞のウェルに加え、プレートを3日間インキュベートします。他の5つの井戸は使用しないでください。
顕微鏡で細胞を毎日検査します。細胞の半分以上が細胞変性を示す場合は、感染した細胞を採取します。理想的には、すべての細胞が細胞変性であるべきです。
セルスクレーパーを使用して、培養液と一緒に15ミリリットルのチューブに細胞を回収します。次に、細胞を300gで3分間ペレット化します。上清を捨ててPCRを進め、変異体VVの修飾を確認するか、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結して後で確認します。
記載されている方法は、従来のプロトコルと比較して、組換え効率を100倍以上向上させます。例えば、VV N1LGは改造の対象となりました。上述のように、Cas9を発現する血漿とN1L特異的gRNAをCV-1細胞に同時トランスフェクトして、相同組換えの効率を高めた。
トランスフェクションの1日後、RFPがCV-1細胞で発現しました。次に、CV-1細胞に相同組換えからの全ライセートを感染させた。RFP陽性および陰性のプラークは、CV-1細胞の両方で観察されました。
精製プロトコルに従って、純粋な組換え体を得た。変異型ワクシニアウイルスの純粋なプラークに由来する細胞溶解物に感染した後のすべてのプラークは、RFPシグナルを示しました。PCRを使用して、標的遺伝子の欠失を確認しました。
改変されたウイルスは、無傷のN1Lコントロールとは異なり、RFPに対して陽性のシグナルを示し、N1Lに対してはシグナルを示しませんでした。全員が非標的遺伝子A52Rに対して陽性でした。このビデオを見れば、新しいワクシニアウイルスベクターを迅速に作製する方法を十分に理解できるはずです。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば10日で完了できます。その開発後、この技術は、生物医科学の分野の研究者が、がんや感染症の治療と予防のための生物学的薬剤の開発において新しいウイルスベクターを探求する道を開きました。
概要
本記事では、CRISPR-Cas9技術を用いてワクチンウイルス（VV）ゲノムを編集する高効率な手法を紹介します。この手法は、変異型VVの作製を大幅に効率化し、生物学的および医学的研究の進展を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- ウイルス学
- 遺伝子工学
- 生物医学研究
背景
- ワクシニアウイルスは、生物医学研究において価値の高いツールです。
- CRISPR-Cas9技術により、精密なゲノム編集が可能になります。
- ウイルス変異体の効率的な作製は、研究への応用に不可欠です。
- 従来の変異体作製法は、効率が低い場合があります。
研究目的
- 変異ワクシニアウイルスの作製効率を向上させること。
- 遺伝子治療およびワクチンのための新しいウイルスベクターを開発すること。
- ウイルスアッセイにおける陽性プラークの同定を効率化すること。
使用した手法
- gRNAおよびCas9プラスミドを用いたCV-1細胞へのトランスフェクション。
- トランスフェクション済み細胞へのVVL15ウイルスの感染。
- 蛍光顕微鏡を用いたRFP陽性プラークの同定。
- 複数回の選抜による改変VVの精製。
主な結果
- この手法により、組換え効率が100倍以上に向上します。
- RFP陽性プラークの生成が確認できれば、修飾が効果的に行われたことを示します。
- PCRにより、修飾ウイルスにおいて標的遺伝子が欠失していることが確認されました。
- この技術は約10日間で完了させることができます。
結論
- このCRISPR-Cas9法は、VV研究における重要な進歩です。
- これにより、治療への応用のための新しいウイルスベクターを迅速に開発することが可能になります。
- このアプローチは、がんや感染症治療のさらなる研究を促進することができます。
よくある質問
産業界における重要性
このCRISPR-Cas9アプローチは、変異ワクシニアウイルス株の作製効率を大幅に向上させることで、ウイルスベクター開発における主要なボトルネックを解消します。組換え効率が高まることにより、前臨床でのターゲット検証およびベクター最適化のワークフローにおける反復サイクルを高速化できます。本手法は、遺伝子治療やワクチン研究のための組換えウイルスの迅速な作製を可能にし、初期探索段階のタイムラインを短縮します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：N1L欠損などの標的ノックアウトを通じてウイルス遺伝子機能を精密に解析することが可能となり、病原性メカニズムの解明に寄与する。
- 運用上の価値：従来の相同組み換え法と比較して組み換えウイルスの作製効率を100倍以上に向上させ、株のエンジニアリングにかかる時間を短縮する。
- 予測的価値：クリーンな遺伝子改変を容易にすることで、後続のアッセイにおいて表現型の帰属を明確にし、メカニズム解析におけるリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 抗ウイルス化合物や免疫応答の高スループットスクリーニングを可能にする、定量的な蛍光プラークアッセイ用のRFPタグ付きリポーターウイルスを生成します。
- 運用の価値： 複数回の精製工程を経て、安定した高純度のウイルスストックを調製し、アッセイの再現性を確保して測定値のばらつきを低減します。
- 拡張性： 本プロトコルは標準的な細胞培養およびトランスフェクション設備を使用するため、特殊な機器を必要とせず、さまざまな研究室規模への適応が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性：がんおよび感染症モデルでの前臨床評価に向けた、治療用抗原または免疫調節因子を発現するワクシニアウイルスベクター構築のためのプラットフォームを提供します。
- 前臨床モデルへの適合性：同系ウイルス株（例：野生型 vs. N1L欠損株）を迅速に作製でき、病原性メカニズムの解析や安全性プロファイルの策定を支援します。
- リスク調整後の進展：PCRで確認された遺伝子欠損およびRFP発現により、in vivo試験に先立ち、遺伝的忠実性に基づいた確実なgo/no-go判断が可能になります。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、迅速なウイルスベクターエンジニアリングが標的仮説の検証およびメカニズムの妥当性確認を支援する、初期探索からリード同定に至る一連の流れに組み込まれています。
- 発見生物学：免疫回避または複製経路における遺伝子機能を調査するための、仮説駆動型のウイルスゲノム編集を促進します。
- スクリーニング：抗ウイルス薬やワクチンの有効性スクリーニングにおける蛍光ベースのスクリーニングアッセイに適した、標準化されたRFP発現ウイルスストックを生成します。
- 分析：PCRおよび蛍光ベースの読み取りを可能にし、ベクター構築過程における修飾効率とクローン純度を定量的に評価します。
- トランスレーショナルリサーチ：導入遺伝子の組み込みと遺伝子欠損が確認された遺伝学的に定義されたウイルスを提供することで、ベクター構築から前臨床試験への継続性をサポートします。
- 企業内での再利用：ウイルスベクタープログラムにおいて、複数の標的や導入遺伝子ペイロードに適用可能な、ワクシニアウイルスエンジニアリングの再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 組換え効率の測定可能な向上を伴う高忠実度ゲノム編集により、変異体スクリーニングにおける偽陰性を減少させる。
- 運用上の価値： 入手容易な試薬（プラスミド、CV-1細胞、蛍光顕微鏡）を用いた合理化されたワークフローにより、導入への技術的障壁を最小限に抑える。
- 戦略的価値： ウイルスベクターの設計・構築・試験（design-build-test）サイクルを加速させ、初期段階のバイオ医薬品プログラムにおける資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： ウイルスベクターの迅速なプロトタイピングを可能にし、複数の候補の並行的な探索と、遺伝学的検証に基づいた情報に基づいた優先順位付けを支援する。
実施上の留意点
- BSL-2条件下でのプラスミドトランスフェクションおよびウイルス操作に関する分子生物学的な専門知識が必要です。
- プラークスクリーニングのための蛍光顕微鏡および遺伝子型確認のための標準的なPCR装置が必要です。
- 編集の特異性を維持するため、各標的遺伝子座に応じてgRNAおよびドナーベクターの設計を最適化する必要があります。
- CV-1などの付着性哺乳類細胞株に適用可能です。他のシステムへの適応には経験的な検証が必要な場合があります。
- クローナルな純度を得るために複数回のプラーク精製が必要であり、全体のスケジュールは10日間ですが、実作業時間に影響します。
