脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

この新しい細胞培養法の全体的な目標は、脱分化脂肪細胞をより効率的に生成することです。私たちの方法は、再生医療の分野で働く研究者が、脂肪形成細胞、骨形成細胞、および軟骨形成細胞の生成に関与するいくつかのプロセスに関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。私たちの細胞培養プロトコルの主な利点は、DEFAT細胞の品質を向上させることであるため、近い将来、細胞治療や組織工学における現在のアプリケーションを改善するために適用される可能性があります。

手術室から患者の皮下脂肪サンプルをラボに持ち込んだ後、組織の重量を量り、1〜2グラムの脂肪組織のサンプルを15ミリリットルのチューブに入れます。次に、サンプルを5ミリリットルのPBSで洗浄し、サンプルを10センチメートルのプラスチック皿に移します。PBSを取り外します。

次に、サンプルを含む皿に10ミリリットルの無菌0.1%重量/体積コラゲナーゼを加えます。次に、外科用ハサミを使用して、組織がピューレ状の粘稠度に達するまで組織をミンチにします。ミンチ組織とコラゲナーゼ溶液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、摂氏37度で30分間、60RPMで振とうしながら消化します。

分解後、分解したサンプルを100ミクロンのフィルターで新しい15ミリリットルのチューブにろ過します。次に、2%FBSを添加した10ミリリットルのDEFAT培地をフィルターに通します。細胞懸濁液から脂肪細胞を単離するには、まずろ過した細胞を室温で100倍gで1分間遠心分離します。

遠心分離中に、15ミリリットルのチューブに2%FBSを添加した5ミリリットルのDCMを調製します。次に、1000マイクロリットルのピペットを使用して、遠心分離されたチューブから浮遊脂肪細胞を引き出し、培地が入った15ミリリットルのチューブに細胞を追加します。チューブを静かに振って、DCM培地を細胞と混合します。

その後、チューブを100倍gで室温で1分間遠心分離します。遠心分離後、18ゲージの針と20ミリリットルの注射器を使用して、チューブの底にある培地を取り出します。次に、2%FBSを添加したDCM10ミリリットルを細胞に加え、チューブを穏やかに振って混合します。

細胞を再び100倍gで室温で1分間遠心分離します。めっきを開始するには、12.5cmのフラスコに41ミリリットルのDCMまたは20%FBSを添加したDMEMを追加します。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して40マイクロリットルの脂肪細胞を引き出し、フラスコに加えます。

次に、フラスコにDCMまたはDMEMを20%FBSで補充します。細胞が培地全体に広がることが重要です。フラスコを丸いシャーレの蓋に置き、平らに保ちます。

最後に、フラスコを二酸化炭素5%、摂氏37度に設定されたインキュベーターに入れ、7日間放置します。1週間のインキュベーション後、フラスコを反転させ、脱分化した脂肪細胞を確認します。次に、メディアを吸引し、フラスコに20%FBSを添加した5ミリリットルのDCMまたはDMEMを追加します。

培地を交換した後、DEFAT細胞をさらに1週間増殖させます。1週間後、セルカウンターを使用して、さまざまな細胞培養条件下で生成されたDEFAT細胞の数をカウントします。この画像は、DMEMで14日間培養した後のDEFAT細胞コロニーを示しています。

ここでは、DEFAT細胞をDCMで14日間培養した後に示します。いずれの場合も、スケールバーは200ミクロンを表します。DEFAT細胞の増殖をセルカウンターを用いて定量し、DCMとDMEMのDEFAT細胞生成効率を比較しました。

ここに見られるように、DCMの使用により細胞増殖の促進が観察されます。ここでは、DCMを使用して作製したヒトDEFAT細胞を適切な誘導培地で3週間培養し、DEFAT細胞の再分化および分化能力を評価しました。細胞は、アルカリホスファターゼ染色およびアリザリンレッドS.Finallyで染色することにより、骨形成能力に対して陽性であった。

高品質のDEFAT細胞を成功裏に作製するためには、原始的なコラゲナーゼと脂肪細胞の単離の両方を細心の注意を払って行うことが非常に重要です。これらの取り組みを通じて、私たちの検証済み細胞培養法は、発生生物学および再生医療の分野における現在および将来の研究活動を促進することを目指しています。