Name: 脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学ぶ、脱分化脂肪細胞（DFAT）を効率的に作製する細胞培養法。皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理し、DCM培地で培養することで、再生医療や組織工学の研究に有用な高品質な細胞を得る方法です。

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この研究は、日本学術振興会の先端研究と技術からのスタートアップ創出プログラム（STARTプログラム（ST261006IP）および文部科学省の私立大学戦略研究財団プログラム（2014-2019））S1411018）によって部分的に支援されました。

人間の皮下脂肪のサンプルは、形成外科、泌尿器科、小児外科と日本大学板橋病院（東京、日本）の整形外科の部門で手術を受ける患者から得ました。患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた、と医学の倫理委員会日本大学の学校は研究を承認しました。 1.組織標本<ol><li>研究室に手術室からの組織サンプルを持参してください。 </li><li>一旦室温（RT）で、50mlチューブ中で、次いで、10cmのプラスチック皿に試料を置く（ - ）洗浄1-2 PBS 5 mlの脂肪組織のG。 </li></ol> 2.コラゲナーゼ消化<ol><li>組織サンプルを含む皿に（w / v）のコラゲナーゼ溶液（コラゲナーゼII型）の無菌の0.1％の10ミリリットルを追加し、 - （）PBSからサンプルを削除します。 </li><li>それは構成さピューレに到達するまで、約15分間、外科用ハサミで組織をミンチency。 </li><li>続いて、シェーカー上で穏やかに撹拌しながら50mlのチューブ中で30分間（60 rpm）で37℃で0.1％（w / v）のコラゲナーゼ溶液中で細分化した組織を消化します。 </li><li> 50ミリリットルチューブに100μmのフィルターを通して消化されたサンプルをフィルタリングします。次に、フィルターを介して、2％FBSを補充した（ 材料の表を参照）、DCMの10ミリリットルを渡します。 </li></ol> 3.細胞の単離<ol><li>室温で1分間、100×gでろ過し、細胞を遠心。 </li><li>この時点で、DCMの調製5mlを50mlチューブ中の2％FBSを補充しました。 </li><li>次に、千μlのピペットを用いて、浮遊脂肪細胞を策定し、培地を含む50 mlチューブに細胞を追加します。 </li><li>その後、細胞をDCM媒体を混合するために穏やかに50ミリリットルチューブを振ります。 </li><li>その後、室温で1分間、100×gでチューブを遠心します。 </li><li> 18 G針と20ミリリットルの注射器を使用して、チューブの底に培地を捨てます。 </li><li>次に、DCM秒の10ミリリットルを追加します。採取した細胞を、2％FBSをupplemented。 </li><li>穏やかに50ミリリットルチューブを振とうすることにより細胞を用いて、DCMを混ぜます。 </li><li>室温で1分間、100×gでチューブを遠心。 </li></ol> 4.めっきセル<ol><li> 12.5センチメートルフラスコに20％FBSを補充DCMまたはDMEMの41ミリリットルを追加します。 </li><li>次に、200μlのピペットを用いて、フラスコに脂肪細胞の40μlを添加します。 </li><li>その後、DCMまたはDMEMでフラスコを埋めるには、20％FBSを補充しました。重要なステップ：この時点で、細胞を培地全体に広がっていることを確認してください。視覚的に剥離した細胞を確認し、その後フラットそれを維持するラウンドペトリ皿の蓋の上にフラスコを保ちます。 </li><li>最後に、インキュベータの内側にフラスコを置き、7日間37℃、5％CO 2インキュベーター内で邪魔されずにそのままにしておきます。 </li><li>インキュベーションの週に続いて、フラスコを反転し、DFAT細胞を確認してください。この点fibroblで以来、10を説明するよう次に、DFAT細胞の生成能力を評価しますAST様細胞（DFAT細胞）は、脂肪細胞とは異なる領域に配置されています。 </li><li> DCMまたはDMEMを5mlを加える前に細胞培養培地を除去した後、フラスコに、20％FBSを補充しました。 DFAT細胞は、培地を交換した後、別の週のために成長することを可能にします。 </li><li>細胞カウンターを用いて、種々の細胞培養条件（DMEM対DCM）で生成DFAT細胞の数を数えます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

インビトロ脱分化に天井文化として知られているプロセスを経る成熟脂肪細胞は、より原始的な表現型に復帰し、増殖能力を得てもよいです。これらの細胞は、以下のように脱分化脂肪（DFAT）細胞と呼ばれます。 DFAT細胞の多分化能を評価しました。分析および遺伝子発現のフローサイトメトリー分析DFAT細胞のASC 6と比較して非常に均質であったことを明らかにしました。実際には、DFAT細胞の細胞表面抗原プロファイルは、ASCを6に見られるものと非常に類似しています。従って、DFAT細胞は、MSCと同様に機能することができます。 正常の20％ウシ血清7-8を添加したDMEM F12細胞培養培地を利用DFAT細胞を生成した他の基。我々は、10％FBSを補充した細胞培養培地を用いてDFAT細胞を産生することを試みているが、このプロトコルを用いて製造DFAT細胞の数は、Wよりも有意に低かったです鶏は、20％FBS（データは示していない）を補充しました。従って、FBS濃度および/またはその内容はDFA...

細胞治療および組織工学、再生医療1-5の分野におけるホットなトピックです。これらの治療法は偉大な約束を保持している間、いくつかの技術的な問題は、現在、その臨床使用を妨げます。この点において、iPS細胞の生成のように、すべての組織工学的療法は、患者の安全性を維持するために、外部遺伝子形質導入を含まない細胞を産生しなければなりません。したがって、我々が正常に人間DFAT細胞6を生成するために、最初のグループでした。いくつかの他の研究グループがいるので、さらに我々のモデルの有用性を強調し、哺乳動物起源7-9のDFAT細胞を生成するために私たちの方法を採用しています。 いくつかの研究の過程で、我々は、細胞培養環境の質は、細胞培地の含有量を調整することによって修正することができることを見出しました。この知見は、DFAT細胞の産生および改善された細胞質の成功率の増加につながっています。両方の重要な要素で効率的に将来の臨床試験のための細胞を生成します。この点に関して、改善されたDFAT培地中で（DCM、組換えヒトインスリンを含有する細胞培地、血清アルブミン、L-グルタミン酸、いくつかの脂肪酸、およびコレステロール幹間葉する媒体と同様）とDFAT細胞の生成のための方法および増殖は、（DCMの内容の詳細は、リクエストに応じて入手可能です）を開発しました。使用して、この方法の高品質DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化する能力を生成しました。要するに、この検証済みの細胞培養プロトコルはDFAT細胞の質を高め、細胞治療および組織工学の臨床応用性を高めるために非常に有用であり得ます。

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSCミディアム&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>この培地は</td></tr>、<tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Mg2+ と Ca2+/</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Σ</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>高砂医科工業(株</td>) <td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 100 &mu;m イエロー</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 12.5 cm&sup2;長方形傾斜ネック細胞培養フラスコ、ブルーベントスクリューキャップ</td>付き <td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>18G針</td><td>ニプロ</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>20mlシリンジ&nbsp;</td><td>ニプロ</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Zシリーズ コールターカウンター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

組織工学や細胞治療は、臨床的に偉大な約束を保持します。この点に関して、このような間葉系幹細胞（MSC）のような多能性細胞は、損傷した器官に機能を回復するために、近い将来に、治療的に使用することができます。それにもかかわらず、MSCおよびそれらの増幅を囲む非効率を単離する高度に侵襲的な手順を含むいくつかの技術的な問題は、現在、これらの治療法の潜在的な臨床使用を妨げます。ここで、我々は、脱分化脂肪細胞（DFAT）、MSC様細胞の生成のための非常に効率的な方法をご紹介します。興味深いことに、DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化することができます。他のグループが以前に成熟した脂肪組織からDFAT細胞を生成するための様々な方法を提示しているが、我々の方法は、私たちはより効率的にDFAT細胞を産生することができます。この点において、我々は、20％FBSを補充したものDFAT培地（DCM）を実証します20％FBSを補充したDMEMよりDFAT細胞を、生成においてより効果的です。さらに、我々の細胞培養法で製造DFAT細胞は、いくつかの組織型に再分化することができます。このように、組織の脱分化の研究のために非常に興味深く、有用なモデルが提示されています。

<html>本研究では、DFAT細胞の生成のための方法およびツールキットは、（ 図1）に向上しました。我々の方法は、私たちは、DCMおよび20％FBS（ 図2A）を含むDMEM培地の両方を使用してDFAT細胞を生成することができます。このように、我々はDFAT細胞を生成するDCMとDMEMの効率を比較しました。この点で、DCMにかかわらず、脂肪細胞の数（ 図2AおよびB）を、DMEMに比べ3倍DFAT細胞増殖を増強しました。 10％FBS（データは示さず）を使用したプロトコルと比較した場合20％を用いてFBSは、細胞増殖を増強します。我々は、さらにDCMを用いて製造DFAT細胞が脂肪細胞への再分化および骨芽細胞（ 図3）へと分化する能力を有することが確認されました。アッセイのための方法は、我々の以前の研究6に記載されています。 <p class="jove_content" ...

私たちはDFAT細胞の生成条件を変更し、これらの細胞の生産のための改良された増殖培地の使用に関する情報をここに提供します。

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

この新しい細胞培養法の全体的な目的は、脱分化脂肪細胞をより効率的に生成することです。本手法は、再生医療分野の研究者が、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞の産生に関与するいくつかのプロセスに関する重要な疑問を解決するのに役立つと考えられます。本細胞培養プロトコルの最大の利点は、DEFAT細胞の品質を向上させることにあるため、近い将来、細胞治療や組織工学における現在の応用技術を改善するために適用できる可能性があります。手術室から患者の皮下脂肪サンプルを研究室に運び、組織を計量して、1〜2gの脂肪組織サンプルを15mLチューブに入れます。次に、サンプルを5mLのPBSで洗浄し、サンプルを10cmプラスチックディッシュに移します。PBSを除去します。次に、サンプルが入ったディッシュに滅菌済みの0.1% w/v collagenaseを10 milliliters加えます。続いて、外科用はさみを用いて、組織がピューレ状になるまで細切にします。細切した組織とcollagenase溶液を15 milliliter遠心チューブに移し、60 RPMで振盪しながら37 °Cで30分間消化させます。消化後、消化したサンプルを100 micronのフィルターでろ過し、新しい15 milliliterチューブに回収します。次に、2% FBSを添加したDEFAT培地を10 milliliter、フィルターに通します。細胞懸濁液から脂肪細胞を単離するため、まずろ過した細胞を室温で100 ×gにて1分間遠心分離します。遠心分離の間に、2% FBSを添加したDCM 5 mLを15 mLチューブに調製します。次に、1000 µLピペットを使用して、遠心分離後のチューブから浮遊している脂肪細胞を吸い上げ、培地を含む15 mLチューブに細胞を加えます。チューブを軽く振って、DCM培地と細胞を混合させます。次に、チューブを室温で100 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、18ゲージの針と20 mLシリンジを用いて、チューブ底部の培地を除去します。その後、2% FBSを添加したDCMを10 mL細胞に加え、チューブを静かに振って混合します。室温で100 ×gにて1分間、細胞を再度遠心分離します。播種を開始するために、20% FBSを添加した41 mLのDCMまたはDMEMを12.5 cmフラスコに加えます。次に、200 µLピペットを用いて、40 µLの脂肪細胞を吸い上げ、フラスコに加えます。その後、フラスコにDCMまたは20% FBSを添加したDMEMを満たします。細胞が培地全体に均一に分散することが非常に重要です。フラスコを水平に保つため、丸型のペトリ皿の蓋の上に置きます。最後に、フラスコを5% carbon dioxideおよび37 °Cに設定したインキュベーターに入れ、7日間静置します。1週間のインキュベーション後、フラスコを反転させ、脱分化した脂肪細胞を確認します。次に、培地を吸引し、20% FBSを添加した5 mLのDCMまたはDMEMをフラスコに加えます。培地を交換した後、DEFAT細胞をさらに1週間培養します。1週間後、細胞カウンターを使用して、さまざまな細胞培養条件下で生成されたDEFAT細胞の数を計測します。この画像は、DMEMで14日間培養した後のDEFAT細胞コロニーを示しています。ここでは、DCMで14日間培養した後のDEFAT細胞を示しています。いずれの場合も、スケールバーは200 micronsを表しています。細胞カウンターを用いてDEFAT細胞の増殖を定量し、DEFAT細胞の生成におけるDCMとDMEMの効率を比較しました。ここで示されているように、DCMの使用により細胞増殖の促進が観察されます。ここでは、DCMを用いて作製したヒトDEFAT細胞を、適切な誘導培地で3週間培養し、DEFAT細胞の再分化能および分化能を評価しました。その結果、アルカリフォスファターゼ染色およびアリザリンレッドS染色により、骨分化能陽性であることが示されました。最後に、オイルレッドO染色により脂肪分化能が示されました。高品質なDEFAT細胞を正常に作製するためには、コラーゲナーゼによる消化と脂肪細胞の分離の両方を細心の注意を払って行うことが極めて重要です。これらの取り組みを通じて、我々が検証した細胞培養法が、発生生物学および再生医療の分野における現在および将来の研究活動を促進することを目的としています。

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脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

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