ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

この手順の全体的な目標は、マウスから異種移植されたヒト腫瘍細胞を迅速に単離して、目的の標的細胞の下流分析を改善することです。この方法による腫瘍化マウス細胞の除去により、ヒト腫瘍細胞の遺伝子発現またはin vitro直接応答の特異的評価が可能になります。この技術の主な利点は、標的細胞の表面マーカーを特定することなく、ヒト腫瘍細胞を迅速かつ容易に分離できることです。

まず、鉗子とメスを使用して、腫瘍サンプルから脂肪と壊死領域を取り除きます。次に、腫瘍を2〜4ミリメートルの小片にミンチします。次に、組織断片を消化ミックスを含む単一細胞懸濁液解離チューブに移し、チューブをしっかりと閉じます。

チューブを逆さまにしてベンチトップ組織解離器マウントに置き、組織片がローターステーター領域にあることを確認します。ヒーターを解離器に取り付け、タッチスクリーン上のフォルダ記号をクリックし、上下の矢印を使用して適切な腫瘍解離モードを選択します。次に、サンプルが配置されているマウント位置を選択し、解離を開始します。

単一細胞懸濁液が得られたら、チューブを素早く遠心分離して、チューブの底に細胞を回収します。70ミクロンのメッシュストレーナーで細胞をろ過し、50ミリリットルの円錐管に入れ、20ミリリットルの培地でストレーナーをすすぎ、洗浄液をサンプルチューブに集めます。次に、細胞を遠心分離し、ヒト腫瘍マウス間質細胞ペレットを5ミリリットルのPBバッファーに再懸濁します。

カウント後、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを1×10あたり80マイクロリットルのPBバッファーに再懸濁し、合計7番目の細胞まで戻します。このステップでは、顕微鏡を使用して、細胞カウンターではなく青色の排除から試して、生細胞の正確な数を取得することが重要です。セルカウンターは、組織解離後の不均一なサンプルの取り扱いにしばしば問題を示します。

次に、マウス細胞用の磁性標識試薬20μLを細胞懸濁液に混合し、冷蔵庫で15分間インキュベートします。セルを標識している間に、LSカラムを適切な磁石に入れ、3ミリリットルのPBバッファーでカラムをすすぎます。インキュベーションの終了時に、420マイクロリットルのバッファーを追加して、総サンプル量を500マイクロリットルまで増やし、後のフローサイトメトリーまたは分子分析のために摂氏2〜8度の50マイクロリットルのアリコートを節約します。

次に、平衡化した70ミクロンメッシュストレーナを使用して、細胞をカラムに加えます。標識されていない標的細胞の流れを収集します。次に、リザーバーが空になったらすぐに、ネガティブセル画分と同じチューブに溶離液を収集するための1ミリリットルのバッファーでカラムを2回洗浄します。

磁気ビーズ結合マウス細胞を採取するには、カラムを新しい円錐形チューブに移し、カラムに3ミリリットルの緩衝液を注入します。抗マウス抗体の新規な組み合わせを使用すると、CD45とMHCクラス1の標識を組み合わせるよりも、異種移植の標的組織におけるマウス細胞のより包括的な検出に大幅に効率的です。実際、この新しい抗体の組み合わせを磁気細胞選別に利用することで、腫瘍の種類に依存しないヒト腫瘍細胞の単離が容易になります。

マウス細胞の枯渇に加えて、磁気細胞の分離中に破片も除去されます。その後、マウスフリーのヒト腫瘍細胞を培養することができ、純粋なヒト腫瘍細胞培養物の生成につながります。ゼノグラフで全エクソームシーケンシングを行う前にマウス細胞を採取すると、リードの総数が大幅に増加するだけでなく、ヒト参照ゲノムにマッピングされた宿主由来のリードの数や、誤って予測された一塩基多型の数が大幅に減少します。

しかし、バイオインフォマティクス法によるマウス由来のリードのin silico除去は、すべてのリードに対して起源種への明確な配列ベースの割り当てが可能ではないため、実験手順を完全に置き換えることはできません。ここで予測される SNP の数に示されているように、in silico 手順では、in vitro で枯渇したサンプルの品質向上と共犯的な読み取りカバレッジの向上を補正することはできません。習得すると、腫瘍の準備、解離、計数、磁気分離を含むすべての手順が適切に実行されれば、2時間で完了できます。

この手順を試みる際には、組織サンプルを解離のために適切に準備し、攻撃的な酵素を使用しないこと、および正確な細胞数を確実に取得することが重要です。この手順に従うと、精製されたヒト腫瘍細胞は、あらゆる種類のダウンストリーム分析、培養、またはその後の磁気またはフローベースの細胞ソーティングに使用できます。その開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が、マウス細胞からのバイアスなしに、患者および半直接異種移植片からのヒト腫瘍およびがん幹細胞を探索する道を開きました。

このビデオを見れば、純粋な標的細胞集団を用いて下流のアッセイをいかに迅速かつ簡単に改善できるかを十分に理解できるはずです。