Name: 前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶ 前臨床患者由来腫瘍異種移植モデルの構築と維持管理。新規抗がん療法の有効性評価と薬剤耐性メカニズムの解明に活用でき、腫瘍の異質性を保持した臨床的に関連性の高い研究モデルを提供します。

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倫理文：患者由来の結腸直腸腺癌の腫瘍標本は、コロラド州の複数の治験審査委員会によって承認されたプロトコル（08から0439）に従ったコロラド大学病院で患者を同意から得ました。全ての動物作業はコロラド州デンバー施設内動物管理使用委員会（IACUC、プロトコル＃51412（06）1E及び96813（04）1E）の大学によって承認された動物プロトコルの下で行いました。 1.患者の血液を受信し、準備<ol><li> 1集める2 - クエン酸ナトリウムを含む血液/細胞分離管中の血液のミリリットル（血漿、リンパ球および単球バンド、密度勾配液、ゲル障壁、ならびに赤血球および好中球が含まれるチューブ相です）。注意、血液または組織と血液由来病原体のガイドラインに従ってください。 注：PBMCおよび血漿を含むことができる将来の研究のために使用することができる。circulaを単離し、腫瘍突然変異と生殖細胞系の遺伝的変化を比較することタンパク質およびマイクロRNAを調べる細胞遊離DNA（cfDNA）、 などを評価ティン腫瘍細胞、。 </li><li> RTでブレーキなしで15分間、2500×gで遠心分離血液/細胞分離管。 </li><li>末梢血単核細胞（管のリンパ球および単球帯域でのPBMC）を収集し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れ（クリアオートクレーブ可能、DNアーゼ、RNアーゼ、および発熱物質を含まない）、および滅菌リン酸緩衝と管の上部に記入生理食塩水（PBS）。 <ol><li>室温で3分間、2,300×gで遠心分離管の底部でのPBMCのペレットを形成します。次に、上清を注意深く取り除きます。 30秒間3000×gでペレットと遠心分離機を洗浄した後、上清を除去するために、滅菌PBSの1ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>無菌極低温バイアル（DNアーゼおよびRNaseフリー、ノーヒトDNA、エンドトキシンを含まない）1.5ミリリットル中（チューブのプラズマ相に）血液/細胞分離管から血漿を収集するために、ピペットを使用し、中にPMBCのプラズマとペレットを入れます-80°C Fストレージ用reezer。 </li></ol> 2.患者の腫瘍サンプルを受信し、準備<ol><li>準備RPMIまたはDMEM培地1で次のいずれかのペニシリン - ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸の100（10％）、1：1000（1％）Plasmocin、及び10％不活性化ウシ胎児血清（完全培地）と追加20から25腫瘍標本のための滅菌コレクションカップにミリリットル。 </li><li>氷の上で完全培地を含む無菌カップに腫瘍サンプルを取得するか、4℃で維持。 注：腫瘍試料は、外科医によって除去病理学者によって処理され、完全なメディアとの無菌コレクションカップに配置され、過剰な患者の腫瘍組織の一部です。注意、血液または組織と血液由来病原体のガイドラインに従ってください。また、理想的には5匹のマウスを注入するために、腫瘍は約1cm³でなければなりません。 </li><li>免疫不全マウスに注入するための動物施設に腫瘍サンプルを持参してください。 注：これは、できるだけ早く腫瘍サンプルを処理するのが最善です。 <ol><li>層流フードでは、腫瘍カップから滅菌プラスチック切削皿に腫瘍サンプルを配置します。ゼラチン状のタンパク質の混合液300μlで満たしたオートクレーブし1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに約12 3×3×3ミリメートル片と場所を - 10にカットするためにオートクレーブし、小さなハサミとピンセットを使用してください。チューブを氷上に保管してください。 </li><li>優先順位としてはマウスに腫瘍を注入したが、残された腫瘍が、存在する場合、フラッシュ凍結バイアル（FF）、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）カップ、および生存腫瘍バイアルを収集します。 </li><li> FFの場合、このようなタンパク質、RNA、またはDNAの単離などのさらなる分析のための無菌極低温バイアルから腫瘍組織の小片を収集します。 -80℃の冷凍庫で長期を置きFF直ちに液体窒素デュワーへと格納します。 </li><li>十分な腫瘍がある場合、腫瘍は、少なくとも24時間ホルマリンでいったんFFPEのために、パラフィン包埋ブロックに10ミリリットル10％ホルマリンカップとプロセスに3小片を配置します。 注：24時間が基づいています私たちの組織学コア・提案11オフ。 </li><li>最後に、極低温管に残っている腫瘍を配置します。メディアを完了するために、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することによって実行可能なメディアを作ります。次に、極低温管に1ミリリットルを追加し、氷上で保存します。注意：長時間氷上に保管しないでください。 <ol><li> 10腫瘍が将来的に5匹のマウスに注入するために理想的に十分でしょう小片に残った腫瘍をカット。それはイソプロピルアルコール冷凍コンテナ（ゆっくり時間に腫瘍1℃をフリーズ）に入れ、-80℃の冷凍庫に入れることができるようになるまで、その後、腫瘍は中に死亡しないことを確実にするために氷の上で生存腫瘍チューブを配置凍結プロセス。 注：長期保存のために腫瘍が除去される（2の後 - 3日）と大きな液体窒素デュワーに入れました。マウスに注入するために取り出されている場合を除き実行可能なチューブが解凍させてはならないことに注意してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3。患者由来の腫瘍異種移植片の注射<ol><li>各個別の患者由来の腫瘍のために8週齢の雄および/または雌無胸腺ヌードマウス（欠損T細胞） - 5 6を使用してください。 10腫瘍（マウス当たり2回の注射）皮下（SQ）の合計を注入します。 注：元のヒト腫瘍は、F0として指定され、その後、いったん次の世代がF1であるマウスに注射します。また、それぞれのユニークな外植オートクレーブ鉗子、はさみ、およびトロカールを使用します。 </li><li>オートクレーブ処理12のGトロカールにゲル状のタンパク質の混合溶液からの腫瘍の負荷片とは、腫瘍が完全にトロカール内に押し込まれることを確認してください。 <ol><li>無菌層流フードでは、イソフルラン麻酔マシンに接続されている麻酔ボックスに5匹のマウスを置く（麻酔の維持のために3％イソフルラン - - 4％の酸素、および2 5％イソフルラン、3の初期速度で開始）そして、チャコールフィルター（過剰なガスを吸収します）。 注：経験豊富な技術者が上の全体の手順を実行することができるはずです約5分間の合計（マウス当たり約30秒）内の5匹のマウスのケージ。そのため、追加の熱支援や目の潤滑が一般的に使用されていません。経験の少ない個人またはトレーニング中に、非常に個人が一度に少ない動物での手順を実行し、および/または動物が5分よりも長く麻酔される場合は手順の間に温暖化パッド/アイ・潤滑を使用することを推奨します。手順は、私たちの大学のIACUC基準に基づいています。 </li></ol></li><li>マウスはもはや応答であることを確認しないために、マウスのつま先をつまんで、その後、イソフルランボックスの外にマウスを取ります。腹部はオートクレーブ処理12のGトロカールに到達するまで、中央の背側頸部とダウン皮下トロカールをスライド上の腫瘍を注入するためにクリーンなフィールドの上にマウスを置きます。 <ol><li>マウスの脇腹の各側に1つの腫瘍皮下を提供します。腫瘍が希望脇腹領域に留まることを確実にすること、トロカールを引き抜く際、腫瘍ピンチ。 GElatinousタンパク質混合物は、マウスの体温で硬化し、腫瘍の成長を助けるとSQ結合組織に固定するために約1週間腫瘍をカプセル化します。トロカールによって作られた病変は、4ミリメートルよりも大きくないとステープルで皮膚を閉鎖する必要はありません。 注意：私たちの獣医師にはクロージャが病変の非常に小さなサイズ、迅速な治癒時間（ミドル背側ネック領域は、病変の任意の皮膚の張りやグルーミングを低下させる）、何の感染は認められなかっし、この期間中に動物の綿密なモニタリングに基づいて必要とされない決定。 </li></ol></li><li>マウスは、メロキシカムを2mg / kgのSQ（鎮痛剤）離れた腫瘍注射部位から完全に目を覚まして注入される前に。次に、ケージにマウスを置き、マウスが目を覚ましと移動されるまで監視します。 注：完全に目を覚ましまで無人回復動物を放置しないでください。メロキシカムの投与量は、私たちの大学でIACUC基準に基づいています。 <ol><li>次に、4と同じ手順を繰り返しますマウスを残りと彼らの呼吸を監視します。 注：これは非常に迅速な手順であるとマウスはメロキシカム注射後すぐに目を覚ますが、必要に応じてイソフルランを調整しますのでご注意ください。マウスが取り出されるたびに、イソフルランを断ります。メロキシカムは24時間持続し、トロカールからの病変は完全に1週間で治癒します。 </li></ol></li></ol>患者由来の腫瘍異種移植片バンクの4メンテナンス<ol><li>少なくとも一週間に一度、マウスの成長と健康を監視します。腫瘍サイズ、腫瘍発生、腫瘍注射の日、マウスの健康状態を追跡するために、スプレッドシート（​​または他の追跡システム）を使用します。 注：マウスは15元の体重％、低ボディコンディションスコア（≥2）を紛失した場合、腫瘍潰瘍、腫瘍が2000ミリメートル3または総腫瘍3000ミリメートル3、または猫背（病弱であり、寒さ、無気力などに達しています。）どのような方法で、マウスは、CO₂を経由して安楽死させたりなどのように頸椎脱臼が続く麻酔しますecondary方法。腫瘍を収集し、それ以外のマウスはCO₂と頸椎脱臼を経由して安楽死させた場合、麻酔と頚椎脱臼を経由して安楽死させます。 </li><li>腫瘍は、上述した後、安楽死させるために頸椎脱臼を行うように、約1,500〜2,000 mm 3でマウスを麻酔ある場合。 <ol><li>マウスはハートビートを持っていないことを確認してください。オートクレーブ処理ハサミやピンセットでSQ腫瘍を切除。 注：腫瘍が最大1年間の成長を許可すると全く腫瘍が見られない場合には、その後、CO 2を介してマウスを安楽死させる、二の方法として、頸椎脱臼が続きます。 </li><li>パッセージ（5匹のマウスの新しいセット別名 ）次の世代に最高の増殖する腫瘍。また、上記のように残りの腫瘍を収集し、次に渡すと、12の腫瘍 - 10を収集するために、上記の手順を使用してください。 注：多数の実行可能なチューブを収集することは、早期の世代（F1 - F8）で非常に重要です。したがって、いくつかの実行可能なチューブ、FF管、およびgeneratあたり1 FFPEを収集イオン。 </li><li>マウスの新世代は、約300ミリメートル3の腫瘍増殖を有するまで残りのマウスを保管してください。残りのマウスは大きい腫瘍を有する場合、上記のように収集し続けます。 </li></ol></li><li>通路腫瘍に進み、F15まで、各段階で収集します。この時点で、液体窒素のうちできるだけ早い世代の生存可能なチューブを取り、氷上で解凍してみましょうし、上記腫瘍注入の手順に従ってください。 注：実行可能な管から成長する腫瘍は、世代から世代へ渡すと比べてマウスで成長に時間がかかるので、計画するとき心に留めておきます。特定のPDTXモデルはもはや通路で必要とされている場合は、安楽死させず、多数の実行可能なチューブは、将来の使用のために収集されることを保証するために、腫瘍を収集します。 </li></ol>患者由来の腫瘍異種移植片5.発達治療薬 F3世代のほとんどの腫瘍は良好な成長速度を持っている（より速く成長し、より多くの共同注意：nsistent）、したがって、PDTX薬効試験に進みます。 <ol><li>希望の腫瘍が非常に大きい場合（1500 - 2000ミリメートル3）、マウスの所望の量に展開するために、腫瘍を収集するために、上記の手順に従ってください。 <ol><li>仮説に応じて治療群ごとに必要な腫瘍の数を決定するテストされています。 注：ゲル状のタンパク質混合物溶液1mlをマウスに注入するための約30フィット小さな腫瘍片（腫瘍の形態に応じて）することができます。 </li></ol></li><li>腫瘍体積を決定するためにノギスで腫瘍を測定 - （300mm³約50〜）毎週、ほとんどの腫瘍が目に見えて小さい腫瘍を有するマウスを確認してください。腫瘍体積= [width²（最小測定）×長さ（最大測定値）] 0.52 xは。 注：ゲル状のタンパク質混合物溶液を、1週間の腫瘍増殖が正確になり、その後の後、一週間注射した腫瘍片を取り囲みます。 </li><li> 300mm³と - 50の間で腫瘍体積を使用しますnは左右の腫瘍を平均します。その後、お互いのいくつかの数字内のグループおよびグループあたり平均10腫瘍を治療群にランダム化します。次に、グループにマウスをソートし、所望の治療研究を開始。 </li><li>薬（薬物依存スケジュール）毎週二回、重さと対策（腫瘍）をマウスに投与量。研究の終了時に、麻酔及び頸椎脱臼を経由して、マウスを安楽死させると、ラボでの将来の薬力学的分析のために腫瘍を収集します。 注：試験車両腫瘍サイズおよびマウスの健康状態に依存して30日間続きます。 </li></ol> PDTX銀行の6機関<ol><li>研究と動物の適切な使用の繰り返し防止するために、十分に立証された形をしてください。 注：これは成功PDTXバンクへの鍵です。 <ol><li> PDTXバンクのマウス、トリートメント、データに、診療所でヒト患者から腫瘍を追跡するためにスプレッドシートを使用し、何が収集されます。注：これは冷凍庫、液体窒素デュワーを含み、およびFFPEストレージとしても。 </li></ol></li></ol>

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<li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+growth+of+human+met-expressing+xenografts+in+a+new+strain+of+immunocompromised+mice+transgenic+for+human+hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor.</a> Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

PDTX創薬プラットフォームは、新規化合物の臨床活性を予測する際の信頼性が低い他の前臨床モデルの欠点を改良モデルを提供しています。重要なことは、このモデルにおける腫瘍は転移能を保持し、生物学的に安定しており、世代から世代へ同様の薬剤応答性を示します。このモデルでは、患者由来の腫瘍を、無胸腺ヌードマウスに注射継代し、続いて治療の評価に使用されます。含ま成功PDTXバンクのためのいくつかの重要なステップがあります：1）凝集臨床チームは/同意患者を特定し、優れた研究室や技術的な動物と除去と腫瘍組織のグロスPDTXモデル用と2）強力な研究グループのためにすることPDTXバンクの腫瘍組織および保守を注入したマウスの健康状態を監視するためのスキル。私たちのPDTXモデルでの重要な利点は、トロカールの手順で腫瘍を注入されます。立方の代替方法腫瘍ポケットをめの設定し、その後縫合または皮膚クリップを使用すると、担当者のためにかかる多くの時間であり、より痛みのマウスのための薬物療法、および縫合または創傷クリップされた領域の監視を必要とします。トロカール手順は、以下の訓練を必要とする非常に迅速であり、マウスは、より少ない時間で麻酔下で、痛みが少なく薬が必要...

大腸癌（CRC）は、米国における癌死亡に多大な貢献です。 2015年には、49700人が死亡1とCRCの推定132700新たな症例がありました。限局性疾患を有する患者における予後は良好であるが、進行した疾患を有する患者は、新しい治療法の開発に、この主要な優先順位を作り、予後不良を持っています。この疾患に対してデプロイされているケアの化学療法レジメンと新しい生物製剤の標準にもかかわらず、全体的な生存率の増分のみ増加しています。従って、この疾患における腫瘍増殖の促進に関与するドライバの経路を理解するのに多大な努力があります。 WNT、PI3キナーゼ（PI3K）、RAS、成長因子β（TGF-βの）とTP53 2を変換する：がんゲノムアトラスネットワークは最近、CRCの調節不全に関与し、含まれている多数の主な経路を特定しています。一緒に、OTを記述調査でCRCの成長を増強する彼女の経路は大きく、この患者集団3-5の生存率の改善を目的とした新しい治療法の開発に火をつけています。腫瘍学の薬剤開発における利用前臨床モデルでは、これらの新規化合物の臨床活性を予測するには、このプロセスに不可欠でした。 種々の前臨床モデルは、薬物開発プロセスで利用されてきました。前臨床のトランスジェニック動物モデルおよび細胞株は、主としてヒト腫瘍の複雑さを反映することができないことに、新規な腫瘍治療薬の臨床活性を決定するのに成功していない不死化することを考慮すると、患者由来の腫瘍異種移植片（PDTX）モデルが確立されています。このモデルの最大の利点は、腫瘍の不均一性が損なわれないままと密接に元患者の腫瘍6-9の分子特性およびクローン性を反映していることです。 PDTXモデルは、in vivoで優れを提供します新規な薬剤を研究するための前臨床プラットフォーム、薬剤耐性経路、組み合わせ戦略、がん幹細胞生物学10。 PDTXプロセスの概要を図1に示されている。これは、その過剰な腫瘍組織のいくつかは、この研究のために使用することができるように患者の同意、診療所で始まります。次に、手術で腫瘍の作品は、病理学者によって儲けされ、研究員に輸送するメディアに入れました。その直後に、腫瘍の部分を小片に切断され、免疫不全マウスの皮下に移植します。腫瘍が成長すると、それは腫瘍10を維持するために、マウスの異なる世代に継代されます。典型的には、F3世代後の腫瘍は、新規な化合物および/または組み合わせ治療が評価される処置試験に拡張することができます。利用次世代のSeq（ExomeのSeq、RNAのSeqおよびSNPアレイ）の潜在的な予測バイオマーカーが発見されています特定の治療から利益を得ることができる患者の選択を支援編。 1）単剤として、または組み合わせて新しい治療法の有効性を評価し、2）前臨床研究への感受性または耐性を予測するバイオマーカーを同定：PDTXモデルを使用しての包括的な目標はにあります。本稿では、我々は、CRC PDTXバンクの開始および維持における方法論を提供し、薬剤開発の発見で、このモデルの利点と限界を提供します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54393/54393fig1.jpg" /> CRC PDTXモデル議定書の 図1. 概要。患者由来の腫瘍は手術から受信し、すぐに皮下無胸腺ヌードマウスに注射されます。腫瘍が成長したら、それが次の世代へと拡大し、最終的には治療の研究のために拡張されます。治療RESPONSEが評価され、予測バイオマーカーは、患者の選択を助けることができることが確認されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54393/54393fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>RPMIまたはDMEM</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>-4°Cで解凍します。C、次に60°で30分間アクティブにします。Cウォーターバス</td></tr><tr><td>CPT血液チューブ</td><td>BDバキュテナー 362761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>SurelockA-7002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>サイロゲンバイアル</td><td>Cyroking</td><td>C0732901</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック腫瘍切断皿</td><td>TruelineTR4001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル (ゼラチン状タンパク質混合物)</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>-20 または -80 >Cは、その後、氷上で解凍し、RT</td></tr><tr><td>10%ホルマリンカップで</td>残さないでください <td>プロトコル</td><td>032-059</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素デュワー貯蔵</td><td>サーモリン</td><td>CY50900</td><td></td></tr><tr><td>ポータブル液体窒素デュワー</td><td>Nalgene</td><td>4150-2000</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィ</td><td>ッシャー67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>冷凍容器:Mr Frosty</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>のDecon</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trocars</td><td>の革新的な研究</td>アメリカの<td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>パターソン獣医</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔箱</td><td>パターソン獣医</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>獣医1 1038005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-AirキャニスターBickford</td><td>オムニコン</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td>獣医15182-90C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャリパー</td><td>ファウ</td><td>ラー54-100-167</td><td></td></tr><tr><td>重量スケール</td><td>オーハウス</td><td>スカウトプロSP601</td><td></td></tr></tbody></table>

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

患者由来腫瘍異種移植片(PDTX)モデルは、ヒト試験に先立って抗がん剤の開発を促進するために必要なプラットフォームを提供します。ヒト腫瘍片は、無腺ヌードマウス(免疫不全、T細胞欠損)に皮下注射して腫瘍のバンクを作成し、その後、これらの腫瘍を患者から維持するために、異なる世代のマウスに継代されます。 重要なことに、このモデルでは元の腫瘍の細胞の不均一性が密接にエミュレートされており、薬効研究(単剤および併用)、バイオマーカー分析、耐性経路、およびがん幹細胞生物学の評価に、より臨床的に関連性のあるモデルを提供します。PDTXモデルのいくつかの制限には、マウスの第1世代以降のヒト間質のマウス間質への置換、腫瘍の皮下注射による転移に対する治療効果を調査できないこと、免疫不全マウスの使用による免疫療法の評価の欠如などがあります。しかし、このような制限があっても、PDTXモデルは創薬プロセスにおける強力な前臨床プラットフォームを提供します。

CRC PDTXモデルで一般的な突然変異の類似点とTCGA 私たちは、CRC PDTXバンクにおける共通の変異（KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、APC、CTNNB1およびTP53）の割合は、CRC患者集団で見られる変異頻度の代表であったかどうかを調べました。 図2A（TCGA）及びB（CRC PDTXバンク）に示すように、これらの遺伝子の変異の頻度は、TCGA（N = 276人の患者）とCRC PDTXバンク（N = 59 CRC患者）との間に非常に類似していました。 23％の差が見られたことにより観察された最大の違いは、APC遺伝子にありました。これらの結果は、CRC患者集団において観察された一般的な変異はよくCRC PDTXモデルで表現されることを示唆しています。 <p class="jove_content...

皮下前臨床モデルで患者由来の腫瘍を利用する新しい治療法、予測バイオマーカーの発見、および薬剤耐性経路の有効性を研究するための優れた方法です。このモデルは、薬物開発プロセスにおいて、臨床試験の前に、多くの新規抗癌療法の運命を決定する上で不可欠です。

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

この皮下患者由来腫瘍異種移植（PDX）の手順の全体的な目的は、腫瘍における新規治療法の有効性、予測バイオマーカーの探索、および薬剤耐性経路を研究することです。この手法は、特定の薬剤が特定の腫瘍型に対して活性を示すかどうかという、腫瘍学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、患者由来腫瘍異種移植片が、元の腫瘍に特有の分子、遺伝子、および組織学的な不均一性を保持しているため、モデルの臨床的妥当性がより高くなることです。本手順の実演は、当研究室の専門リサーチアシスタントであり、認定獣医技術者であるStacey Bagbyが行います。クエン酸ナトリウム含有血液細胞分離チューブで1～2 mLの血液を採取した後、サンプルを遠心分離し、末梢血単核細胞層を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。チューブに滅菌PBSを上まで満たしてください。その後、細胞を再び遠心分離します。次いで、PBMCペレットを乱さないように注意しながら、1 mLのPBSで迅速に洗浄します。その後、ピペットを使用して、血液細胞回収チューブから血漿を1.5 mLの滅菌済み凍結保存チューブに移し、血漿とPBMCペレットを-80 °Cで保存します。ヒト腫瘍組織を完全培地を入れた滅菌カップに入れ、動物施設へと運搬し、カップをラミナーフローフード内に設置します。採取後、速やかに組織を少量の回収培地と共に滅菌プラスチック切断皿に移します。次に、オートクレーブ滅菌済みの小型はさみとピンセットを用いて、組織を約 3 × 3 × 3 mm の大きさに切断し、10〜12個の断片を、300 µL のゼラチン状タンパク質混合溶液が入ったオートクレーブ滅菌済み 1.5 mL マイクロ遠心チューブに入れ、移植用に氷上で保持します。急速凍結保存を行う場合は、適切な数の腫瘍片を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、バイアルを液体窒素ドナーに入れます。その後、-80 °Cのフリーザーで保存します。ホルマリン固定およびパラフィン包埋を行う場合は、3つの小さな腫瘍片を10 milliliterの10%ホルマリンカップに入れ、24時間固定します。組織をパラフィン包埋ブロックに処理した後、残りの組織片を凍結保存チューブに移します。次に、10% DMSOを添加した完全培地を1 mL加え、イソプロピルアルコール凍結容器に移すまでチューブを氷上で保持します。その後、その容器を-80 °Cのフリーザーで保存します。腫瘍組織を注入するために、ゼラチン状タンパク質混合液に保存した腫瘍片をオートクレーブ滅菌済みの12ゲージトロカールに充填し、各腫瘍片がトロカールに完全に挿入されていることを確認します。次に、6〜8週齢の無胸腺ヌードマウスにおいて、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認し、マウスを滅菌ラミナーフローフード内の清潔な領域に移します。F0腫瘍を、背側頸部およびマウスの両側腹部に皮下投与し、続いて、腹部の腫瘍注入部位のいずれかから遠位に鎮痛剤を皮下投与します。その後、マウスをケージに戻し、完全に回復するまで観察します。キセノグラフトを移植したマウスの成長と健康状態を少なくとも週に1回確認し、腫瘍のサイズ、腫瘍の世代、腫瘍注入日、およびマウスの健康状態を適切な追跡システムに記録します。腫瘍のサイズが約1,500〜2,000 cubic millimetersに達したら、オートクレーブ滅菌済みのハサミとピンセットを使用して腫瘍を摘出し、先ほど実演した通り、F1腫瘍を次の世代の5匹の動物に継代します。その際、各腫瘍について実演した通り、急速凍結サンプル、ホルマリン固定サンプル、および生存腫瘍サンプルを注意深く採取してください。F0腫瘍群の残りのマウスにおいて、腫瘍の大きさが約1,500〜2,000立方ミリメートルになった時点で、先ほど実演した採取方法に従ってこれらの腫瘍を回収します。F15段階の腫瘍作製に達した際は、次の一連の腫瘍注入のために、液体窒素保存庫にある利用可能な中で最も初期の世代の生存腫瘍片を使用してください。目的の腫瘍が1,500〜2,000立方ミリメートルと非常に大きい場合は、上述の手順に従って腫瘍を回収し、目的の匹数のマウスへ拡張してください。マウスに薬剤を投与し、週に2回、体重測定と計測を行う。マウスを治療群にランダムに割り当て、1群あたり10個の腫瘍とし、群内の平均腫瘍体積が100～300 mm³で、かつ各個体のバラつきが数標準偏差以内に収まるようにする。その後、マウスを適切な治療群に振り分ける。ヒトおよびマウスのDNAを検出する2色蛍光in situハイブリダイゼーションにより、F0腫瘍内のヒト間質細胞が、F1腫瘍ではマウス間質細胞に置換されていることが示されました。また、F0世代のヒト由来肝細胞増殖因子はすべてF1世代ではマウス肝細胞増殖因子に置換されていますが、血管内皮細胞増殖因子リガンドは、F1世代においてヒトおよびマウスの両方のタンパク質で構成されています。同一腫瘍の異なる世代に対する治療を行っても、治療反応に変化は見られませんでした。腫瘍の耐性または感受性は、腫瘍の世代よりも腫瘍株に特異的であると考えられます。さらに、これらの頻繁に変異が見られる遺伝子における変異頻度は、The Cancer Genome Atlasと大腸がん患者由来腫瘍異種移植（PDX）バンクの間で非常に類似しています。このことは、大腸がん患者集団で観察される一般的な変異が大腸がん患者由来異種移植モデルに十分に反映されていることを示唆しています。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1〜2時間で完了させることができます。本手順を試みる際は、がん患者の特定と同意取得、および腫瘍組織の摘出と肉眼観察を行うために、まとまりのある臨床チームを編成することが重要です。本手順の後、単剤または併用剤としての抗がん剤化合物の検討など、他の手法を実施することで、特定の腫瘍型を持つ患者に対するこれらの戦略の生存可能性について、さらなる疑問に対する答えを得ることができます。本手法の開発後、腫瘍学分野の研究者は、新規がん治療薬、腫瘍の不均一性、治療耐性メカニズム、がん幹細胞生物学、および腫瘍ストロマ相互作用の探索が可能となりました。このビデオを視聴することで、新規がん治療薬を評価するための患者由来腫瘍異種移植（PDX）モデルの作製および維持方法について、十分に理解することができるはずです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。...

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

癌細胞の移植は、癌のメカニズムおよび治療応答の同定のための重要なツールである。現在の技術は免疫不全動物に依存する。ここでは、腫瘍細胞の挙動およびインビボでの薬物応答の長期解析のために、ゼブラフィッシュ腫瘍細胞を免疫コンピテント胚に移植する方法を説明する。...

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

ここでは、癌に対する信頼性の高い前臨床モデルを作成する生物学的関連性の高いサイトで超音波ガイド下注入 (NB) 神経芽細胞腫、ユーイング肉腫 (ES) 細胞を利用する (設立細胞と患者由来腫瘍細胞)...

超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。...

黒色腫患者由来異種移植片モデル

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-翻訳免疫腫瘍学研究のためのヒトヒト異種移植片マウスモデルについて説明する。このプロトコルは、I-O療法評価のための同様のモデルを確立し、特徴付けるための一般的なガイドラインとして役立つ可能性があります。...

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)移植型ヒト型異物移植モデル翻訳免疫腫瘍学(I-O)研究

現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルから患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。この方法は、創薬やがん生物学の研究に役立つツールです。...

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。...

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。...

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

以下の研究では、大腸癌および膵臓癌の大型バイオバンクの確立に必要な連続したステップについて述べています。...

生きたバイオバンクの創造と維持 - 私たちはそれを行う方法

本プロトコルは、PDXモデルがトランスレーショナルオンコロジーの分野で急速に標準になりつつあるため、未分化甲状腺癌(ATC)および頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の患者由来異種移植片(PDX)モデルを確立し、特徴付けます。...

未分化甲状腺癌および頭頸部扁平上皮癌の患者由来異種移植片モデルの確立と特性評価

ここでは、新鮮なメラノーマ組織から解離細胞懸濁液を培養することにより、メラノーマ患者由来のオルガノイドを生成するプロトコルを紹介します。これらのオルガノイドは 、in vitro で患者特異的な腫瘍を忠実に再現し、腫瘍免疫抑制メカニズム、薬物スクリーニング、薬剤耐性メカニズム、およびがんサーベイランスアプローチを探索するための革新的なアプローチを提供します。...

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

学ぶ 前臨床患者由来腫瘍異種移植モデルの構築と維持管理。新規抗がん療法の有効性評価と薬剤耐性メカニズムの解明に活用でき、腫瘍の異質性を保持した臨床的に関連性の高い研究モデルを提供します。

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

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