シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて
2016年9月29日
私たちは、自然に無関係なタンパク質間のコミュニケーションを誘導できる合成の「化学トランスデューサー」を開発するためのガイドラインを提示します。さらに、成長因子が解毒酵素を活性化し、その結果、抗がんプロドラッグの切断を調節することを可能にする特定の「トランスデューサー」を合成および試験するための詳細なプロトコルが提示されます。
この実験の全体的な目標は、合成化学トランスデューサーによって誘導される2つのタンパク質間の不自然なコミュニケーションを分光学的に追跡することです。これは、自然界には見られないシグナル伝達経路を実行できるシグナル伝達タンパク質の合成類似体を開発する可能性を示しています。一般的な分光光度計によって非天然のタンパク質間通信を追跡する能力は、人工化学トランスデューサーの機能を開発および改善し、人工シグナル伝達療法の達成に近づくのに役立つ可能性があります。
化学トランスデューサーは、血小板由来の成長因子、またはPDGFアプタマーで構成されています。二価エタクリン酸アミドGST阻害剤、蛍光色素およびクエンチャー。このビデオでは、化学トランスデューサーの合成については説明しません。
しかし、テキストプロトコルで記述されています。ここでは、化学トランスデューサーの動作原理を示しています。化学トランスデューサーは、2つのEAグループが酵素の活性部位に結合するときに、GSTの酵素活性を阻害します。
PDGFを添加すると、PDGF化学トランスデューサー複合体が形成されます。これにより、トランスデューサーとGSTの相互作用が妨げられ、GST酵素活性が回復します。続いて未修飾のPDGFアプタマーを添加すると、化学トランスデューサーが放出され、酵素が再阻害されます。
PDGFによるGST活性の制御を検討するための実験を開始する前に、プレートリーダーで速度論測定のための実験手順を設定してください。新しい実験を標準プロトコルとして作成します。「プロシージャ」を選択して、「プロシージャ設定」ウィンドウを開きます。
ウィンドウ上部のポップアップリストで、プレートの製造元に応じて384プレートタイプを選択します。左側のメニューで [読み取り] を選択します。検出方法として吸光度を選択します。
読み取りタイプのエンドポイント。[波長] ウィンドウに「340 ナノメートル」と入力します。Full Plateを選択し、測定するウェルを選択します。
次に、[OK]をクリックして[読み取り]ウィンドウを閉じます。左側のメニューで、[Start Kinetic] を選択します。[実行時間] を 10 分に設定します。
[最小インターバル] オプションを選択します。次に、[OK]をクリックして[Kinetic]ウィンドウを閉じます。読み取りラインをKinetic Measurementにドラッグします。
[検証] ボタンを選択し、次に [OK] ボタンを選択します。実験を保存します。[再生] ボタンを選択します。
ダイアログボックスが表示されますが、動力学測定を開始する準備ができるまで[OK]ボタンを選択しないでください。プレートリーダーをセットアップしたら、次のステップは、化学トランスデューサーとPDGFの存在下でGST活性を測定するためのサンプルを準備することです。PDGFの4つの濃度を三重に試験するには、それぞれに3.25マイクロリットルの化学トランスデューサーと3.25マイクロリットルのGST M-1を含む4つのサンプルを準備します。
各サンプルに、それぞれゼロ、1.2、2.4、または4.9マイクロリットルのPDGFを追加します。次に、各サンプルに適切な量のアッセイバッファーを添加して、総量を130マイクロリットルにします。サンプルを室温で10分間インキュベートします。
10分後、各サンプルの40マイクロリットルを384透明ウェルプレートのウェルに移します。4つのサンプルのそれぞれを、同じ行の奇数ウェルまたは偶数ウェルにのみ移します。基質添加用のマルチピペッターの使用を可能にするため。
次に、12チャンネルマルチピペッターを使用して、96ウェルプレートで事前に調製した各基質の10マイクロリットルを各サンプルにすばやく追加します。泡を避けるために、すばやく、しかし穏やかに混ぜます。すぐにプレートをプレートリーダーに挿入し、ダイアログボックスのOKボタンを選択して運動測定を開始します。
化学トランスデューサーによって媒介されるGST活性化阻害サイクルを調べるには、それぞれ84.5マイクロリットルのアッセイバッファー、3.25マイクロリットルの化学トランスデューサー、および3.25マイクロリットルのGST M1-1を含む5つのサンプルを準備します。室温で3分間インキュベートします。
サンプル1に3.65マイクロリットルのアッセイバッファーを、サンプル2、3、4、5に3.65マイクロリットルのPDGFを添加します。室温で3分間インキュベートします。サンプル1と2に3.12マイクロリットルのアッセイバッファーを、サンプル3、4、5に3.12マイクロリットルのPDGFアプタマーを添加します。
室温で3分間インキュベートします。24.4マイクロリットルのアッセイバッファーをサンプル1、2、3に加えます。そして、サンプル4と5に24.4マイクロリットルのPDGFが含まれています。
室温で3分間インキュベートします。サンプル1〜4に7.8マイクロリットルのアッセイバッファーを、サンプル5に7.8マイクロリットルのPDGFアプタマーを添加します。室温で5分間インキュベートします。
サンプルを384透明ウェルプレートに移します。実験を三重に行い、サンプルに基質を迅速に追加します。プレートをリーダーに挿入し、動態測定を開始します。
このアッセイを開始するには、プロトコルのテキストに記載されている速度論的測定のために、プレートリーダーで実験手順を設定します。384透明ウェルプレートの2つのウェルに2つのサンプルを調製します。各ウェルについて、1マイクロリットルのGST M1-1と1マイクロリットルの化学トランスデューサーを38マイクロリットルのアッセイバッファーに混合します。
2つの井戸の間に空の井戸を残します。12チャンネルマルチピペッターを使用して、各ウェルに10マイクロリットルの基質をすばやく追加します。そして、泡を避けるために穏やかに素早く混ぜます。
すぐにプレートをリーダーに挿入し、動力学的測定を開始します。3.5分後にプレートリーダーが開いたら、ウェルの1つに1.125マイクロリットルのPDGFをすばやく追加し、穏やかに混合し、残りの動力学的測定のためにプレートをリーダーに再挿入します。この実験用のサンプルを調製する前に、プロトコルのテキストで説明されているように、プレートリーダーで速度論的測定のための実験手順を設定します。
亜硝酸塩/硝酸塩比色キットは、一酸化窒素の生成を測定するために使用されます。96ウェルプレートで、ウェルあたり50マイクロリットルのアッセイバッファーを最初の列に分注します。2列目にウェルごとに70マイクロリットルのGriess One Reagent。
そして、70マイクロリットルのGriess Two Reagentを3列目に注ぎます。それぞれに4.8マイクロリットルの化学トランスデューサーを含む4つのサンプルを準備します。1つをサンプリングするには、155.2マイクロリットルのアッセイバッファーを追加します。
サンプル2には、3.2マイクロリットルのGST M1-1と152マイクロリットルのアッセイバッファーを追加します。サンプル3を採取するには、9.6マイクロリットルのPDGFと145.6マイクロリットルのアッセイバッファーを添加します。そして、サンプル4に、3.2マイクロリットルのGST M1-1、9.6マイクロリットルのPDGF、および142.4マイクロリットルのアッセイバッファーを追加します。
サンプルを室温で10分間インキュベートします。384の透明なウェルプレートにウェルあたり50マイクロリットルのサンプルを分注し、実験を3回に分けて行います。同じラインの奇数または偶数のウェルにのみサンプルを分注し、基質添加にマルチピペッターを使用できるようにします。
各サンプルに0.54マイクロリットルのJS-Kプロドラッグを追加します。各サンプルに10マイクロリットルのグルタチオン溶液をすばやく加え、泡を避けるために穏やかかつ迅速に混合します。プレートをリーダーに挿入し、動態測定を開始します。
速度論的測定の直後に、各サンプルの50マイクロリットルを、アッセイバッファーを使用して96ウェルプレートの最初の列の各ウェルに移します。次に、プレートの2列目の各ウェルから50マイクロリットルをプレートの最初の列のウェルに移します。そして、プレートの3列目からプレートの1列目のウェルへのウェルあたり50マイクロリットル。
室温で10分間光から保護しながらインキュベートします。550ナノメートルで吸光度を測定する前に。化学トランスデューサーを使用しない場合と化学トランスデューサーを使用してGST活性を測定すると、化学トランスデューサーがGST活性を阻害することが示されました。
GSTは、GST-化学トランスデューサー複合体にPDGFの濃度を増加させることにより再活性化されます。PDGFを連続的に添加し、GST-化学トランスデューサ複合体に未修飾のPDGFアプタマーを添加したところ、PDGFとGSTの間の通信が可逆的であることが明らかになりました。GSTトランスデューサ複合体にPDGFを添加すると、基板を添加してから3.5分後にGST活性が急速に増加しました。
一方、GST、PDGF、および化学トランスデューサーの混合物にPDGFアプタマーを添加すると、GST活性が低下しました。これらの結果は、システムが環境の変化にリアルタイムで応答することを示しています。続いて、GSTによって活性化されて有毒な一酸化窒素を放出する抗がんプロドラッグであるJS-Kを使用して、このシステムがプロドラッグの活性化を制御する能力を調査しました。
化学トランスデューサーにJS-Kを添加し、GSTとPDGFを異なる組み合わせで添加した場合に放出される一酸化窒素の量を測定した結果、GSTとPDGFの両方が存在する場合にのみJS-Kが活性化されることが確認されました。これはすべて、合成剤が成長因子が、天然の酵素パートナーではないグルタチオンS-トランスフェラーゼの触媒活性を誘発することを可能にする方法を示しています。したがって、このクラスの将来のバイオミメティクスは、環境シグナルに対する細胞の応答を変化させたり、細胞に新しい特性を提供したりするために使用できます。
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概要
本研究では、無関係なタンパク質間の通信を促進する合成「化学トランスデューサー」を開発するためのガイドラインを提示します。ここでは、増殖因子を介して解毒酵素を活性化させる特定のトランスデューサーの合成および試験に関するプロトコルについて詳しく説明します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- タンパク質工学
- 信号伝達
背景
- 合成トランスデューサーを用いることで、タンパク質間の非天然的なコミュニケーションを誘導することができます。
- シグナル伝達タンパク質の合成アナログの開発は、新しい治療戦略にとって極めて重要です。
- このアプローチを通じて、自然界に存在しないシグナル伝達経路を探索することが可能です。
- これらの相互作用の追跡には、一般的な分光光度計を使用できます。
研究目的
- タンパク質間コミュニケーションにおける合成化学的トランスデューサーの実現可能性を実証すること。
- 人工化学的トランスデューサーの機能を向上させること。
- 人工シグナル伝達療法を推進すること。
使用された手法
- PDGFアプタマーで構成される化学変換器の合成。
- 二価のエトアクリニックアミドGST阻害剤の利用。
- 分光分析のための蛍光色素およびクエンチャーの導入。
- タンパク質相互作用を分光的に追跡するための実験セットアップ。
主要な結果
- 非天然タンパク質間のコミュニケーションの実証に成功した。
- 合成トランスデューサーを用いた新しい治療戦略の開発の可能性。
- 信号伝達経路のメカニズムに関する知見。
- この分野における今後の研究のためのプロトコルの確立。
結論
- 合成化学トランスデューサーは、タンパク質間相互作用を効果的に媒介することができる。
- 本研究は、シグナル伝達療法の革新的なアプローチへの道を開くものである。
- これらの合成システムを最適化するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
産業界における重要性
本研究は、合成化学トランスデューサーがいかにして非天然のタンパク質間コミュニケーションを媒介できるかを実証することにより、人工信号伝達療法の基盤を構築するものである。このアプローチは、天然の調節機構をバイパスする直交シグナル伝達経路を構築することで、ターゲット検証におけるメカニズム上のリスク低減を可能にする。このようなシステムは、酵素活性の精密な時間的制御を可能にするため、前臨床モデルにおいて予測的な価値を提供し、腫瘍学およびその他の疾患領域におけるプロドラッグ活性化戦略に活用できる。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 非天然のパートナー間で誘導可能かつ可逆的なタンパク質間相互作用を可能にすることで、治療仮説の検証を実現します。
- 運用的価値： 遺伝子操作を行うことなく、ターゲットへの結合およびパスウェイ調節を評価するための調整可能なシステムを提供します。
- 予測的価値： 治療リガンドに応答した酵素活性の用量依存的な回復を定量化することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 標準的な分光光度検出を用いて、タンパク質相互作用ダイナミクスの定量的かつリアルタイムな読み取りを可能にする。
- 運用の価値： キネティック解析に適した、高密度プレートリーダー互換の再現性のあるアッセイ形式を確立する。
- 拡張性： 定義された試薬滴定および逐次添加プロトコルを通じて、多条件の同時試験を容易にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的連続性：トランスデューサーを介したGST活性が細胞毒性ペイロードの放出を制御するプロドラッグ活性化への直接的な適用可能性を実証している。
- メカニズム的なリスク低減：信号出力がトランスデューサーと対応するリガンドの両方に依存することを検証しており、偽陽性活性化のリスクを低減している。
- 前臨床モデルの妥当性：in vivoでの検証に先立ち、疾患関連システムにおける人工シグナリング回路の評価を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット結合を機能的リードアウトに結びつける化学誘導性スイッチを提供することで、初期創薬ワークフローに組み込まれ、ヒット化合物の検証からリード最適化への移行を可能にします。
- 探索生物学：リガンド誘導性のトランスデューサー構造変化を介して酵素活性を外部から制御することを可能にし、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：リアルタイムのタンパク質間相互作用イベントを反映した標準的な速度論的測定により、アッセイの即時利用性を実現します。
- 分析：時間分解活性データを生成し、異なる実験条件間でのシグナル伝達ダイナミクスの比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：プロドラッグ活性化を通じてターゲット結合を機能的アウトカムに結びつけ、シグナルの忠実度に基づいたGo/No-go判断をサポートします。
- エンタープライズ再利用：PDGF-GST以外の多様なタンパク質ペアに適用可能な、プラットフォームに依存しないトランスデューサー設計フレームワークを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 内因性パスウェイのノイズからシグナル伝達を分離することで、ターゲットバリデーションの信頼性を高めます。
- 運用的価値： 標準化された試薬比率、インキュベーション時間、および検出パラメータを通じて、再現性を確保します。
- 戦略的価値： 複雑な治療フォーマットへの投資前に、メカニズムとしての実現可能性を早期に評価できるようにし、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 誘導されたシグナル伝達イベントの特異性と可逆性を定量化することで、リスク調整後の開発推進に役立てます。
実施上の検討事項
- トランスデューサー成分を最適化するためには、タンパク質工学、アプタマー設計、および酵素反応速度論に関する専門知識が必要です。
- 340 nmおよび550 nmでの速度論的吸光度測定が可能なプレートリーダーへのアクセスに依存します。
- データの比較可能性を確保するため、試薬調製およびインキュベーションプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 結合速度論や立体的な制約が異なる新しいタンパク質ペアにトランスデューサー設計を適用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- トランスデューサーの安定性、潜在的なオフターゲット相互作用、および信号飽和を避けるための慎重なタイトレーションの必要性などの実用的な制限が含まれます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
