Name: シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ 合成化学トランスデューサーを用いたタンパク質間の非自然な通信を分光光度計で追跡する手法。PDGFアプタマーとGST阻害剤を組み合わせた人工シグナル伝達システムの構築と活性制御のプロトコルを解説。

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この研究はミネルバ財団、HFSP組織、および欧州研究評議会助成金（グラント338265を開始する）によってサポートされていました。

「化学トランスデューサー」の1合成<ol><li>予備の準備<ol><li> 2 M酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA）バッファは、超純水の酢酸の114ミリリットルと400ミリリットルとトリエチルアミン278ミリリットルを混合して準備します。暗いボトルに保管してpHを7に調整し、1 Lの最終体積に水を追加します。 注：このソリューションは、年間安定です。 </li><li>超純水20ml中にアスコルビン酸の18ミリグラムを溶解することにより5mMのアスコルビン酸溶液を調製します。新鮮な溶液を使用してください。溶液を1日間安定です。 </li><li>超純水の10ミリリットルと11ミリリットル中TBTA 58mgのジメチルスルホキシド（DMSO）で銅25mgの（II）五水和物を溶解することにより10mMの銅（II）/トリス（benzyltriazolylmethyl）アミン（TBTA）溶液を調製します。二つの溶液を混ぜます。室温でそれを維持し、光から保護します。 </li></ol></li><li>結合手順<ol><li> 80μlの修飾オリゴヌクレオチドの100ナノモル（ODN-1）を溶解新鮮な超純水。 2 M TEAA20μlのはpH = 7は、アスコルビン酸の新たに作られた溶液（水中5 mM）の80μlのを追加。 </li><li> DMSOの180μlのアジド修飾されたエタクリン酸の1.5マイクロモル（574.5μgの）を溶解し、溶液に追加します。ドガ60秒間アルゴンを使用し、迅速にCu（II）/ TBTA溶液（55％中の10mM（v / v）のDMSO /水）から40μlを添加するソリューション。 </li><li>近くにしっかりと、アルゴンで再びパージし、そして一晩攪拌します。 </li><li>反応の進行状況を監視し、RP-HPLC（移動相：A）によって結合体を精製し、5％アセトニトリル、5％TEAA、90％の超純水; B）65％アセトニトリル、5％TEAA、30％超純水）24 </li></ol></li></ol> 2. PDGFによってGST活性を制御します<ol><li>予備の準備<ol><li> 8mMの最終リン酸塩濃度および広告を達成するために、超純水16.1 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBSx1）33.9 mlと混合することによってアッセイ緩​​衝液を50mlの調製DのMgCl 2の23.8 mgを5mMの最終濃度を達成します。 </li><li> 50mMトリスpH7.5の、50mMのNaClを含む緩衝液中でタンパク質を溶解することによりGST M1-1のストック溶液を調製し、1mMジチオスレイトール（DTT）、30μMの最終濃度5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 -80℃で小分けし、ストアにこのソリューションを割ります。アッセイ緩​​衝液中で、セクション2.1.5.1によると、新鮮に希釈し、氷上に保ちます。 注：溶液を、約5時間、安定であるか、または酵素活性の減少があるまで。 </li><li>以下の手順に従って基板を準備します。 <ol><li> 100mMのストック溶液の最終濃度になるように超純水325μlの還元グルタチオン（GSH）10mgを溶解します。 2.1 mMのワーキング溶液の最終濃度のためにアッセイ緩​​衝液の979μlのこのストック溶液から21μLを希釈します。 </li><li> Eの492μlの2,4-ジニトロクロロベンゼン（CDNB）10mgを溶解させます100mMのストック溶液の最終濃度までthanol。 4.32 mMのワーキング溶液の最終濃度のためにアッセイ緩​​衝液の956.8μlの原液から43.2μLを希釈します。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートでは、別の行（12ウエル）の各基板を置きます。ソリューションの迅速かつ簡単に撤退を可能にするために、各ウェルに少なくとも60μLを挿入します。光保護のためにアルミシートでプレートをカバーしています。 </li><li>アッセイ緩​​衝液中で、次のストック溶液を準備します。 <ol><li>二量体の0.6μMの最終濃度に50によってGST M1-1を希釈します。 </li><li> 30μMの原液に「化学変換器 &#39;を希釈します。 </li><li> 40μMの最終濃度にPDGFを希釈します。 </li><li> 250μMの最終濃度にPDGFアプタマーを希釈します。 </li></ol></li></ol></li><li> 「化学変換器」とPDGFの存在下でのGST活性を測定します。 <ol><li>実験手順を設定する私動態測定のためにプレートリーダーをNです。 <ol><li> 「標準プロトコル」などの新しい実験を作成します。 </li><li> 「手順」を押して、手順の設定ウィンドウを開きます。 </li><li>ウィンドウの上側のポップアップリストでは、プレートのメーカーによると「384プレート」タイプを選択します。 </li><li>左側のメニューを押し「読みます」。 </li><li>検出方法については「吸光度」を選択します。 </li><li>読み取りタイプについて「エンドポイント」を選択します。 </li><li>波長ウィンドウ上に340nmを書きます。 </li><li>右上側の「フル板」底を押して、測定されるべき十分を選択します。 </li><li>押して「OK」「読む」ウィンドウを閉じます。 </li><li>選択し、左メニューの「運動を開始」。 </li><li>実行時間10分を行います。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>私は、「読む」の行をドラッグします反応速度測定Ntoを。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「プレイ」ボタンを押してください。ダイアログボックスが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li></ol></li><li>三連の実験を行うためには、4つのサンプルに「化学変換器」とGST M1-1の3.25μlの各含む3.25μLを準備します。それぞれ、各サンプル0、1.2、2.4、またはPDGFおよび123.5、122.3、121.1の4.9μlの、またはアッセイ緩​​衝液の118.6μlに加えます。 </li><li> 10分間室温で溶液をインキュベートします。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルにサンプルの40μlのを挿入します。基質添加のためのマルチピペットの使用を可能にするためにのみ、奇数ウェル中や、同じ行にあっても、ウェル内のサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルマルチピペッターを使用して、すぐにTのそれぞれから10μLを加えます96ウェルプレート（セクション2.1.4）に予め用意した彼の基板。泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜます。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 GST速度が非常に高速であるため、基質添加および反応速度測定の開始との間の時間を最小限に抑えるようにしてください。 </li></ol></li><li> 「化学変換器」によって媒介されるGST活性化/阻害サイクル。 <ol><li> 、三連の実験を行う5つのサンプルのアッセイ緩​​衝液84.5μlを、「化学変換器」の3.25マイクロリットル、およびGST M1-1の3.25μLを含むそれぞれを調製するために。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプル2-5にPDGFの1と3.65μLをサンプリングするアッセイ緩​​衝液の3.65μLを加えます。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプル3-5に、サンプル1-2とPDGFアプタマーの3.12μlにアッセイ緩​​衝液の3.12μLを加えます。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプルにアッセイ緩​​衝液の24.4μlを添加しますサンプル4-5のPDGFの1-3と24.4μlの。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 5分間、室温で5インキュベートをサンプリングするPDGFアプタマーのサンプル1-4と7.8μlにアッセイ緩​​衝液の7.8μlを添加します。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルにサンプルを40μlを挿入します。のみ奇数または、同じ行にあってもウェルににサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルマルチピペッターを使用して、すぐにそれぞれの基板からの10μLを加える（96ウェルプレート中に予め調製しました）。泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜます。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li> tにおいて340nmで測定したODを差し引くことにより、各条件でV 0 [MOD /分]を算出= ODから0.5分、Tで340 nmで測定し= 1.5分活性化/阻害リサイクル性を評価すること。25 </li></ol></li><li>環境の変化に「化学変換器」のリアルタイム応答を評価します。 <ol> &lt;LI&gt; PDGFの添加のリアルタイム効果<ol><li>反応速度測定用のプレートリーダーでの実験手順を設定します。 </li><li>繰り返しは2.2.1.1-2.2.1.10を繰り返します。 </li><li>実行時間を3.5分にします。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>運動の測定に「読む」の行をドラッグします。 </li><li>左側のメニュー/上にプレートアウトを選択します。 </li><li>オプション &#39;プレートアウト（ダイアログなし）」を選択します。 </li><li>左メニューの「遅延」オプションを選択し、30秒を入力します。 </li><li>左側のメニュー/上にプレートアウトを選択します。 </li><li>オプション &#39;（なしダイアログ）でプレート]を選択します。 </li><li> 2.2.1.14をしかし、セクション2.2.1.11で25分の代わりに10分であることが運動を設定する - 手順2.2.1.4を繰り返すことにより、第2の運動の測定を作成します。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「ナンプラーを押してくださいY &#39;ボタンをクリックします。ダイアログボックスが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li><li> GST M1-1の1μlのとアッセイ緩​​衝液の38μlの中で「化学変換器」の1μLを混合することにより、二つのサンプルを準備します。これらの2つのウェル間の空井戸を残し、384透明ウェルプレートの2ウェルにサンプルを挿入します。 </li><li>すぐに、各基板から10μLを追加穏やかに混合し、すばやく泡を避けるために、リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始し、12チャンネルのマルチピペッターを使用しました。 </li><li>プレートは、（3.5分後）まで開いたら、すぐに、ウェルの1にPDGFの1.125μlを添加穏やかに混合し、そしてプレートは、残りの反応速度測定のためにクローズアップすることができます。 </li></ol></li><li> PDGFアプタマーを追加のリアルタイム効果<ol><li>繰り返しは2.4.1.1-2.4.1.15を繰り返します。 </li><li> GST M1-1の1μlを、1μLを混合することにより、二つのサンプルを準備します」化学変換器」、およびアッセイ緩​​衝液の36.9μlの中のPDGFの1.125μlの。これらの2つのウェル間の空井戸を残し、384透明ウェルプレートの2ウェルにサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルのマルチピペッターを使用して、迅速に、各基板から10μlを添加する気泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜて、リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li>プレートは、（1.5分後）まで開いたら、すぐに、ウェルの1にPDGFアプタマーの1.2μlを添加穏やかに混合し、プレートを残りの反応速度測定のためにクローズアップすることができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 「化学変換器」とPDGFの存在下でGSTによってJS-Kプロドラッグ活性化を測定します。 <ol><li>反応速度測定用のプレートリーダーでの実験手順を設定します。 <ol><li> 「標準プロトコル」などの新しい実験を作成します。 </li><li> 「手順」を押して、手順の設定ウィンドウを開きます。</li><li>ウィンドウの上側のポップアップリストでプレートメーカーによると「384プレート」タイプを選択します。 </li><li>左側のメニューを押し「読みます」。 </li><li>検出方法については「吸光度」を選択しました。 </li><li>読み取りタイプについて「エンドポイント」を選択します。 </li><li>波長窓に305 nmのを書きます。 </li><li>右上側の「フル板」ボタンを押して、測定されるべき十分を選択します。 </li><li>押して「OK」「読む」ウィンドウを閉じます。 </li><li>選択し、左メニューの「運動を開始」。 </li><li>実行時間10分を行います。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>運動の測定に「読む」の行をドラッグします。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「プレイ」ボタンを押してください。ダイアログBOXが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li></ol></li><li> NO産生の測定のために亜硝酸/硝酸熱量測定キットを使用します。 96ウェルプレートでは、1行に私は3番目の行に2行目に試薬、およびグリースII試薬70μlのグリースの70μLをアッセイ緩​​衝液50μlを挿入します。 </li><li>三連の実験を行うためには、4つのサンプルに「化学変換器」のそれぞれを含む4.8μLを準備します。 1をサンプリングするために、アッセイ緩​​衝液の155.2μlを添加します。 2をサンプリングするために、GST-M1-1およびアッセイ緩​​衝液の152μlに3.2μlを添加します。 3をサンプリングするために、PDGFの9.6μlのとアッセイ緩​​衝液の145.6μlを添加します。そして、4をサンプリングするために、GST-M1-1の3.2μlを、PDGFの9.6μlを、およびアッセイ緩​​衝液の142.4μlを添加します。 </li><li> 10分間室温で溶液をインキュベートします。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルに50μlのサンプルを挿入します。のみ奇数またはだけででサンプルを挿入同じ行であってもウェルは、基質添加のためのマルチピペットの使用を可能にします。 </li><li>各ウェルにJS-Kの0.54μlの（DMSO中の5mM）を追加します。 </li><li>すぐに気泡を避けるために迅速に（96ウェルプレート中に予め調製した）を、穏やかに混合GSH溶液10μLを加えると、12チャンネルマルチピペッターを使用して。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li>すぐに運動測定後、12チャンネルのマルチピペッターを使用して、事前に用意した96ウェルプレートでアッセイバッファー行に各試料から50μLを取り、すぐにそれにグリースI試薬を50μl及び50μlのを追加グリースII試薬。 RTで10分間、光から保護しながらインキュベートし、550 nmの吸光度を測定します。 注意：アッセイ緩​​衝液および試薬のボリュームがキット」プロトコルに依存しています。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

私たちは、天然タンパク質を修飾することなく、2つの自然に無関係なタンパク質、GSTとPDGFの間の人工的なコミュニケーションを誘導できる「化学トランスデューサー」の設計とテストの方法を提示しました。不自然なGST-PDGFコミュニケーションは、「化学トランスデューサー」の存在下でGSTの活性の変化を追跡し、PDGFの濃度を増加させる酵素アッセイを使用することでリアルタイムで検出できます。PDGFによるGSTの活性化の検出に加えて、これらのアッセイを使用して、競合するアプタマーによるGSTの不活性化、およびPDGFを介した抗がんプロドラッグの切断を追跡しました。オリゴヌクレオチド入力に応答することによってタンパク質の活性を制御できる他の切り替え可能なタンパク質結合剤が記載されています。26 しかしながら、本明細書に記載されているプロトコルは、天然タンパク質の存在に応答する新しいクラスのタンパク質結合剤の機能に従う手段を実証する。このようにして、タンパク質バイオマーカーによる酵素の調節をリアルタイムで検出することができ、そのようなシステムを使用してプロドラッグやGSTの他の基質を選択的に活性化する道が開かれます。</p...

シグナル伝達経路は、事実上すべての細胞プロセスにおいて重要な役割を果たし、細胞が急速に環境シグナルに応答することができます。1これらの経路は、多くの場合、細胞内酵素の活性化をもたらす細胞外受容体へのシグナル伝達分子の結合によってトリガされます。細胞内でこの信号の増幅及び伝播は酵素が可逆的に高い特異性で活性化されたタンパク質 - タンパク質相互作用のネットワークを形成するタンパク質のシグナル伝達機能によって媒介されます。これらのネットワークの調節不全は、しばしば癌の発生につながるので、薬は悪性のシグナル伝達経路を破壊するように設計されていることにより、2 &#39;癌のシグナル伝達療法」を確立する上で多くの関心が集まっています。我々は最近、不自然なシグナル伝達経路を生成する薬物の能力に依存している形質導入療法をシグナリングするための代替的なアプローチを提案しています。 <su特に、P&gt;図3は、我々は、シグナル伝達タンパク質の機能を模倣する合成薬剤を設計することによって、間接的に、細胞の機能を調節することが可能であると考えています。例えば、これらの人工的なネットワークは、プロドラッグを切断する酵素を活性化するタンパク質バイオマーカーを使用可能にすることができます。あるいは、これらのシグナル伝達タンパク質の模倣物は、治療効果が得られ、不自然な細胞シグナル伝達経路を活性化することができるかもしれません。 このアプローチの実現可能性を実証するために、我々は最近であるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を、活性化することによって抗癌プロドラッグの切断を誘発する血小板由来増殖因子（PDGF）を可能にする合成「化学変換器4 &#39; を作成しましたない、その天然の結合パートナー。この「トランスデューサー」の構造は、GSTのための二価阻害剤で修飾されている抗PDGFのDNAアプタマーで構成されています。したがって、この合成剤は、への結合部位を有する分子のファミリーに属し異なるタンパク質、二量体化の5-7のような化学誘導物質（のCID）8-10と、オリゴヌクレオチド合成分子複合体に基づいてタンパク質-結合剤のグループに。11月21日 そのようなシステムの設計の基礎となる一般的な原理は、本明細書に記載されており、合成及び従来の酵素アッセイを使用してこの「変換器」の機能を試験するための詳細なプロトコルが提供されます。この作業は、細胞内のタンパク質 - タンパク質の通信を仲介し、その結果として、人工的な細胞シグナル伝達経路を誘導するために使用することができるこのクラスの追加の「変換器」を、開発を促進することを意図しています。 図1は、不自然なタンパク質-タンパク質の通信を媒介することができる合成「化学変換器」の動作原理を説明しています。 protのための合成バインダーを統合し、この図では、「化学変換器」では、アインスIおよびII（バインダーIおよびII）は、その天然の結合相手ではないタンパク質の触媒活性Iを、トリガするタンパク質IIを可能にします。タンパク質IIの非存在下では、トランスデューサは、酵素（タンパク質I）の触媒部位に結合した （ 図1、状態II）の活性を阻害します。タンパク質IIに「トランスデューサ」の結合が、その結果の有効濃度をタンパク質I.向かってその親和性を低下させるバインダーIおよびIIタンパク質の表面（ 図1、状態III）の間の相互作用を促進します」溶液中の遊離」トランスデューサは、私は複雑で、タンパク質I（ 図1、状態IV）の再活性化にトランスデューサタンパク質の解離につながる、減少します。 （1）「トランスデューサー」はタンパク質標的のそれぞれについて具体的なバインダーを持っている必要があり、（2）相互作用betwe：まとめると、これらの手順は、効率的な「変換器」の設計の基礎となる3つの基本的な原則を強調表示しましたバインダーIIおよびタンパク質II専用私はタンパク質IIの表面と相互作用することができなければならないIおよびタンパク質I、および（3）バインダーバインダーとの間の相互作用よりも強いでなければなりません。この最後の原則は必ずしもバインダーは、単独で私はタンパク質IIに対して高い親和性と選択性を有することは必要ありません。その代わりに、それは、タンパク質の近傍に合成分子をもたらすことは、この分子とタンパク質表面との間の相互作用を促進する可能性があることを示した我々の最近の研究に基づいている。19,22,23 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> 図1：「化学トランスデューサは&#39;I（状態I）活性タンパク質に付加されている場合「化学変換器」の動作原理は 、それがバインダーIを介して、その活性部位に結合し、その活性（状態II）を阻害します。タンパク質II、但し、結合していない「化学Tの存在下でransducerは「バインダーI及びタンパク質IIの表面との間の相互作用を促進するバインダーIIを通じてタンパク質IIと相互作用します。この誘導された結合剤I-タンパク質IIの相互作用は、私は、複雑な「transducer&#39;タンパク質の解離につながるバインダーの有効濃度Iを、減少させ、タンパク質に私が再活性化（状態IV）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a>

<table><tbody><tr><td>1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>バイオラボ</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II) 五水和物</td><td>メルク・ミリポア</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>エタクリン酸</td><td>東京化学工業株式会社</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione-s-transferase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタチオン還元</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>硝酸塩/亜硝酸塩 比色分析キット</td><td>ケイマンケミカル</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>W.M.ケック財団 イェール大学の</td><td></td>バイオテクノロジー <td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>イスラエル構造プロテオミクスセンター(ワイツマン科学研究所、レホボト、イスラエル)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 カラム</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695 分離モジュール</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 カラム (2.5 &mu;M、4.6 mm以上;50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 カラム (2.5&nbsp;&mu;M、10 mm&times;50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>プレート</td><td>リーダーBioTek</td>シ<td>ナジーH4ハイブリッド</td><td></td></tr></tbody></table>

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

シグナル伝達経路は、互いに相互作用し、高い特異性で互いに活性化するシグナル伝達タンパク質の機能によって媒介されます。したがって、これらのタンパク質の機能を模倣する合成剤は、不自然なシグナル伝達ステップを生成し、その結果、細胞の機能を変化させるために使用される可能性があります。天然タンパク質間の人工的なコミュニケーションを誘導できる「化学トランスデューサー」を設計するためのガイドラインを提示します。さらに、血小板由来成長因子(PDGF)とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)という2つの無関係なタンパク質間のコミュニケーションを誘導できる特定の「トランスデューサー」を合成および試験するための詳細なプロトコルを提示します。この不自然なPDGF-GST通信を使用して抗がんプロドラッグの切断を制御する方法も示されており、このようなシステムを「人工シグナル伝達療法」で使用できる可能性を示しています。この研究は、細胞内のタンパク質間コミュニケーションを媒介し、その結果、人工細胞シグナル伝達経路を誘導するために使用できる、このクラスの追加の「トランスデューサー」の開発を促進することを目的としています。

設計、合成、およびPDGFとGSTとの間に人工的な通信を誘導することができる「化学変換器」の作用の機構は、図2に示されている。「変換器」の構造は、PDGF DNAアプタマー及びビスエタクリンアミドを統合（BEA ）、これは既知のGST阻害剤（ 図2A）である。19これらのバインダーは、それぞれ、26 nmおよび144 nMでの解離定数（K dの）で、すなわち、異なる親和性でPDGFとGSTの両方に結合する「変換器」を可能にします。また4、この設計によれば、PDGFへの結合が著しく、BEA阻害剤の効力を減少させるであろうBEAユニットおよびPDGFの表面との間の非特異的相互作用を誘導する必要があります。19,22,23 図2bは示してこのシステムの基礎となる操作機構。アクティブGSTへの「変換器」を付加すると、2 EAユニットは、同時に、この二量体酵素の両方の活性部位に結合し、その活性を...

私たちは、自然に無関係なタンパク質間のコミュニケーションを誘導できる合成の「化学トランスデューサー」を開発するためのガイドラインを提示します。さらに、成長因子が解毒酵素を活性化し、その結果、抗がんプロドラッグの切断を調節することを可能にする特定の「トランスデューサー」を合成および試験するための詳細なプロトコルが提示されます。

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

本実験の目的は、合成化学トランスデューサーによって誘導される2つのタンパク質間の非天然のコミュニケーションを分光法で追跡することです。これにより、自然界には存在しないシグナル伝達経路を実行可能な、シグナル伝達タンパク質の合成アナログを開発できる可能性を実証します。一般的な分光光度計を用いて非天然のタンパク質間コミュニケーションを追跡できる能力は、人工化学トランスデューサーの機能開発および改善に寄与し、人工シグナル伝達療法の実現に近づく一助となると考えられます。化学トランスデューサーは、血小板由来成長因子（PDGF）アプタマー、二価のエタクリニドアミドGST阻害剤、フルオロフォア、およびクエンチャーで構成されています。化学トランスデューサーの合成については、本ビデオでは実演しません。詳細はテキストプロトコルに記載されています。ここでは、化学トランスデューサーの作動原理について説明します。化学トランスデューサーは、2つのEA基が酵素の活性部位に結合することで、GSTの酵素活性を阻害します。PDGFを添加すると、PDGF化学トランスデューサー複合体が形成されます。これによりトランスデューサーとGSTの相互作用が解消され、GSTの酵素活性が回復します。続いて未修飾のPDGFアプタマーを添加することで、化学トランスデューサーが放出され、再び酵素を抑制することが可能になります。PDGFによるGST活性の制御を調べる実験を開始する前に、プレートリーダーでキネティック測定用の実験手順を設定します。標準プロトコルとして新しい実験を作成してください。Procedureを選択して、Procedure Settingsウィンドウを開きます。ウィンドウ上部のポップアップリストから、プレートメーカーに応じた384 Plate Typeを選択します。左メニューのReadを選択してください。検出方法（Detection Method）にAbsorbanceを選択します。読み取りタイプとしてEndpointを選択します。Wavelengthウィンドウに340 nanometersと入力します。Full Plateを選択し、測定するウェルを指定します。次に [OK] をクリックして Read ウィンドウを閉じます。左側のメニューから [Start Kinetic] を選択してください。Run Time を 10 分に設定します。Minimum Intervalsオプションを選択します。次に、OKをクリックしてKineticウィンドウを閉じます。Read LineをKinetic Measurementにドラッグします。「Validate」ボタンを選択し、次に「OK」ボタンを選択します。実験を保存し、「Play」ボタンを選択します。ダイアログボックスが表示されますが、キネティック測定を開始する準備が整うまで「OK」ボタンを選択しないでください。プレートリーダーの設定が完了したら、次のステップとして、化学トランスデューサーおよびPDGF存在下でのGST活性を測定するためのサンプルを調製します。4つの濃度のPDGFを3連（triplicate）でテストするため、化学トランスデューサー3.25 µLとGST M-1 3.25 µLを含むサンプルを4つ調製してください。各サンプルに、PDGFをそれぞれ0、1.2、2.4、または4.9 µL添加します。次に、各サンプルの全量が130 µLになるよう、適切な量のアッセイバッファーを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートします。10分後、各サンプルを40 µLずつ、384ウェル透明プレートのウェルに分注します。4つのサンプルのそれぞれを、同一行内の奇数ウェルまたは偶数ウェルのいずれかにのみ分注してください。これは、基質の添加にマルチピペッターを使用できるようにするためです。次に、12チャンネルマルチピペッターを使用して、あらかじめ96ウェルプレートに調製しておいた各基質を、各サンプルに10 µLずつ迅速に添加します。気泡が入らないよう、迅速かつ穏やかに混合してください。すぐにプレートをプレートリーダーに挿入し、ダイアログボックスのOKボタンを選択してキネティック測定を開始します。化学変換剤によって媒介されるGST活性化阻害サイクルを調べるため、アッセイバッファー 84.5 µL、化学変換剤 3.25 µL、およびGST M1-1 3.25 µLを含むサンプルを5つ用意する。室温で3分間インキュベートする。サンプル1に3.65 µLのアッセイバッファーを、サンプル2、3、4、5に3.65 µLのPDGFを添加します。室温で3分間インキュベートします。サンプル1と2に3.12 µLのアッセイバッファーを、サンプル3、4、5に3.12 µLのPDGFアプタマーを添加します。室温で3分間インキュベートします。サンプル1、2、3に24.4 µLのアッセイバッファーを添加します。また、サンプル4と5には24.4 µLのPDGFを添加します。室温で3分間インキュベートする。サンプル1から4に7.8 µLのアッセイバッファーを、サンプル5に7.8 µLのPDGFアプタマーを加える。室温で5分間インキュベートする。サンプルを384ウェル透明プレートに移します。実験を3連（トリプリケート）で実施し、サンプルに基質を迅速に添加します。プレートをリーダーにセットし、キネティック測定を開始します。このアッセイを開始するために、プロトコルの本文に記載されている通り、プレートリーダーでキネティック測定の実験手順を設定します。384ウェル透明プレートの2つのウェルに、2つのサンプルを調製します。各ウェルにおいて、1 µLのGST M1-1と1 µLの化学変換器を、38 µLのアッセイバッファー中で混合します。2つのウェルの間に空のウェルを1つ設けます。12チャンネルマルチピペッターを使用して、各ウェルに10 µLの基質を迅速に加えます。そして、気泡が入らないよう、迅速に緩やかに混ぜ合わせます。直ちにプレートをリーダーに挿入し、キネティック測定を開始します。3.5分後にプレートリーダーが開いたら、速やかに1.125 µLのPDGFをウェルの1つに加え、静かに混ぜてから、残りのキネティック測定を行うためにプレートをリーダーに戻します。本実験のサンプルを準備する前に、プロトコルの本文に従い、プレートリーダーでキネティック測定のための実験手順を設定しておいてください。一酸化窒素の生成量を測定するために、亜硝酸塩/硝酸塩比色定量キットを使用します。96ウェルプレートの1行目の各ウェルに、アッセイバッファーを50 µLずつ分注します。2行目の各ウェルには、Griess One Reagentを70 µLずつ分注します。そして、3行目の各ウェルに70 µLのGriess Two Reagentを加えます。化学変換剤を4.8 µLずつ含むサンプルを4つ用意します。サンプル1には、155.2 µLのアッセイバッファーを加えます。サンプル2には、3.2 µLのGST M1-1と152 µLのアッセイバッファーを添加します。サンプル3には、9.6 µLのPDGFと145.6 µLのアッセイバッファーを添加します。そしてサンプル4には、3.2 µLのGST M1-1、9.6 µLのPDGF、および142.4 µLのアッセイバッファーを添加します。サンプルを室温で10分間インキュベートします。384ウェル透明プレートに、各ウェルあたり50 µLのサンプルを分注し、n=3で実験を行います。基質の添加にマルチピペットを使用できるよう、サンプルは同一行の奇数番目または偶数番目のウェルのみに分注してください。各サンプルに0.54 µLのJS-Kプロドラッグを添加します。続いて、各サンプルに10 µLのグルタチオン溶液を速やかに添加し、気泡が入らないよう静かに、かつ迅速に混合します。プレートをリーダーにセットし、キネティック測定を開始します。キネティック測定の直後に、各サンプルの50 µLを、アッセイバッファーが入った96ウェルプレートの1行目の各ウェルに分注します。次に、プレートの2行目の各ウェルから50 µLを、1行目の各ウェルに転送します。同様に、プレートの3行目の各ウェルから50 µLを、1行目の各ウェルに転送します。室温で10分間、遮光してインキュベートする。その後、550 nmで吸光度を測定する。化学トランスデューサーを用いない場合と用いた場合でGST活性を測定した結果、化学トランスデューサーがGST活性を抑制することが示された。GST-化学トランスデューサー複合体にPDGFを段階的に濃度を上げて添加することで、GSTが再活性化されます。GST-化学トランスデューサー複合体にPDGFおよび未修飾のPDGFアプタマーを順次添加したところ、PDGFとGST間の通信が可逆的であることが明らかになりました。GST-トランスデューサー複合体にPDGFを添加すると、基質の添加から3.5分後にGST活性の急速な上昇が認められました。GST、PDGF、および化学トランスデューサーの混合液にPDGFアプタマーを添加すると、GST活性の低下が認められました。これらの結果は、本システムが環境の変化にリアルタイムで反応することを示しています。続いて、本システムによるプロドラッグ活性化の制御能を、GSTによって活性化され毒性のある一酸化窒素を放出する抗がんプロドラッグであるJS-Kを用いて検討しました。化学変換器にJS-Kを添加し、GSTとPDGFの異なる組み合わせで放出された一酸化窒素量を測定した結果、GSTとPDGFの両方が存在する場合にのみJS-Kが活性化されることが確認されました。以上の結果は、合成剤を用いることで、本来の酵素パートナーではないグルタチオン-S-トランスフェラーゼの触媒活性を成長因子によって誘発できることを示しています。したがって、この種のバイオミメティクスを将来的に利用することで、環境信号に対する細胞の応答を変化させたり、細胞に新しい特性を付与したりすることが可能になると考えられます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々...

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。...

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。...

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。...

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

ヒト僧帽弁のタンパク質組成は、未分化であり、その分析は細胞密度が低く、したがって低タンパク質生合成によって複雑であるため、まだ未知である。この研究は、僧帽弁プロテオームの分析のためにタンパク質を効率的に抽出するためのプロトコールを提供する。...

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1...

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

学ぶ 合成化学トランスデューサーを用いたタンパク質間の非自然な通信を分光光度計で追跡する手法。PDGFアプタマーとGST阻害剤を組み合わせた人工シグナル伝達システムの構築と活性制御のプロトコルを解説。

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

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