非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

このプロトコルの全体的な目標は、精製されたリポタンパク質上の小さなノンコーディングRNAを定量することです。このプロトコルは、健康や疾患におけるリポタンパク質small RNAシグネチャの定義や、疾患のバイオマーカーとしてのリポタンパク質small RNAの進歩、または細胞間メッセージなど、リポタンパク質分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高純度のリポタンパク質を解析して、疾患や実験条件における小さなRNAの変化を検出できることです。

この技術の意味は、細胞外RNAが新しいクラスの疾患バイオマーカーであり、リポタンパク質の小RNAが将来の研究における薬物標的としてエキサイティングな可能性を秘めているため、心血管代謝疾患の治療にまで及びます。この方法はHDL低分子RNA用に設計されていますが、超低密度および低密度のリポタンパク質低分子RNAにも適応できます。一般に、この分析法に不慣れな方は、密度勾配超遠心分離用のサンプル調製に関する適切な機器や専門知識がないため、苦労する可能性があります。

このプロトコールは、高純度HDL上のsmall RNAを、ハイスループットシーケンシングまたはリアルタイムPCRを使用して定量するために、互いにリンクされた確立された方法で構成されています。このビデオでは、HDLの浄化を扱っています。このプロトコルは、私のアシスタントであるエヴァン・シャダリによって実演されます。

まず、90ミリリットルの血漿に90マイクロリットルの100倍酸化防止剤を追加します。次に、血漿9ミリリットルごとに0.251グラムの臭化カリウムを追加して、プラズマの密度を1.025グラム/ミリリットルに調整します。すべての塩が溶解するまで、プラズマを室温で揺さ

次に、プラズマを超遠心チューブに移し、上部に気泡の層があることを確認します。プラズマの下に空気が閉じ込められていてはなりません。次に、先端から1センチのところに90度曲げて、面取り面を上にして18ゲージの針を準備します。

次に、シリンジと曲げた針を使用して、3ミリリットルのオーバーレイ溶液1番をプラズマに慎重に置きます。表面の気泡の大部分を取り除き、半月板とチューブの端の間に2〜3ミリメートルを残します。次に、チューブをSW 40 Tiバケットに慎重に入れます。

各バケツとキャップの重量を量り、遠心分離機の反対側の位置を占めるバケツのバランスを正確に取ります。次に、ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で274、Gの400倍で24時間運転し、ブレークを中間値4に設定します。翌日、ローターからバケツを慎重に取り外し、バケツからチューブを持ち上げます。

次に、シリンジと曲げた針を使用して、オーバーレイの最上層から2ミリリットルをゆっくりと取り出します。これは VLDL IDL の分数です。次に、残りの7ミリリットルのプラズマを収集し、15ミリリットルの円錐管に移します。

プラズマの容量を最大9ミリリットルにするには、オーバーレイソリューション番号2を追加します。次に、0.746グラムの臭化カリウムを追加して、密度を1.080グラム/ミリリットルに調整します。次に、サンプルを静かに揺らして塩を溶かしますが、これには約20分かかります。

次に、サンプルを空気を閉じ込めずに超遠心チューブに移します。上部に泡の層が作られていることを確認してください。曲げた針を使用して、3ミリリットルのオーバーレイソリューション番号3を慎重に重ねます。

次に、気泡の大部分を取り除き、チューブをSW 40 Tiバケットに慎重にロードします。バランスを取り、前述のように24時間回転させます。翌日、曲げた針を使用して、オーバーレイの最上層から2ミリリットルを慎重に取り除きます。

これがLDL分数です。次に、残りのサンプルを新しい15ミリリットルのコニカルチューブに移し、溶液番号4で容量を最大9ミリリットルにします。次に、約3.33グラムの臭化カリウムを追加し、塩が溶解するまでサンプルを揺さぶることにより、密度を1ミリリットルあたり1.33グラムに調整します。

次に、サンプルを超遠心チューブに移し、5番の溶液を3ミリリットル以上慎重に過剰に含みます。次に、前と同じようにサンプルを超遠心分離しますが、48時間行います。2日後、シリンジと曲げた針を使用して、オーバーレイの上部2ミリリットルを収集します。

これがHDL分数です。高塩分溶液を除去するには、HDL画分を分子量10, 000のカットオフで湿式透析スリーブに移します。次に、1リットルのXPBSで24時間透析し、摂氏4度で穏やかに攪拌します。

PBS溶液を24時間で3回交換します。その後、BCA法を使用してHDL画分のタンパク質濃度を決定します。細胞外小胞(エクソソーム)は、小さなHDLと同様の密度を持っているため、HDLと同じ密度分率で存在する可能性があります。

したがって、HDLフラクションはFPLCによるさらなる精製が必要です。FPLCを使用する直前に、500マイクロリットルの溶液中に1.2ミリグラムのDGUC HDLフラクションを0.22ミクロンの遠心フィルターに通します。ろ過したサンプルをFDLC注入シリンジに集め、気泡が閉じ込められないようにします。

次に、FPLCの流量を0.3ミリリットル/分、圧力制限を2.6メガパスカルに設定します。次に、カラムを 0.2 カラム容量のバッファーで平衡化します。次に、3ミリリットルのバッファーを含むサンプルをFPLC装置に注入し、実行を開始します。

1.5ミリリットルのフラクションを集めて、合計72個のフラクションを集めます。DGUC HDLに対応するFPLC画分を同定するには、製造元の指示に従って比色キットを使用して総コレステロール値を測定します。DGUC HDLを含む6〜7個のFPLCフラクションが見つかることを期待してください。

フラクションを含むすべてのHDLをプールし、摂氏4度で1時間、またはHDL濃縮物が約100マイクロリットルになるまで、Gの4,000倍で10キロダルトンのカットオフ遠心フィルターを使用してそれらを濃縮します。次に、HDL濃縮物を採取し、BCA法を用いてタンパク質を定量します。その後、同量のHDL総タンパク質を使用してRNAを単離します。

ヒト血漿は、密度勾配分離を使用せずにFPLCによって分画されました。6つの画分がHDLに対応し、6つの画分が非常に低密度のリポタンパク質に対応していました。脂質は黒、コレステロールは赤、タンパク質は青で、すべて比色キットで測定しました。

これに対し、FPLCの前に密度勾配超遠心分離を行ったところ、脂質タンパク質とコレステロールがほぼ独占的にHDL画分中に検出されました。4人の健康な血漿ドナーから採取したHDLから、全RNAを単離し、シングルリード50塩基対プロトコルを使用してシーケンシングしました。正規化されたリードの分布は、約21ヌクレオチドと34ヌクレオチドの低分子RNAの濃縮を示しています。

ライブラリーの分析では、リードの38%がマイクロRNAであり、37%がTRNAに由来することが示されました。その他のRNA、リボソームRNA、small RNA、small nucleolr RNA、およびlong non-coding RNAも存在しました。このテクニックを習得すると、適切に行えば、10日以内に実行できます。

この手順を試行する際には、PCRやノーザンブロッティングなどの別の方法によるハイスループットシーケンシングで観察されたHDLスモールRNAの変化を検証することを忘れないでください。この手順に続いて、RNA単離ステップやシーケンシング準備ステップで、HDLコレステロールe-flux受容能やHDL抗炎症SAなどの他の方法を実行して、HDLスモールRNAの変化とHDL機能の相関関係を決定するなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、脂質とリポタンパク質の分野の研究者が、非コレステロール貨物、特に核酸と代謝性疾患、例えば高コレステロール血症や糖尿病を研究する道を開きました。

また、人間の血漿を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、血液媒介病原体について適切なトレーニングを受け、この技術を実行する際には適切な個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。