Name: 非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ高密度リポタンパク質からの非コード小型RNA定量化法。密度勾配超遠心分離とFPLCを用いて高純度HDLを精製し、疾患バイオマーカーとしての可能性を探索する技術です。

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この作業は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所からK.C.V. HL128996、HL113039、およびHL116263に対する賞によって支援されました。この研究は、アメリカ心臓協会からK.C.V. CSA2066001、D.L.M POST26630003、およびRMA POST25710170への賞によっても支援されました。

1. HDL精製（〜5.5日） <ol><li>密度勾配超遠心分離（DGUC、〜5日） <ol><li>新鮮な静脈血から分離された血漿の9 mLに100倍の抗酸化剤の90μLを追加します。 </li><li>ステップ1.1.1（0.0278グラム/ mLの臭化カリウム血漿）からの血漿の9 mLに0.251グラムのKBrを追加することによって、1.025グラム/ mLに1.006グラム/ mLのKBrを持つプラズマ密度を調整します。すべての塩は室温で溶解し、チューブを超遠心し、すべての気泡がトップに上昇を確認するために転送されるまで、プラズマをロック。 </li><li>ベンド先端から90℃で1センチメートル18-G針の先端は、ベベル側が上を向きます。シリンジと18ゲージの針を使用して、慎重にプラズマ（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃1の3ミリリットルを配置します。 注：曲がった針は、すべてのVLDL / IDL、LDLを確保し、HDLがオーバーレイと混合せずに削除されます。 </li><li>チューブの上部とcarefuにメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2を残して、上部の気泡の大部分を削除しますLLY SW-40Tiバケットにチューブを配置します。 </li><li>バランスに（キャップ​​付き）各バケットを計量し、正反対のバケット（バケット+キャップ）とのバランス：第6位に＃1〜＃4、＃5から＃2、＃3。 注：これらのバケットは、常にバランスと一致する必要があります。 </li><li> （材料のリスト）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。 </li><li>慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。 </li><li>慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除します。これは、4℃で保存することができるVLDL / IDL画分となり °Cまたは-80 °C。 </li><li> VLDL / IDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りの7ミリリットルを収集し、15 mLコニカルチューブに入れてください。オーバーレイ溶液＃2（ 表1）で9 mLに試料の体積を起動します。 </li><li>使用してのKBrと1.080グラム/ mLに1.025グラム/ mLのサンプル密度を調整します9 mLのサンプルまたは0.0828グラムで約0.746グラムのKBr /サンプルのmLでのKBr。すべてのKBr（約20分）に溶解し、確実に気泡がトップに上昇しながら、チューブを超遠心に転送されるまで、慎重にサンプルを揺すります。 </li><li>注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃3の3ミリリットルを配置します。管の上部にメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2のままにしておきます。 </li><li>チューブの上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。 </li><li>バランスに（キャップ​​付き）各バケットを計量し、正確1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。 </li><li> （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。 </li><li>慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。 </li><li>慎重に注射器を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除してあることntの針。これは、4℃で保存することができるLDL画分となり °Cまたは-80 °C。 </li><li> LDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りのおおよその7ミリリットルを収集し、新しい15 mLコニカルチューブに入れてください。 1.080グラム/ mLの溶液＃4（ 表1）で9 mlまでの試料（血漿）の音量を持参。 </li><li> 1.30グラムのサンプルの各mLのための3.33 9 mLのサンプル（血漿）中のグラムとKBrまたは0.37グラムのKBrを使用してのKBrと/ mLに1.080グラム/ mLのサンプル密度を調整します。ロックまたはわずかにすべてのKBr（塩）が溶解するまでサンプルを攪拌し、管を超遠心する転送します。 </li><li>注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃5の3ミリリットルを配置します。 </li><li>管の上部にメニスカスから2〜3ミリのスペースを残して、管の上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。 </li><li> （各バケットを計量バランス上のキャップ）、そして正確に1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。 </li><li> （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4ブレーキと4℃で48時間274400×gで遠心分離します。 </li><li>慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。 </li><li>慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から約2ミリリットルを削除します。これは、4℃または-80℃で保存することができるHDL画分です。 注：DGUC HDL後は、高塩溶液を除去するために透析することができます。 </li><li>密閉された透析スリーブ（10,000 MWカットオフ）に集めHDL画分を配置し、1 L 1×PBS中で一晩透析、透析します。変更透析緩衝液（1×PBS）24時間かけて3回。磁気撹拌棒を含むPBSの穏やかな摂動は、透析が向上します。 </li><li> BCA法8を使用してDGUC-HDLのタンパク質濃度を決定します。 </li></ol></li><li> 高速タンパク質液体CHROグラフィー（FPLC）またはサイズ排除クロマトグラフィー（〜6時間） <ol><li> 0.22μmのマイクロ遠心フィルターを通して500μLでDGUC-HDL（総タンパク質）の1.2 mgのフィルタ注入する直前に、（材料のリストを参照してください）。 注：0.22μmのフィルターの前に0.45μmのマイクロ遠心フィルターを通してDGUC-HDLサンプルの追加のフィルタリングは、いくつかのサンプルのために必要な場合があります。 </li><li>フィルタリングDGUC-HDLサンプルを収集し、FPLC（記入）注射器、およびFPLCに注入する前に、シリンジ内に気泡がないことを確認をロードします。 </li><li> 2.6 MPaの圧力限界で0.3 ml /分のFPLC流量を設定します。注射をサンプリングする前に、緩衝液の0.2カラム容量（約15mL）でカラムを平衡化します。 FPLC（注入ループ）機器内にバッファの3 mLのサンプルを注入し、実行を開始します。 72画分の合計1.5 mL画分を収集します。 </li></ol></li></ol> 2.高スループット小さなRNAシーケンシング（sRNAseq、〜9日） <ol><li> RNA単離（〜1日） <ol><li>製造業者の説明書に従って比色分析キットを用いて総コレステロールレベルを測定することによりDGUC-HDLに相当するFPLC画分を同定します。 DGUC-HDLを含む7 FPLC画分 - このFPLCセットアップを使用して、6を見つけることを期待しています。 </li><li> DGUC-HDL FPLC画分からすべてのボリューム（約8 -1 0 mLのプール1.45 mLの画分の容積）を収集し、使用して集中10kDaのMWカットオフ遠心分離フィルターユニット1時間4000×gで4℃、またはHDL濃縮まで約100μLです。 </li><li> HDL濃縮物を収集し、BCA法8を用いて、HDL、総タンパク質濃度を定量します。 </li><li>セット内の各サンプルから小分けしすることができ、最大1 mgのHDL総タンパク質の最高濃度を、決定します。例えば、各試料のHDL、総タンパク質の同量のRNAを単離します。 </li><li>使用して、RNAの単離を行います改良プロトコール （材料のリストを参照してください）。 <ol><li> 1分間のサンプルと渦（材料のリストを参照してください）フェノール溶解試薬の10倍のボリュームを追加します。 </li><li> 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li>クロロホルム（ステップ2.1.5.1で使用されるフェノール溶解試薬の体積の20％）を加え、15秒間激しく振ります。 </li><li> 3分 - 2室温でインキュベートします。 </li><li>冷却遠心機で4℃、12,000×gで15分間遠心。 </li><li>間期を避け、新たなチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> 1分間水相とボルテックスに100％エタノールの1.5倍体積を加えます。 </li><li>少なくとも1時間または一晩-80℃で保存サンプル。 </li><li>提供ミニカラムを用いてRNA単離プロトコールを続行します。 </li><li> 30μLのRNaseフリーのH 2 Oで溶出まず、フリットに直接2分間低速（2,000×gで）でスピンをH 2 Oの15μLを追加し、その後、1分間高速（最大）で回転します。 H 2 Oの追加の15μLと、この手順を繰り返します</li></ol></li><li>直ちに-80℃でのsRNAライブラリ生成またはストアに進みます。 </li></ol></li><li> ライブラリーの生成（〜6時間） <ol><li>以下に詳述するように、PCR増幅に1修正を加えて、製造業者の指示に従って、のsRNAライブラリー生成キットのプロトコルを使用してのsRNA cDNAライブラリーを準備します。 <ol><li> 0.5μLのDNase / RNaseフリーのH 2 Oを含む氷上でPCRマスターミックスを準備し、15μLのPCRミックス（PML）と1μLRNA PCRプライマー（RP1）サンプル毎（エラーをピペッティングするための追加の10％を含みます）。 </li><li>各（cDNA）をサンプルにPCRミックスの16.5μLを追加します。 </li><li>多重化のために各サンプルにインデックス/バーコード番号を割り当て、サンプルに（対応する数）1μLのPCRプライマーのインデックスを追加します。 </li><li>マイクロフュージを使用してクイックスピンを実行します。 注：合計ボリュームがすべき今サンプル当たり30μLです。 </li><li> 表2および3に詳述するようにPCR増幅のためのサイクル条件を行います。 </li></ol></li></ol></li><li> サイズアダプタを削除するためのsRNAライブラリを選択します。アダプタ（〜1.5時間） <ol><li>ターゲット：156 bpの、スタート：135 bpの、エンド：177 bpの、範囲旗：ブロード以下のサイズのパラメータを持つあたり、製造元の指示として自動DNAサイズセレクタを使用してライブラリのサイズ選択を行います。 </li></ol></li><li> DNAクリーンアップ（〜0.5時間） <ol><li>製造元の指示に従って、サイズ選択のsRNAのcDNAをクリーンアップします。 </li><li>クリーン溶出し、2×7μLのDNase / RNaseフリーのH 2 OでのsRNAするcDNAを濃縮します</li></ol></li><li> sRNA cDNAライブラリーの収量と品質（〜1時間）を定量化し、評価します <ol><li> manufactあたりとしてバイオアナライザー（材料のリスト）上に高感度DNAチップを用いたsRNAのcDNAライブラリーの品質と大きさを評価しますurerの指示。 </li><li>製造業者の指示に従って、高感度DNA分析（材料のリスト）を使用して、個々のsRNA cDNAライブラリーの濃度を定量します。 注：これは、可能な場合は、別のインデックスを持つすべてのサンプルがフローセルの同じレーン上で実行することが推奨されています。複数のレーンが必要な場合、適切ケースおよびコントロールサンプルを混ぜます。 </li></ol></li><li> ハイスループットのsRNAシーケンシング（〜7日） <ol><li>プール個人が等モル濃度に基づいてのsRNAライブラリのインデックスを作成しました。 </li><li>画面は、バイオアナライザー上で高感度DNAチップを用いて、品質のsRNAライブラリをプールし、2.5.1のようにライブラリーDNA濃度を決定 - 2.5.2。 </li><li>製造業者の説明書（材料のリスト）に従ってシーケンシングライブラリーのqPCR定量キットを使用して適切な配列決定の深さを確保するために、アダプタコンテンツの定量的PCR（定量PCR）を行います。 </li><li>単一の読み取りを使用してシークエンシングを行い、50 B25 Mは、製造業者の指示に従って、/サンプルを読み取り - Pプロトコルは、約20の深さに到達します。 </li></ol></li></ol> 3.データ解析（〜1日） <ol><li>逆多重化されたサンプルの前処理生FASTQファイル（材料のリスト）に、ユーザーガイドの指示に従って、bcl2fastq2を使用してください。 </li><li>使用Cutadaptアダプタ9をトリミングして削除するには、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、長さ&lt;16ヌクレオチド（NTS）を読み出します。 </li><li>ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、NGSPERLの枠組みの中でremoveSequenceInFastq機能を使用して、アダプタのキャリーオーバー（CTACAGTCCGACGATC）：ストップ・ソリューション・シーケンス（CCACGTTCCCGTGG STP）を含む、のsRNAライブラリに存在する汚染配列を除去。 </li><li>ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、FastQCは定量的科学研究センター（CQS）ツールを使用して、品質管理メトリックを実行します。 </li><li> （読み取り、「同一」崩壊redundaの非冗長リストを生成読み込み）とユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、CQSToolsを使ってレコードコピー数のnt。 </li><li> 、ユーザーガイド当たりの命令（材料のリスト）として：整列は1ミスマッチ（-a -m 100 --best --strata -v 1オプション）を可能にするBowtie1.1.2を用いて、ヒトのゲノムに読み込みます。 </li><li>アライメント、カウントを読んで実行し、ユーザーガイドの指示に従って、NGSPERLを使用して集計作業をもたらします。 </li><li>スプレッドシートファイルにエクスポートカウントテーブルを変換します。 </li><li>ノーマライズは、そのクラスの読み込み（ 例えば、miRNAの総数は読み込み）やパーがmiRNA（RPMM）にマッピング読み込みとして信号を報告総数に対する特定のクラス（ 例えば、miRNAの）の読み取り。 （ 例えば 、RPMM =（miRNAののmiR-X /総＃読み取り）* 1,000,000）。 </li><li>低レベルと高レベルの差のためにソフトウェアに一般的な単一色の技術としてカウントテーブルを正規化した入力は、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）ごとに分析しています。 注：現在、十分に特徴付けられたハウスキーピング遺伝子がある/ SRNHDL-のsRNAについて。スパイクインコントロールを使用することができるが、問題となり得ます。総タンパク質入力またはボリュームをHDLへ正規化すると、お勧めします。最も重要なことは、リアルタイムPCRまたは定量的PCRを用いたmiRNAとsRNAsを定量化するために様々な戦略の一つにより配列決定の結果を検証することをお勧めします。 </li></ol>

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<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。それにもかかわらず、高品質のRNAの分析は、正常アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトまたはマウス血漿のわずか80μLから精製したHDLで完了することができます。しかし、より大きな出発プラズマボリュームがここに提示される方法を使用して、より良いデータを生成します。サンプル処理及び抽出方法が劇的なmiRNA /のsRNAの品質と歩留まりを変更することができます。抗凝固剤の使用は、血漿採取のために不可欠ながら、おそらく下流の抽出に影響を与えます。例えば、ヘパリンは、容易にRNA抽出14,15の間に除去されず、PCR 16-18において利用下流の酵素を阻害することができます。また、第EREは、クエン酸ナトリ...

細胞外の非コード小型RNA（sRNAs）疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA（miRNAを）です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA（tRNAの由来sRNAs、TDR）、小核のRNA（のsRNA由来sRNAs、sndRNA）、小核小体のRNA（のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの）、リボソームRNA（rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように）、YのRNA（YDR）、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞（EV）、リポタンパク質、および/または細胞外リボ核タンパク質複合体との会合を通じてのRNaseから保護されています。 以前、我々は、リポタンパク質、即ち、高密度リポタンパク質（HDL）、血漿7における搬送miRNAを報告しました。この研究では、HDLは、連続密度勾配超遠心法（DGUC）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、FPLC）、およびアフィニティークロマトグラフィー（抗アポリポタンパク質AI（アポA-I）免疫沈降を用いて単離しました）7。リアルタイムPCRベースの低密度アレイと個々のmiRNAアッセイの両方を使用して、miRNAレベルは、HDLで定量治癒から単離されましたなたと高コレステロール血症の被験者7。このアプローチを用いて、miRNAをプロファイルし、高純度のHDL製剤における特定のmiRNAを定量することができました。 2011年以来、私たちは、アフィニティークロマトグラフィーは、HDLの純度を高めているが、抗体の飽和が大幅に収量を制限し、コスト高であることができると判断しました。現在、我々のプロトコルは、ダウンストリームRNA単離とのsRNAの定量化のために高品質のHDLサンプルを生成FPLC、続いDGUCの二段階の順次タンデム方式をお勧めします。近年の例えば sRNAsのハイスループットシークエンシング（sRNAseq）、の進歩、miRNAは、および他の非のmiRNAのsRNAクラスの意識向上に、sRNAseqは、現在の最先端のmiRNAおよびのsRNAプロファイリングです。このように、我々のプロトコルは、定量化miRNAおよびsRNAseqを使用して、HDLサンプル上の他のsRNAsをお勧めします。それにもかかわらず、HDLから単離した全RNAは、個々のmiRNAと他のsRNAsを定量またはリアルタイムPCR aを用いsRNAseq結果を検証するために使用することができますpproaches。ここでは、具体的に収集、精製、定量化、データ分析、および高純度のHDL-sRNAsの検証のためのプロトコルについて説明します。 この論文の全体的な目標は、ヒト血漿から分離された高純度のHDLでのsRNA定量化の実現可能性とプロセスを実証することです。

<table><tbody><tr><td>超遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A99839</td><td>オプティマ XPN-80</td></tr><tr><td>超遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA ピュア FPLC システム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC スーパーデックス 200 増加カラム インライン</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>シナジーマックス</td><td>バイオテック インスツルメンツ</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (USA Scientificから購入)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>高感度DNAアッセイ</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシングライブラリ qPCR 定量キット</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>超透明遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>臭化カリウム</td><td>フィッシャーケミカルズ</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心フィルター 0.45 & マイクロ;m</td><td>ミリポア</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心フィルター 0.22 & マイクロ;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol colormetric kit</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10,000 m.w. カットオフ遠心分離フィルター</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>Fisher を通じて購入</td></tr><tr><td>microRNA RTキット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4366597</td><td>1000反応用</td></tr><tr><td>PCRマスターミックス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4440041</td><td>50mLボトル</td></tr><tr><td>ピアスBCAキット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>クリーン&コンセントレーターキット</td><td>ザイモ</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボ</td><td>132118</td><td>フィッシャーから購入</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

非コード小型rna定量化のための高密度リポタンパク質の単離

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

小さな非コードRNA（のsRNA）の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体（ 例えば、血漿）、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質（HDL）、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA（miRNAの）の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離（DGUC）と高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。

このプロトコルは、ハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCR（ 図1）により、高純度HDL上のsRNAsの定量化を可能にするために一緒にリンクされている確立された方法のシリーズです。このプロトコルの実現可能性と影響を実証するために、HDLは、タンデムDGUCおよびFPLCの方法によって、ヒト血漿から精製しました。 HDL（コレステロール分布による）に対応する収集FPLC画分を濃縮し、全RNAをHDL 1mgの（全タンパク質）から単離しました。 sRNAライブラリは、n = 4健康なヒト被験者から収集されたHDLで生成されました。全てのヒト血液/血漿サンプルは、アクティブな治験審査委員会プロトコル（＃070416）の下で収集した、医学のバンダービルト大学によって承認されたヒト被験者はインフォームドコンセントに登録しました。準備のsRNAライブラリは、高度なゲノム（VANTAGE）DNA配列決定センターとデータ分析を行ったためヴァンダービルト・テクノロジーズで配列決定しました社内のパイプラインを使用して。データの視覚化は、ソフト...

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

本プロトコルの全体的な目的は、精製されたリポタンパク質上の低分子非コードRNAを定量化することです。本プロトコルは、健康時および疾患時におけるリポタンパク質低分子RNAシグネチャーの定義や、疾患バイオマーカーまたは細胞間メッセージとしてのリポタンパク質低分子RNAの活用など、リポタンパク質分野における重要な疑問の解決に役立ちます。本手法の主な利点は、極めて純度の高いリポタンパク質を用いて、疾患や実験条件下での低分子RNAの変化を分析できる点にあります。この手法の意義は心代謝疾患の治療にまで及びます。なぜなら、細胞外RNAは新しいクラスの疾患バイオマーカーであり、リポ蛋白小分子RNAは今後の研究において薬剤標的としての大きな可能性を秘めているからです。本手法はHDL小分子RNA向けに設計されていますが、超低密度リポ蛋白および低密度リポ蛋白の小分子RNAにも適応可能です。一般的に、密度勾配超遠心分離のための適切な設備やサンプル調製の専門知識が不足している場合、この手法を初めて行う方は困難を感じる可能性があります。このプロトコルは、ハイスループットシーケンシングまたはリアルタイムPCRを用いて、高純度HDL上の小型RNAを定量するために確立された手法を組み合わせたものです。本ビデオでは、HDLの精製について解説します。このプロトコルの実演は、アシスタントのEvan Shadariが行います。まず、9 mLの血漿に100x抗酸化剤を90 µL加えます。次に、血漿9 mLにつき0.251 gの臭化カリウムを添加し、血漿の密度を1.025 g/mLに調整します。すべての塩が溶解するまで、室温で血漿をロッキングミックスします。次に、血漿を超遠心管に移し、上部に気泡の層ができるようにします。血漿の下に空気が閉じ込められていないことを確認してください。続いて、18ゲージの針の先端から1 cmのところに90度の曲げを加え、斜面（ベベル）を上に向けて準備します。次に、シリンジと曲げ針を用いて、オーバーレイ溶液1を3 mL、血漿の上に慎重に加えます。表面にある気泡の大部分を取り除き、液面（メニスカス）とチューブの縁との間に2〜3 mmの間隔を空けます。その後、チューブをSW 40 Tiバケットに慎重にセットします。キャップを付けた状態で各バケットの重量を量り、遠心機内で対向する位置に配置するバケット同士のバランスを正確に調整します。次に、ローターを超遠心機にセットし、4 °Cで274,400 ×gにて24時間運転します。その際、ブレーキ設定は中間値の4に設定してください。翌日、ローターからバケットを慎重に取り出し、バケットからチューブを引き上げます。次に、シリンジと曲がり針を用いて、オーバーレイの上層から2 mLをゆっくりと採取します。これがVLDL IDL分画です。その後、残りの7 mLの血漿を回収し、15 mLコニカルチューブに移します。オーバーレイ溶液2を加え、血漿の容量を9 mLにします。次に、0.746 gの臭化カリウムを加えて、密度を1.080 g/mLに調整します。その後、サンプルを緩やかに揺らして塩を溶解させます。これには約20分かかります。次に、気泡が入らないようにサンプルを超遠心管に転送します。上部に気泡の層ができないようにしてください。曲げ針を用いて、3 mLのオーバーレイ溶液3を注意深く重層します。次に、気泡の大部分を取り除き、チューブをSW 40 Tiバケットに注意深く装填します。バランスを調整し、前述の手順に従って24時間遠心分離を行います。翌日、曲げ針を用いてオーバーレイの上層から2 mLを慎重に採取します。これがLDL画分です。次に、残りのサンプルを新しい15 mLコニカルチューブに移し、溶液4を加えて液量を9 mLにします。ここで、約3.33 gの臭化カリウムを加え、塩が溶解するまでサンプルをロッキングして、密度を1.30 g/mLに調整します。次に、サンプルを超遠心管に移し、3 mLの溶液5を慎重に上層に加えます。その後、前と同様にサンプルを超遠心分離しますが、今回は48時間行います。2日後、シリンジと曲げ針を用いて、上層の2 mLを回収します。これがHDL分画となります。高塩濃度溶液を除去するために、HDL分画を分画分子量10,000の濡れた透析スリーブに移します。その後、4°Cで緩やかに撹拌しながら、1 Lの1 XPBS中で24時間透析を行います。24時間の間に、PBS溶液を3回交換します。その後、BCA法を用いてHDL画分のタンパク質濃度を測定します。細胞外小胞（エクソソーム）は小型HDLと同程度の密度を持つため、HDLと同じ密度画分に存在する可能性があります。したがって、HDL画分はFPLCによるさらなる精製が必要です。FPLCを使用する直前に、500 µLの溶液に溶解した1.2 mgのDGUC HDL画分を0.22 µmの遠心フィルターに通します。ろ過したサンプルをFPLC注入用シリンジに回収し、気泡が混入しないように注意してください。次に、FPLCの流速を0.3 milliliters per minuteに設定し、圧力上限を2.6 megapascalsに設定します。その後、0.2カラムボリュームのバッファーでカラムを平衡化させます。続いて、3 millilitersのバッファーでサンプルをFPLC装置に注入し、ランを開始します。1.5 mLずつ分画し、合計72フラクションを回収します。メーカーの指示に従い、比色法キットを用いて総コレステロール値を測定し、DGUC HDLに相当するFPLCフラクションを特定します。DGUC HDLを含むFPLCフラクションは6〜7個得られる見込みです。HDLを含むすべての画分を回収し、分画分子量10 kilodaltonの遠心フィルターを用いて、4°C、4,000 ×gで1時間、またはHDL濃縮液が約100 µLになるまで濃縮します。次に、HDL濃縮液を回収し、BCA法を用いてタンパク質を定量します。その後、RNAを単離するために、同量のHDL総タンパク質を使用します。ヒト血漿を、密度勾配分離を用いずにFPLCで分画した。6つの分画がHDLに、別の6つの分画が極低密度リポタンパク質に対応していた。脂質（黒）、コレステロール（赤）、およびタンパク質（青）は、すべて比色法キットを用いて測定した。対照的に、FPLCの前に密度勾配超遠心分離を行うと、脂質タンパク質およびコレステロールはほぼ排他的にHDL画分に認められました。4名の健康な血漿ドナーから回収したHDLから全RNAを単離し、シングルリード50塩基対プロトコルを用いてシーケンスを行いました。正規化リードの分布から、21および34ヌクレオチド付近の小型RNAの濃縮が示されました。ライブラリの解析により、リードの38%がmicroRNAであり、37%がtRNA由来であることが示されました。また、その他のRNA、リボソームRNA、小型RNA、小型核小体RNA、および長鎖非コードRNAも存在していました。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、10日以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、ハイスループットシーケンシングで観察されたHDL small RNAの変化を、PCRやノーザンブロッティングなどの別の手法で検証することが重要であることに留意してください。本手順に続き、RNA抽出ステップやシーケンシング準備ステップの間に、HDLコレステロール流出能（e-flux acceptance capacity）やHDL抗炎症活性（SAs）などの他の解析を行うことで、HDL small RNAの変化とHDL機能の相関性の決定など、さらなる疑問に対する検討が可能です。本技術の開発後、脂質およびリポタンパク質の分野の研究者は、非コレステロール貨物、特に核酸や、高コレステロール血症や糖尿病などの代謝性疾患の研究への道を切り拓くことができました。また、ヒト血漿の取り扱いは極めて危険である可能性があるため、血液媒介性病原体に関する適切なトレーニングを受け、本手法を実施する際は適切な個人用保護具を着用することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

本論文では、エクソソームの単離、精製および検出のための方法、ならびにそれらの分子量の分析のためのテクニックを示しています。これらのメソッドは、細胞培養液や体液の両方からエキソソーム分離のための適応であり、分子量の分析を越えても機能的研究に役立ちます。...

RNA含有エキソソームの単離と解析

RIP-チップを介したRNA関連した複合体を単離および同定するためのステップバイステップのプロトコル。...

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。...

ヒト血清から小非コードRNAの分離

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。...

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。...

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna...

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA...

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。...

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

学ぶ高密度リポタンパク質からの非コード小型RNA定量化法。密度勾配超遠心分離とFPLCを用いて高純度HDLを精製し、疾患バイオマーカーとしての可能性を探索する技術です。

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

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