生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

この手順の全体的な目標は、シーレスの多孔質先端インターフェースを使用したキャピラリー電気泳動質量分析法(CE-MS)を使用して、高極性代謝物と荷電代謝物の分析をどのように使用できるかを実証することです。代謝物が頻繁に帯電しないと仮定し、それらはカチオン性または陰イオン性であり得、それらを分離するためには、毛細管電気泳動のような電解分離が最適な方法である。しかし、近年では感度が十分ではありませんでした。

これはインターフェースによるもので、この方法も堅牢ではありませんでした。しかし、シースをフリーインターフェースとして使用し、この新しいプロトコルを使用することで、両方の問題をうまく解決できたと思います。新しいシーレス多孔質チップインターフェースを使用したキャピラリー電気泳動-質量分析は、メタボロミクスの分野における主要な臨床上の問題に対処するために使用できます。

例えば、この技術により、高極性荷電代謝物のプロファイリングを容易に行うことができます。Sコンポジットは、電荷とサイズ比に基づいて分離されています。多くの場合、この手法は、生物学的サンプルに標識されたこのタイプの化合物のボリュームのプロファイリングに非常に適しています。

提案されたシーレスCE-MS法のユニークな特徴は、CE電圧極性とMS検出極性を切り替えるだけで、陰イオン性およびカチオン性代謝物のプロファイリングに使用できることです。一般的に、CE-MSは比較的新しく複雑な技術と見なされているため、この方法に不慣れな人は苦労するでしょう。この手順を開始するには、多孔質チップエミッターを備えた新しい裸の溶融シリカカートリッジをキャピラリーゾーン電気泳動またはCE機器に配置します。

CE機器を制御するソフトウェアを使用して、50 psiで15分間フォワードメタノールリンスを適用します。また、毛細管出口から液体が流出していないかを目視で確認します。次に、バックグラウンド電解質またはBGE溶液を使用して50psiで反対方向のすすぎを5分間行い、導電性キャピラリーから液体が流出しているかどうかを視覚的に調べます。

キャピラリー出口から液体が流出するのを観察しなかった場合は、100psiの圧力で前の手順を繰り返します。次に、分離毛細管を50psiの水で10分間すすぎ、続いて0.1モルの水酸化ナトリウムを50psiで10分間、50psiの水を10分間、BGE溶液を50psiで10分間すすぎます。その後、フューズドシリカカートリッジの噴霧器先端を水管から取り外し、MS装置に結合するためのナノスプレーソースアダプターに取り付けます。

CE機器のBGE溶液バイアルの高さが噴霧器の先端の高さと一致していることを確認してください。導電性キャピラリーを通る液体の流れを確認するために、BGE溶液で50psiで5分間すすぎます。このすすぎステップでは、エレクトロスプレーイオン化、またはESI噴霧針の基部に液滴が観察されます。

すすぎ後、分離キャピラリーをBGE溶液で50psiで順方向に10分間フラッシュします。このステップでは、多孔質チップエミッターの先端に液滴が観察されます。次に、多孔質チップエミッターをMSインレットの入口に約2〜3mmの距離で配置します。

1分間のランプ時間で30kVの電圧を印加し、最初にESI電圧をゼロにして代謝プロファイリング研究のために、65〜1000の質量電荷範囲のMSデータの取得を開始します。データを測定しながら、ESI電圧を1000Vに設定します。ESI電圧を200V刻みで増加させ、一定のバックグラウンド信号が少なくとも15分間観察されるまで待ちます。

予め調製した陰イオン代謝物標準混合物の20マイクロリットルを空の100マイクロリットルのマイクロバイアルに移します。マイクロバイアルをCEバイアルに入れ、CEバイアルをインレットサンプルトレイに入れます。以前に作成したMS取り込みネガティブイオンモードメソッドを開始し、その後、CE装置を制御するソフトウェアを使用してCEシーケンスを開始します。

これに続いて、分離キャピラリーをBGE溶液で50 psiで3分間すすぎ、続いて2 psiで60秒間、1 psiで10秒間注入します。入口で30kVの電圧を1分間のランプ時間と0.5psiの圧力で30分間印加します。30分間の電気泳動分離後、MSデータ集録を停止し、5分間のランプ時間でCE電圧を1kVに下げます。

サンプル注入の合間に、分離毛細管を水、0.1モルの水酸化ナトリウム、水、およびBGE溶液で30 psiで3分間すすぎます。ランが完了したら、分析した陰イオン性代謝物混合物の移動時間とシグナル強度を決定して、記録されたデータを分析します。陰イオン性代謝物標準物質が10〜28分の間にその領域に現れるかどうかを評価します。

次に、構造的に関連のある3つの異性体、D-グルコース1-リン酸、D-グルコース6-リン酸、D-フルクトース6-リン酸が部分的に分離しているかどうかを確認します。高極性陰イオン代謝物の分析におけるシースレス CE-MS 分析法の分離性能は、構造的に関連する 3 つのリン酸糖異性体について実証されています。これら 3 つの分析種についてはベースライン分離は得られませんでしたが、これらの分析種は正確な質量が同じであるため、MS による選択的検出を可能にするには部分的な分離で十分です。

このシーレスCE-MS法では、生体サンプルを分析する際には、学術基準を用いて経時的な分析性能を定期的にチェックすることが重要です。全体として、シーレス法により、超微量の生体試料中のこれらのタイプの化合物のプロファイリングが可能になり、生物医科学分野、生物分析化学分野、および外部の研究分野でこれらのタイプのサンプルを分析するための多くの可能性が開かれます。このビデオを見れば、高極性および荷電代謝物のプロファイリングのために、シーレス多孔質インターフェースを介してCEをMSに結合する方法を十分に理解できるはずです。