Name: HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ 蛍光偏光法を用いた高スループットスクリーニングで、TRIP8bとHCNチャネルの相互作用を阻害する小分子化合物を同定する方法。うつ病や慢性疼痛の新規治療薬開発への応用が期待されます。

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この作業は、National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.)、Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.)、Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.)、Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.)、および National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.) の支援を受けました。この研究の一部は、シカゴ生物医学コンソーシアムが資金提供し、シカゴコミュニティトラストのサール基金の支援を受け、シカゴコミュニティトラストのサール基金およびがんセンターサポートグラントP30 CA060553、国立がん研究所からロバートH.ルーリー総合がんセンターに授与された、分子革新および創薬センター(CMIDD)のノースウェスタン大学医薬品合成化学コア(ChemCore)によって行われました。ハイスループットスクリーニング作業は、Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Centerの中核施設でもあるHigh Throughput Analysis Laboratoryで行われました。

1. TRIP8bの精製（241から602）タンパク質<ol><li>コンピテントE.に細菌タンパク質発現ベクターpGS21 3にTRIP8b（241から602）を含むプラスミドをトランスフォーム製造業者の指示に従って、タンパク質発現のための大腸菌 。プレートルリアブロス（LB）上での培養の300μlをクロラムフェニコールおよびアンピシリン5μg/ mlの-agar。 16時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>翌日、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを50μg/ mlの50ミリリットルのLBを接種するために、単一のコロニーを選択します。 （振盪しながら）16時間37℃で培養物をインキュベートします。 </li><li>アンピシリンを50μg/ mlのLBの1リットルに50 mlの培養液を追加します。振盪しながら37℃でインキュベートします。 </li><li>培養物が0.8〜1.2のOD 600読み取りに到達した後、18℃のインキュベーターの温度を変更し、1mMの最終濃度までIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド）を加えます。タンパク質の発現は、16時間進行させます。 </li><li> E.をスピンダウン細菌をペレット化するために4℃で15分間、6000×gで大腸菌 。遠心機からチューブを除去した後、手順の残りのために氷の上の細菌を保ちます。フェニルメタンスルホニルフルオリドの0.25 mMの（PMSF）との緩衝液Aの36ミリリットルに細菌を再懸濁します。 </li><li>ハイパワーで30秒「オフ」「オン」30秒の間で交互に、5〜10分間フラットボルトを使用して、氷上で再懸濁した細菌を超音波処理します。 </li><li> 4℃で15分間、12,000×gで遠心分離します。さらに15分間遠心上清はまだ明らかではない場合。 </li><li> 2ミリリットルのNi-NTAビーズのカラムに上清を適用します。緩やかに揺り動かしながら4℃で60分間インキュベートします。 </li><li>非結合物質がカラムを通って流れ、緩衝液Aの500ミリリットルで洗浄することを許可します</li><li>緩衝液B 250mlでカラムを洗浄</li><li>緩衝液Aの125ミリリットルでカラムを洗浄5 mMイミダゾールを補いました。 </li><li>あちこちタンパク質を溶出20ミリリットル溶出緩衝液でカラムをメートル。 </li><li>注射器を使用して - 透析カセット（10kDaの分子量カットオフ）に溶出したタンパク質を追加します。 4℃の冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の4 Lで60分間、タンパク質を透析。 </li><li>冷PBSの新しい4 Lのバケットに透析カセットを移動します。 4 O℃で16時間、タンパク質を透析</li><li>翌朝には、製造者の指示に従って、クーマシータンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を確認します。 40μM以下の濃度が観察された場合には、製造者の指示に従って、タンパク質濃縮器を用いてタンパク質を濃縮します。貯蔵のために-80℃で小分けし、凍結。 </li></ol> 2.小​​規模蛍光偏光アッセイは、2つのタンパク質断片の相互作用を特徴づけるために、 <ol><li> 40μMTRIP8b（241から602）の200μLを解凍し、1.5mlチューブに追加します。 11さらに1.5 mlチューブに100μlのPBSを追加します。 </li><li> 、シリーズの次のチューブに元の管からTRIP8b100μlの（241から602）を転送上下にピペッティングし、処理を繰り返すことにより、連続希釈液を実行します。これは、0.01から40μMの範囲TRIP8b（241から602）の2倍希釈の12ポイントのシリーズを生成します。 </li><li> 0.1μMHCN1 FITC（10μMの一定分量の6.5μl）を、PBS中2mMのジチオスレイトール（DTT）の650μlのマスターミックスを調製します。 注：マスターミックスは2倍です。 </li><li> 12新しい1.5 mlチューブを設定します。各チューブにHCN1 FITCを含むマスターミックス50μlのを追加し、12連続希釈液のそれぞれから50μlを添加します。 注：これは12のチューブ、各含む0.05μMHCN1 FITC、元の連続希釈からTRIP8b（241から602）の濃度の半分を生成します。 </li><li>三重で、ウェルあたり30μlの、アッセイプレートに希釈系列を追加します。低結合ソリッドブラック384ウェルプレートを使用してください。 </li><li>プレートFをスピンまたは室温で900×gで2分。 </li><li>製造者の指示に従って、マイクロプレートリーダーを用いてプレートをお読みください。以下の測定パラメータを使用して蛍光偏光を測定：485nm励起、530nmの発光、505nmのダイクロイックミラー、100ミリ秒の積分時間です。 </li><li> TRIP8b対数目盛上（241から602）対濃度分極（MP）の値をプロットします。ラベルされたHCN1ペプチドをTRIP8b（241から602）の親和性（K dを ）決定するために、ヒルの式にデータをフィット。 注：段階希釈を調製するために、マルチウェルプレートはまた、代わりに、チューブを使用することができます。 </li></ol> 3.ポジティブコントロールを使用したタンパク質間相互作用を調べ<ol><li> 1.5mlチューブに標識されていないHCN1ペプチド（200μM）の200μlのを追加します。 11さらに1.5 mlチューブに100μlのPBSを追加します。第1の管へのペプチドの200μLを含むチューブから100μlのを転送することにより連続希釈液を行います100μlのPBSの。非標識HCN1ペプチドの2倍希釈で12チューブを生成するためのプロセスを繰り返します。 </li><li> 0.2μMHCN1 FITCと4μMTRIP8b（241から602）の650μlのマスターミックスを調製します。 注：これは、2倍のソリューションです。 </li><li> 12新しい1.5 mlチューブにマスターミックス50μlのを追加します。 </li><li> 1.5mlチューブに各連続希釈液50μlを加えます。 </li><li>ウェルあたり30μLを加え、三連で黒384ウェルマイクロタイタープレートをロードします。 </li><li>室温で900×gで2分間プレートを遠心。 </li><li> FPが可能なマイクロプレートリーダーを用いてプレートをお読みください。ステップ2.7で説明したのと同じ設定を使用します。 </li><li> K D 1 = IC 50 /（1 + [L] / K D 2）、K d 1が未標識の親和性を表す。Cheng-Prusoff式を用いてTRIP8bための非標識ペプチド（241から602）の親和性を計算しますTRIP8b（241から602）、IC 50のためのペプチドは、前のステップで決定されますそして、標識リガンドを置換する非標識リガンドの能力を表し、[L]はステップ3.2での標識リガンドの濃度、およびK dの2が標識リガンドのためのTRIPb（241から602）の親和性です。 </li></ol> 4.評価アッセイの性能（計算Zファクター） <ol><li> 2μMTRIP8b（241から602）、50 nMのHCN1 FITC、およびFPバッファー中で1 mMのDTTでFP緩衝液の12ミリリットルの溶液を作ることによって、マスターミックスを調製します。 注：これは、40μMTRIP8b（241から602）を60μl、10μMのHCN1 のFITCを60μl、およびFPバッファの1080μLを必要とします。 </li><li>黒色384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにマスターミックス30μlを添加します。 </li><li>ポジティブコントロールとして機能するように192ウェルに1 mMの未標識HCN1ペプチドの1μLを加えます。 </li><li>ネガティブコントロールとして機能するように192ウェルにFPバッファの1μLを加えます。 </li><li>室温で900×gで2分間プレートを遠心。 </li><li>マイルを使用してプレートを読みますcroplateリーダー。 </li><li> σのposとσNEGは、正と負の対照ウェルの標準偏差である3 *（NEG-σσPOS）/（μNEG-μPOS） - Z = 1：以下の式を使用してアッセイのためのZ係数を計算、およびμとμPOS NEGは、正および負の対照ウェルの平均シグナルを表します。 </li></ol> 5.ハイスループットスクリーニング<ol><li> TRIP8b（241から602）とHCN1 FITCのアリコートを解凍し、氷上で保管してください。 </li><li> FPバッファにTRIP8b（2μM）およびHCN1 FITC（50 nM）を10mlのを準備します。 </li><li>ピペットを用いて384ウェル黒色マイクロタイタープレートを結合低の各ウェルに混合物を25μl分注します。 </li><li>ライブラリースクリーニングのために、音響液体ハンドラーを使用して列の各ウェル3（それぞれ40μMの最終濃度）22に化合物を追加します。 注：これによりrelativelへこのアッセイで観察されたY低いヒット率は、二つの異なる化合物は、単一のウェルにプールしました。各アクティブウェルからの2つの化合物は、その後の活性を付与する識別するために、個別に試験しました。 </li><li>陰性対照として、列1及び各プレート23の各ウェルにジメチルスルホキシド（DMSO）の100 NLを加えます。 </li><li>陽性対照として、列2および各プレートの24の各ウェルに非標識HCN1ペプチドを追加します。 </li><li> 2時間室温でプレートをインキュベートします。プレートを読むか、読む前に16時間4℃でインキュベートします。 </li><li>プレートリーダーで蛍光偏光を測定します。ステップ2.7で説明したのと同じ設定を使用します。 </li><li> 100％として各プレートの平均ポジティブ及びネガティブコントロールを使用して信号を正規化することにより阻害パーセントを計算します。 X Nは信号Xに対応する正規化阻害パーセントである（X POS） - - X）/（X NEG（X NEG）、X posの方程式XN = 100％*を使用します</sub&gt;陽性対照ウェルからの平均シグナルであり、かつXのNEGは陰性対照ウェルからのシグナルです。 </li></ol> TAMRAタグ付きHCNペプチドを使用してヒット6.確認<ol><li>検証は、TAMRA標識HCN1ペプチド（HCN1 TAMRA）を使用して、50％以上の阻害とヒット。 <ol><li> 2μMTRIP8b（241から602）の12ミリリットルとFPバッファー中で50 nMのHCN1 TAMRAのマスターミックスを調製します。 </li><li>黒色384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにマスターミックス25μlずつ分注します。 </li><li>それぞれのウェルに各活性化合物の連続希釈液を転送します。それぞれの濃度は200μM、0.2μMから範囲を打つことを2倍希釈液は、そのようなことを確認します。 </li><li>陰性対照反応では、各ウェルにDMSOの100 NLを転送します。陽性対照のために200μMから0.1μMの範囲の最終濃度で連続希釈した非標識HCN1ペプチドの100 NLを追加します。 </li><li> RTでプレートをインキュベート2時間。プレートを読むまたは4で16時間インキュベート 読み込む前にC°。 </li><li>以下の測定パラメーターを用いて測定する蛍光偏光（MP）：535 nmの励起を、 580 nmの発光。 535 nmのダイクロイックミラー、20ミリ秒の積分時間。 </li><li> 4パラメータの非線形回帰モデル23を用いて、各化合物の濃度依存性のFPデータをフィッティングすることによりIC 50値を計算します。 </li></ol></li></ol>ビーズベースの近接アッセイの7用量反応の検証<ol><li> HisタグTRIP8b（241から602まで）（彼-TRIP8b）およびGSTタグ付きHCN1（GST-HCN1 C40）融合タンパク質の1アリコートを解凍し、氷上で保管してください。 </li><li> 400 nMの彼-TRIP8bおよび40 nMのGST HCN1 C40の濃度でアッセイ緩衝液中でGST-HCN1 C40と彼-TRIP8bを兼ね備えています。試験すべき各化合物のための混合物の300μlのを準備します。 注：化合物は、11の異なる濃度プラスDMで三重に実行されますSOコントロール（化合物なし）。 </li><li>対照ウェルについては、GST-HCN1C40せずに彼の-TRIP8b（200 nM）を30μlのを準備した後、別々にアッセイ緩​​衝液中のHis-TRIP8bずにGST-HCN1C40（20 nM）を30μlのを準備します。 </li><li> 16チャンネルピペットを用いてプレートの36ウェルに（上記のステップ7.2で調製した）GST-HCN1 C40の混合物：各化合物を試験するためには、彼の-TRIP8bの7μlを添加します。単一の化合物を試験するために、行ALと列1-3の3回の反復で12の異なる濃度を手配。行Nの列1-3に列、行Mの1-3及び（7.3で調製した）GST-HCN1 C40液の7μlに（7.3で調製した）彼の-TRIP8bソリューションの7μl加え手短に述べると、プレートを遠心分離液体が各ウェルの底にあることを確認し、任意の気泡を除去します。 </li><li>それぞれの濃度は0.1μM（行K内）まで200μM（A列内）から範囲をヒットするようなプレートに、試験するヒット化合物を分注します。の分注容積行AKで分配化合物の量に一致する行LN中のDMSO。 </li><li> 2分間プレートを振るし、室温で2.5時間インキュベートします。 </li><li>アッセイ緩​​衝液で抗GSTアクセプタービーズ1:50に希釈します。 </li><li> 16チャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルに希釈されたアクセプタービーズの3.5μLを加え、穏やかに気泡を作成しないようにピペッティングして混ぜます。 </li><li>暗所で室温で1時間静置します。 </li><li>ニッケルキレートドナービーズをアッセイ緩​​衝液で1:50に希釈します。光に混合物を置かないでください。 </li><li> 16チャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルに希釈されたドナービーズの3.5μLを加え、穏やかに気泡を作成しないようにピペッティングして混ぜます。 </li><li>暗所で室温で1.5時間静置します。 </li><li>プレートリーダーで読みます。 40ミリ秒励起時間、100ミリ秒発光時間、0.1ミリメートルの検出高さ：以下の測定パラメータを持つプレートリーダーを使用してください。 </li><li> EACのためのデータフィッティングによりIC 50値を計算します4パラメータ非線形回帰モデル23を使用して、時間化合物。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

そのためMDD 24における治療標的としての可能性のため、中枢神経系4にHCNチャネル機能を拮抗薬理学的アプローチにかなりの関心が集まっています。しかし、これらの努力は、心臓ペースメーカーや不整脈25のリスクのHCNチャネルの重要な役割によってストールされています。私たちは、TRIP8b 8、HCNおよびその脳の特定の補助サブユニットとの間の相互作用を破壊すると、心臓のHCNチャネル3に影響を与えることなく、抗うつ様効果を生成するのに十分であるかもしれないと推論しました。この仮説は、マウスが抗うつ様行動7を示すTRIP8b欠い観測に支えられました。この相互作用を標的とすることは、MDDの治療のための新しいパラダイムになる可能性があります。 TRIP8bのTPRドメインおよびHCN1のC末端トリペプチドの間の相互作用の小分子阻害剤を同定するための詳細なプロトコール上記に提示。その一般的な適用を容易にするために...

過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（HCN）チャネルは、それらが膜興奮1の調節において重要な役割を果たし、心臓および中枢神経系で発現されます。 HCNチャネルは、薬理学的にHCNチャネル機能を制限することがMDD 3のための新規治療法として有効であることを提案するいくつかのグループをリードしてきた大うつ病性障害（MDD）2、の病因に関与しています。しかし、直接HCNチャネルを標的とするため、心臓の活動電位4におけるそれらの重要な役割で実行可能でありません。イバブラジン、唯一のFDAは、HCNチャネル拮抗薬を承認し、徐脈効果5を生成する心不全の治療のために使用されます。このように、中枢神経系でのみHCNチャネル機能を制限する薬理学的薬剤の必要性があります。 テトラトリコペプチドリピート含有Rab8b相互作用タンパク質（TRIP8b）脳特異ですHCNチャネル6,7の表面発現と局在を制御するHCNチャネルのFIC補助サブユニット。 TRIP8bの遺伝子ノックアウトは、心臓8におけるHCNの発現に影響を与えることなく、脳のHCNチャネル7の減少を引き起こします。興味深いことに、TRIP8bノックアウトマウスは、強制水泳タスクと尾懸垂タスク7、抗うつ効果9-11のための2つの一般的に使用されるスクリーニング検査に少ない時間の不動を費やしています。これらの結果は直接、HCNチャネル機能の小分子アンタゴニストとHCNチャネルを標的とする抗うつ様行動を生成するのに十分であり得るTRIP8bとHCNとの間の相互作用を破壊するのではなく、それを示唆しています。 TRIP8bは、2つの異なる結合部位でHCNに結合します。 HCNの環状ヌクレオチド結合ドメイン（CNBD）はTRIP8b 12,13のTPRドメインにTRIP8b位置するN末端の保存されたドメインと相互作用します。このに関与しているCNBDの残基が、相互作用が関与しているTRIP8bの領域は、80アミノ酸の断片13を越えて絞られていない、14にマッピングされています。第二の相互作用がTRIP8bのテトラトリコペプチド反復（TPR）ドメインおよびHCNのC末端トリペプチド（HCN1、HCN2、およびHCN4の「SNL」が、HCN3の「ANM &#39;）3,12との間で発生します。このCテール相互作用の最近解明結晶構造15は、5（PEX5）peroxin、ペルオキシソーム輸入受容体との間の相互作用に実質的な構造類似性を明らかにし、その1型ペルオキシソームターゲティング配列（PTS1）16を含む、相互作用パートナー。 両方の相互作用部位は、HCNチャネル機能のために必要とされるが、TRIP8bのTPRドメインおよびHCN1のC末端トリペプチドとの間の相互作用が支配的な結合部位として機能し、HCNの表面発現を調節します。従って、この相互作用は、この研究における標的部位として選択しました。参照がTRIP8bとHCNとの間の相互作用に言及するとき、原稿の残りの部分については、それが参照されているこの相互作用です。この相互作用は、HCN（残基TRIP8bの1A-4アイソフォームの241から602）3のC末端尾部を結合するために必要TPRドメインを含むその保存C末端に対応するTRIP8bの高度に可溶性断片によって再現されます。 この相互作用を破壊することができる小分子を同定するためのハイスループットスクリーニングを開発するために、蛍光偏光（FP）は、アッセイは17を用いたベース。蛍光偏光は、偏光を有するフルオロフォアタグ化リガンドの励起に基づいて、放出された蛍光18の偏光度を測定しています。結合パートナーの存在下では、蛍光リガンドの回転運動が拘束され、偏光19を出射します。結合パートナーTの非存在下で彼は、リガンドの回転運動は、脱分極光の放出をもたらします。 囲まれたプロトコルでは、ニッケル - ニトリロ三酢酸（のNi-NTA）ビーズを用いたN末端タグ（の6xHis）TRIP8bの精製（241から602）のための方法が提供されます。同様のプロトコルは、プロトコルのステップ7で使用されるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST） -タグC HCN1の末端40アミノ酸（HCN1のC40）を精製するために使用されました。スペースの考慮事項については、その手順の詳細な説明は省略されました。 プロトコルの7〜ステップ2において、ハイスループットスクリーニングワークフロー（ 図1参照）が提示されます。タンパク質-タンパク質相互作用は、ハイスループットスクリーニングのために難しいことで知らターゲットであり、読者は、トピック20に追加のリソースを模索することをお勧めします。 手順のステップ2と3、精製TRIP8b（241から602）のin vitroでの親和性を特徴付けるには、FOを構築しますRAフルオレセインイソチオシアネート（FITC）HCN1（HCN1 FITC）のC末端尾部に対応する11アミノ酸ペプチドをタグ付き。 TRIP8b-HCN複合体15の結晶構造に基づいて、この11アミノ酸セグメントはTRIP8b（241から602）との結合生成するのに十分です。ステップ2において、相互作用のK dは 、HCN1 FITCの一定濃度にTRIP8b（241から602）を滴定することによって測定されます。ステップ3では、ステップ2で使用したHCNペプチドの非標識バージョンは、FITCタグが結合を妨害するかどうかを調べるために、両方のTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの一定濃度に滴定します。これらの実験は、ハイスループットスクリーニングに使用TRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの適切な濃度を選択するには不可欠です。 ハイスループットスクリーニングの前提はTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCとの間の相互作用を破壊することができる小分子が12月に生産することです偏光でrease。ステップ4において、アッセイのZ因子は、アッセイは、ハイスループットスクリーニング（ステップ5）のために適切であることを保証するためにTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの所与の濃度について21を算出します。ステップ6および7は、一次ハイスループットスクリーニングで同定されたヒットはTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの間ではなく非特異的な機構を介して相互作用を破壊することにより作用していることを確認する検証アッセイです。ステップ6において、カルボキシ（TAMRA）は（HCN1 TAMRA）HCN1ペプチドを標識FITCタグを用いてFPアッセイを損なう蛍光化合物をフィルタリングするためにそうでなければ同一の蛍光偏光アッセイで使用されています。ステップ7は、より大きなHCN1 C末端断片（HCN1 C40）を利用し、タンパク質相互作用によって相互に近づけたアクセプタービーズへのドナービーズから一重項酸素の「トンネル」に基づいているビーズに基づく近接アッセイを採用します22。

<table><tbody><tr><td>Ni-NTAアガロース&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>透析カセット&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー66456</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルb-D-1-チオガラクトピラノシド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502 - 1 gr</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルブラックプレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>3820</td><td></td></tr><tr><td>プロキシプレート&nbsp;</td><td>パーキン・エルマー&nbsp;</td><td></td><td></td>6008289</tr><tr><td>アンチGSTアクセプタービーズ&nbsp;</td><td>パーキン・エルマー&nbsp;</td><td>6760603C</td><td></td></tr><tr><td>ニキレート</td><td>・パーキン・エルマー&nbsp;</td><td>AS101D</td><td></td></tr><tr><td>pGS21-a</td><td>Genscript</td><td>SD0121</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質濃縮器</td><td>ThermoFisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td><td>Perkin-Elmer&nbsp;</td><td>#2300-001M</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) コンピテントセル</td><td>アジレント</td><td>200131</td><td></td></tr></tbody></table>

hcn1とtrip8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（HCN）チャネルは、それらが神経細胞の興奮性を調節するように機能脳全体に遍在的に発現されています。海馬領域CA1の錐体神経細胞におけるこれらのチャネルの細胞内分布は、テトラトリコペプチドリピート含有Rab8b相互作用タンパク質（TRIP8b）、補助サブユニットによって制御されています。 HCNの遺伝子ノックアウトは、両方がHCNチャネルの機能を制限することが大うつ病性障害（MDD）の治療薬として有用であり得ることを示唆し、抗うつ様行動の増加につながる、形成サブユニットまたはTRIP8b細孔。有意な治療上の関心にもかかわらず、HCNチャンネルはまた、リズムを調節する心臓において発現されます。心臓HCNチャネルを遮断することに関連したオフターゲットの問題を回避するために、私たちの研究室は最近、特に脳内のHCNチャネルの機能を破壊するために、HCNとTRIP8b間のタンパク質 - タンパク質相互作用を標的と提案しています。ここでの焦点はTRIP8bのテトラトリコペプチド反復（TPR）ドメインおよびHCN1のC末端尾部との間の相互作用にあるもののTRIP8bは、二つの異なる相互作用部位でのサブユニットを形成するHCN孔に結合します。このプロトコルでは、TRIP8bを精製し、HCNとTRIP8bとの間の相互作用の小分子阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングを実行するための方法の拡大説明は、記載されています。ハイスループットスクリーニングのための方法は、蛍光偏光（FP）は、HCN1 C末端尾部に対応するフルオロフォアタグ11アミノ酸ペプチドに大きなTRIP8bフラグメントの結合をモニターするためのアッセイをベース利用します。この方法は可能に「ヒット」化合物は、放射された光の偏光の変化に基づいて同定することができます。検証アッセイは、その後、「ヒット」化合物は、人為的でないことを確認するために行われています。

私たちの以前の出版物に著作権の問題を回避するには、TAMRAタグ付きプローブHCN1 TAMRAは、 図2と図 3を生成するために使用されました。この置換は、結果にかなりの違いを行っていないことに注意してください、とプロトコルがHCN1 FITCして上に概説したものと同一です。 HCN1 TAMRA、TRIP8b（241から602）との相互作用を評価するために、ステップ2（ 図2）で概説したプロトコルを使用してHCN1 TAMRAの一定濃度に滴定しました。次に、ステップ3で概説した実験を実施し、非標識HCN1ペプチドはTRIP8b（241から602）とHCN1 TAMRA（ 図3）の固定濃度に滴定しました。 <p class="jove_content" fo:keep-together....

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

この手順の全体的な目的は、TRIP8bとHCNチャネルの間の相互作用を阻害することができる低分子を同定することです。本手法により、うつ病の新しい治療法として開発可能な候補分子を同定します。この技術の主な利点は、ハイスループットに実施できることです。当研究室では、TRIP8bのHCNへの結合を阻害することが治療上の利点となる可能性があることを示しており、本手法は主要うつ病性障害の新規治療法の開発に寄与します。この手法はうつ病を念頭に開発されましたが、TRIP8bとHCNの相互作用を阻害することは、慢性疼痛などの他の疾患においても治療上の利点となる可能性があります。ノースウェスタン大学の高スループット解析ラボのようなオープン施設において、自動化された高スループット機器を使用して基礎研究およびトランスレーショナルリサーチを推進することの利点を実証しているため、本プロトコルの視覚的な提示は重要です。テキストのプロトコルに従ってTRIP8b 241-602タンパク質断片を精製し、ポジティブコントロールを用いてタンパク質間相互作用を確認した後、TRIP8bとHCN1-FITCの分注液を融解し、氷上に保持します。FP Bufferを使用して、2 µMのTRIP8bと50 nMのHCN1-FITCを各20 mL調製します。次に、この混合液を低吸着384ウェルブラックマイクロタイタープレートの各ウェルに25 µLずつ分注します。ライブラリスクリーニングでは、アコースティックリキッドハンドラーを用いて、3〜22列の各ウェルに化合物を100 nanoliters分注し、最終濃度を40 micromolesにします。陰性対照として、1列目と23列目の各ウェルにDMSOを100 nanoliters分注します。陽性対照として、2列目と24列目の各ウェルに未標識HCN1ペプチドを100 nanoliters分注し、最終濃度を10 micromolesにします。プレートを室温で2時間インキュベートします。プレートリーダーを用いて、蛍光偏光を測定します。あるいは、測定前にプレートを4 °Cで16時間保存しても差し支えありません。以下の式を用いて、阻害率（%）を算出します。ここで、XNはシグナルXに対応する正規化された阻害率（%）であり、X positiveはポジティブコントロールウェルの平均シグナル、X negativeはネガティブコントロールウェルの平均シグナルです。阻害率が50%を超えるヒットを検証するために、FPバッファーを用いて、2 µMのTRIP8bと50 nMのHCN1 TAMRAを含む20 mLのマスターミックスを調製します。黒色の384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、マスターミックスを25 µLずつ分注します。次に、各活性化合物を2倍段階希釈したプレートから、各ウェルに化合物を100 nanolitersずつ添加します。陰性コントロールウェルには、DMSOを100 nanoliters添加します。陽性コントロールには、最終濃度が200 micromolesから0.1 micromolesの範囲になるよう、段階希釈した未標識HCN1ペプチドを100 nanoliters添加します。プレートを室温で2時間、または4 °Cで16時間インキュベートします。プレートリーダーを用いて蛍光偏光を測定します。各化合物の濃度依存的なFPデータを4パラメーター非線形回帰モデルを用いてフィッティングし、IC50値を算出します。HISタグ付きTRIP8bおよびGSTタグ付きHCN1融合タンパク質のアリコートをそれぞれ1つずつ解凍し、氷上に保持します。テストする各化合物に対し、アッセイバッファーを用いて200 nanomolarのHIS-TRIP8bを1 milliliter、および20 nanomolesのGST-HCN1C40を調製します。16チャンネルピペットを使用して、HIS-TRIP8bとGST-HCN1C40の混合液を7 microlitersずつ、行AからNまでの各行の3つのウェルに分注し、各化合物を3連（triplicate）でテストします。プレートを短時間遠心し、各ウェルの液を底に集め、気泡を除去します。次に、テストするヒット化合物をプレートに分注し、A列で 200 micromoles、L列で 0.1 micromoles となるように最終濃度を調整します。M列には同量の DMSO を加えます。続いて、ラベルなし HCN1 ペプチドを最終濃度 10 micromoles となるように N 列に分注します。プレートを 2 分間振盪し、室温で 2.5 時間インキュベートします。アッセイバッファーを用いて、Anti-GST 受容体ビーズを 1 対 50 に希釈します。16チャンネルピペットを用いて、希釈したアクセプタービーズをプレートの各ウェルに 3.5 µL ずつ加え、気泡が生じないように穏やかにピペッティングして混ぜ合わせます。プレートを室温の暗所で1時間インキュベートします。Nickel Chelate ドナービーズを、光に当てないように注意しながら、アッセイバッファーで1:50に希釈します。希釈したドナービーズをプレートの各ウェルに3.5 µLずつ加え、気泡が入らないように注意しながら穏やかに混合します。プレートを密閉し、室温かつ遮光条件下で1.5時間インキュベートします。その後、プレートリーダーを用いて、ここに記載されている測定パラメータでプレートを読み取ります。最後に、4パラメータ非線形回帰モデルを用いて各化合物のデータをフィッティングし、IC50値を算出します。HCN1 TAMRAとの相互作用を評価するため、一定濃度のHCN1 TAMRAに対してTRIP8bを滴定しました。このグラフは、TRIP8bの濃度が増加するにつれて、より多くのHCN1 TAMRA分子が結合し、偏光度が増加することを示しています。本実験では、一定濃度のTRIP8bおよびHCN1 TAMRAに対して非標識のHCN1を滴定的に添加することで、標識ペプチドが置換され、シグナルが減少しました。ハイスループットスクリーニングにより、各化合物の阻害率がグラフ上の単一の点として示されています。このスクリーニングの結果を、陽性コントロールおよび陰性コントロールとともに、2回の系における各化合物の平均阻害率としてプロットしています。50%以上の阻害を示した化合物について、本実験で検証を行いました。XおよびY座標は、2回のアッセイにおける阻害率によって決定されました。本実験において、HCN1C40はアクセプタービーズに結合するC末端GSTタグを含んでいます。TRIP8bのTPRドメインとHCN1のC末端トリペプチドの相互作用により、680 nmの波長の光でドナービーズを励起し、一重項酸素を生成させます。最終的に、このグラフに示されているように、一定濃度のTRIP8bおよびHCN1C40に対し、ヒット化合物であるNUCC-5953の濃度を段階的に上げて滴定したところ、TRIP8bとHCN1の相互作用に対する抑制効果が増加しました。ハイスループットスクリーニングを開始する前に、タンパク質調製の妥当性と、ビーズを用いた近接アッセイにおける蛍光偏光を検証してください。タンパク質が高純度であることを確認してください。凍結融解サイクルを繰り返さないよう、タンパク質を分注してください。新鮮なDMSOやTritonを含む、高品質な試薬を使用することが重要です。DMSOの取り扱いは危険を伴うため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じてください。本手順の後、ヒット化合物の細胞内活性を判定するために、電気生理学やフローサイトメトリーなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、蛍光偏光アッセイを用いたハイスループットスクリーニングの実施方法について、十分な理解を得られるはずです。

method-for-identifying-small-molecule-inhibitors-protein-protein

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