HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

この手順の全体的な目標は、TRIP8bチャネルとHCNチャネル間の相互作用を妨害する可能性のある小分子を特定することです。この方法は、うつ病の新しい治療法に発展する可能性のある候補分子を特定します。この手法の主な利点は、ハイスループットで完了できることです。

この技術は、私たちの研究室がHCNへのTRIP8b結合を破壊することが治療に有益である可能性があることを示したため、大うつ病性障害の新規治療法の開発に影響を及ぼします。この方法はうつ病を念頭に置いて開発されましたが、TRIP8bとHCNの間の相互作用を乱すことは、慢性疼痛などの他の障害において治療に有益である可能性があります。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、ノースウェスタン大学のハイスループット解析ラボのようなオープン施設で、自動化されたハイスループット機器を使用して基礎研究とトランスレーショナル研究を進めることの利点を示しているため、重要です。

TRIP8b 241-602タンパク質断片を精製し、TRIP8bおよびHCN1-FITCのアリコートを解凍し、氷上に保持するテキストプロトコルに従って、ポジティブコントロールとのタンパク質タンパク質相互作用を調べた後。FP Buffer を使用して、20 ミリリットルの 2 マイクロモル TRIP8b と 50 ナノモルの HCN1-FITC を調製します。次いで、混合物の25マイクロリットルを低結合の384ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに分注する。

ライブラリースクリーニングでは、音響リキッドハンドラーを使用して、カラム3から22の各ウェルに100ナノリットルの化合物を分注し、最終濃度を40マイクロモルにします。100ナノリットルのDMSOをカラム1および23の各ウェルにネガティブコントロールとして分注します。100ナノリットルの非標識HCN1ペプチドをカラム2および24の各ウェルにポジティブコントロールとして分注し、最終濃度を10マイクロモルにします。

プレートを室温で2時間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、蛍光偏光を測定します。あるいは、プレートを摂氏4度で16時間保存してから読み取ることもできます。

次の式を使用して、XNが信号に対応する正規化されたパーセント阻害、X.Xが正のコントロールウェルからの平均信号、Xがネガティブなコントロールウェルからの平均信号である、阻害率を計算します。50%以上の阻害でヒットを検証するには、FPバッファー中の20ミリリットルの2マイクロモルTRIP8bと50ナノモルHCN1 TAMRAのマスターミックスを準備します。25マイクロリットルのマスターミックスを黒色の384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。

次に、各活性化合物の2倍段階希釈液を含むプレートから100ナノリットルの化合物をそれぞれのウェルに加えます。ネガティブコントロールウェルには、100ナノリットルのDMSOを追加します。ポジティブコントロールには、最終濃度が200マイクロモルから0.1マイクロモルの範囲の段階希釈された非標識HCN1ペプチド100ナノリットルを追加します。

プレートを室温で2時間、または摂氏4度で16時間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、蛍光偏光を測定します。4 パラメーター非線形回帰モデルを使用して、各化合物の濃度依存 FP データを適合させることにより、IC50 値を計算します。

HISタグ付きTRIP8bおよびGSTタグ付きHCN1融合タンパク質をそれぞれ1アリコート解凍し、氷上に保ちます。試験する化合物ごとに、アッセイバッファーに200ナノモルのHIS TRIP8bを1ミリリットル、GST-HCN1C40を20ナノモル調製します。16チャンネルピペットを使用して、7マイクロリットルのHIS-TRIP8b GST-HCN1C40混合物を列AからNの列ごとに3つのウェルに追加し、各化合物を三重にテストします。

プレートを短時間遠心分離して、液体が各ウェルの底にあることを確認し、気泡を取り除きます。次に、試験するHit化合物をプレートに分注して、列Aで最終濃度を200マイクロモルに、行Lで0.1マイクロモルで仕上げます。次に、非標識HCN1ペプチドを最終濃度10マイクロモルまで行Nに分注しますプレートを2分間振とうし、室温で2.5時間インキュベートします。アッセイバッファーを使用して、抗GSTアクセプタービーズを1〜50に希釈します。

16チャンネルピペットで、希釈したアクセプタービーズをプレートの各ウェルに加え、気泡が発生しないように穏やかにピペッティングして混合します。プレートを暗所で室温で1時間インキュベートします。ニッケルキレートドナービーズをアッセイバッファーで1〜50に希釈し、混合物を光にさらさないでください。

希釈したドナービーズ3.5マイクロリットルをプレートの各ウェルに加え、気泡を避けて穏やかに混合します。プレートを密封し、室温で1.5時間暗所でインキュベートします。次に、プレートリーダーを使用して、ここにリストされている測定パラメータでプレートを読み取ります。

最後に、4 パラメーター非線形回帰モデルを使用して各化合物のデータを近似することにより、IC50 値を計算します。HCN1 TAMRAとの相互作用を評価するために、TRIP8bを固定濃度のHCN1 TAMRAに滴定しました。このグラフは、TRIP8bの濃度が増加すると、より多くのHCN1 TAMRA分子が結合し、分極が増加することを示しています。

この実験では、非標識HCN1を一定濃度のTRIP8bおよびHCN1 TAMRAに滴定したところ、標識ペプチドが置換され、シグナルが減少しました。ハイスループットスクリーニングでは、各化合物の阻害率がグラフ上の 1 つの点で表されます。このスクリーニングの結果は、ポジティブコントロールとネガティブコントロール、およびアッセイの 2 回の実行における各化合物の平均阻害率でプロットされています。

その後、50%を超える阻害を示す化合物をこの実験で検証しました。X 座標と Y 座標は、アッセイの 2 回の実行における阻害率によって決定されました。この実験では、アクセプタービーズを結合するエンドターミナルGSTタグがHCN1C40に含まれています。

TRIP8bのTPRドメインとHCN1のC末端トリペプチドとの相互作用により、ドナービーズは680ナノメートルの波長光で励起され、一重項酸素が生成されます。最後に、このグラフに示すように、ヒット化合物NUCC-5953の濃度の増加をTRIP8bおよびHCN1C40の固定濃度に滴定すると、TRIP8b HCN1相互作用の阻害が増加しました。ハイスループットスクリーニングを開始する前に、ビーズベースの近接アッセイにおけるタンパク質調製と蛍光分極を検証してください。

タンパク質が高純度であることを確認してください。タンパク質を分注して、複数回の凍結融解サイクルを回避します。新鮮なDMSOやTritonなどの高品質の試薬を使用することが重要です。

DMSOでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、ヒット化合物が細胞内で活性を有するかどうかを判断するために、電気生理学やフローサイトメトリーなどの他の方法を実行することができます。このビデオを見れば、蛍光偏光ベースのアッセイでハイスループットスクリーニングを行う方法について十分に理解できるはずです。