マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、インビボ組織分析

この手順の全体的な目標は、高解像度の構造情報と定量的スペクトルデータを組み合わせることにより、in vivo組織の機能特性評価を行うことです。この方法は、組織の微細構造や灌流に対する治療の影響の定量化など、がん生物学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、1つのプローブを使用して、同じ場所から画像データと分光データの両方を収集できることです。

この技術の意味は、プローブが従来の内視鏡検査技術と互換性があるため、胃腸がん治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、プローブの配置の小さな不規則性がデータの精度に大きな影響を与える可能性があるため、苦労します。この手法のアイデアを思いついたのは、高解像度のイメージング技術と定量分光法を組み合わせることの重要性に気づいたときでした。

この方法は、構築とキャリブレーションの両方が複雑であるため、準備手順を学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。マルチモーダルマイクロ内視鏡の高分解能蛍光顕微鏡モダリティの組み立てを開始するには、470ナノメートルのダイクロイックミラーを30ミリメートルのケージキューブに取り付けます。ケージアセンブリロッドをケージキューブの前面、右側、左側に取り付けます。

ネジ付きケージプレートにストレスフリーなリテーニングリングを取り付け、レンズチューブをリテーニングリングにねじ込みます。最初のケージプレートに合わせてレンズチューブに別のケージプレートを取り付けます。次に、UV強化アルミニウムミラーを直角ミラーマウントに固定します。

ミラーマウントの前面に4本のロッドを取り付け、マウントの右側に斜めに2本のロッドを取り付けます。レンズチューブアセンブリをケージキューブの左側にスライドさせます。ミラーマウントアセンブリの右側をレンズチューブアセンブリに接続します。

Z軸平行移動マウントをアセンブリの右側にスライドさせます。10倍アクロマティック対物レンズをトランスレーションマウントに取り付けます。次に、ファイバーアダプタープレートをXY軸平行移動レンズマウントに固定します。

対物レンズの前のアセンブリにマウントをスライドさせます。リテーニングリングを使用して、適切な励起フィルターと蛍光フィルターをレンズチューブに固定します。励起フィルターレンズチューブをケージキューブの前面にねじ込みます。

そして、直角ミラーマウントの前面に発光フィルターレンズチューブ。エポキシを使用して、励起フィルターの前のケージプレートに455ナノメートルのLEDを取り付けます。各フィルターレンズチューブの前にケージプレートをスライドさせます。

リテーニングリングを使用して、アクロマティックダブレットチューブレンズを別のレンズチューブに固定し、レンズの外側の矢印がレンズチューブの雄ネジ側を向くようにします。左のケージプレートにチューブレンズを取り付け、別のケージプレートをチューブレンズの前に置きます。ストレスフリーなリテーニングリングを使用して、USBモノクロカメラをケージプレートに取り付けます。

サブ拡散反射分光法のモダリティの組み立てを開始するには、エポキシを使用してタングステンハロゲン光源の前面にねじ付きケージプレートを取り付けます。4本のケージアセンブリロッドをケージプレートに挿入し、Z軸平行移動マウントをロッドにスライドさせます。20倍アクロマティック対物レンズをZ軸平行移動マウントにねじ込みます。

ファイバーアダプタープレートをXY軸平行移動マウントに接続し、対物レンズの前のアセンブリにマウントをスライドさせます。最後に、適切な取り付け装置を使用して、両方のアセンブリを近接した光学テーブルに固定します。ソース検出器分離スイッチングデバイスの構築を開始するには、雄ねじのSMAファイバーアダプタープレートをアルミニウムモーターアームにねじ込みます。

モーターアームアダプターをモーターアームの背面に取り付けます。次に、ステッピングモーターをアルミニウムモーターハウジングにねじ込みます。モーターアームアセンブリをモーターロッドにねじ込み、固定ネジを締めます。

次に、3つのファイバーアダプタープレートを光スイッチにねじ込み、次にフェースプレートを光スイッチにねじ込みます。ステッピングモーターロッドを光スイッチの中央の穴に通します。ステッピングモータードライバーをソダレスレッドボードの中心線を横切って配置します。

ドライバーを適切な電源とステッピングモーターに接続します。オプティカル・スイッチをオプティカル・テーブルに固定します。550マイクロメートル0.22naパッチケーブルをモーターアームに取り付けます。

もう一方の端をUSB分光計に接続します。光ファイバープローブを接続するには、中央の1mm画像ファイバーケーブルを高解像度蛍光顕微鏡モダリティアセンブリに取り付けます。左側の200マイクロメートルマルチモードケーブルを亜拡散反射分光法モダリティアセンブリに取り付けます。

左から続けて、残りのマルチモード ケーブルを光スイッチング デバイスの左、中央、および右のアダプターに順番に接続します。実験のキャリブレーションを開始するには、すべてのUSB周辺機器をコンピューターに接続します。すべての計器の電源を入れ、タングステンハロゲンランプのシャッターが開いていることを確認します。

次に、部屋の照明を消し、他の周囲光源を閉じます。データ集録ソフトウェアを開きます。キャリブレーションに進む前に、機器を30分間稼働させます。

20%拡散反射標準をキャリブレーションデバイスの底部に配置します。光ファイバープローブをデバイスの左側のスロットに挿入し、電動光スイッチを左側に設定して、DS設定として374マイクロメータを選択します。ソフトウェアで、積分時間を500ミリ秒に設定します。

次に、[スペクトルの取得] をクリックして、この SDS の RMAX の収集を開始します。RMAXの集録が終了したら、スペクトラムを指定のフォルダに保存してください。タングステンハロゲンランプシャッターを閉じ、このSDSのRダークスペクトルを取得します。

シャッターを開き、プローブをキャリブレーションデバイスの右側のスロットに移動し、電動光学スイッチを730マイクロメータSDS設定の中央位置に設定します。このSDSのRMAXとRDARKを取得して、キャリブレーションを完了します。まず、データ収集に適した皮膚領域を決定します。

黄色の蛍光ペンをピラニン源として使用して、選択した領域を軽く染色します。高解像度蛍光顕微鏡検査を開始するには、455ナノメートルのLEDをオンにし、タングステンハロゲンランプのシャッターを閉じます。光ファイバープローブを皮膚にやさしく接触させます。

ピラニン染色された組織上でプローブを動かし、頂端電流の洞察構造を表示します。ソフトウェアでは、画像の飽和を避けるために適切な露出時間とゲインを設定します。次に、[画像の取得]をクリックして静止画像を取得します。

サブディフューズ反射分光法のためにプローブを所定の位置に保ちます。455ナノメートルのLEDをオフにし、タングステンハロゲンランプシャッターを開きます。次に、左側の374マイクロメートルSDS設定に切り替えます。

[スペクトルの取得]をクリックして、このSDSのR-組織スペクトルを取得します。次に、中央の位置に切り替えて、730マイクロメートルのSDS R組織スペクトルを取得します。後処理ソフトウェアを開き、[実行]をクリックします。

プロンプトが表示されたら、キャリブレーションスペクトル、in vivoスペクトル、および高解像度蛍光画像を選択して、組織画像を取得します。高解像度蛍光顕微鏡モダリティは、組織部位の焦点に焦点が合った高解像度画像を提供します。ピラニン染色は、個々のケラチノサイトの輪郭を示します。

後処理ソフトウェアは、亜拡散反射分光法データを使用して、ヘモグロビン濃度、メラニン濃度、および組織酸素飽和度を計算します。良性のメラニン細胞性母斑を、このマルチモーダルマイクロ内視鏡を使用して隣接する正常な皮膚組織と比較しました。メラニン細胞性母斑は、正常組織と比較してわずかに低いヘモグロビン濃度とわずかに高いメラニン濃度を示しました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば1時間未満で完了できます。この手順を試行している間は、タングステンハロゲンランプを15分間ウォームアップし、データ収集の前に反射率標準で機器を校正することが重要です。この手順に続いて、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡などの他の技術を使用して、タンパク質の構造や代謝の細胞内変化を調べることができます。

その開発後、この技術は、研究者が化学療法に応答した組織灌流と微細構造との関係を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ハイブリッドマイクロ内視鏡イメージングおよび分光装置の構築方法と使用方法について十分に理解できるはずです。