Name: 生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶルテニウム錯体を用いた新規化学発光イメージング手法。侵襲的手術中の高S/N比による生体内イメージングで、従来の光学技術では困難だった病態観察を可能にし、がんなどの疾患研究に応用できます。

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著者は、有益な議論をしてくれたJan Grimm教授とTravis Shaffer氏、そして原稿の編集をしてくれたDavid Gregory氏に感謝します。MSK Animal Imaging Core Facilityが提供する技術サービス、およびNIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48の支援も一部提供しており、感謝しています。著者らは、NIH(K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.)、MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology(T.R.)、Tow Foundation(BC州)、National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship(IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.)の寛大な支援に感謝します。この出版物で報告された研究は、キングアブドラ科学技術大学からの資金提供によって支援されました。

倫理の声明：承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター（MSK）施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理ガイドラインの下に従って行った説明in vivo動物実験のすべて。 噴霧装置の1建設<ol><li> 2本のネジ（×25 mm 2と4）を使用して、パートB（12.7 X 10.7 X 1.8センチメートル3）の中央に直立木質部A（12.5 X 2.5×1.8センチメートル3）を取り付けます。 1本のネジを使用して、パートA（12.5 X 2.5×1.8 cm 3）での中央に木部C（11×2.5×1.8 cm 3で）を取り付け、その結果、C部（1.8×11×2.5cm 2の3）はまだ移動することができます。 図1を参照してください。 </li><li>二つのループ、どちらかに1を形成するために介して2つの穴のプラスチック3オンスミニ噴霧器（D）のスプレーボトルトリガの下部先端のドリルスルーとステンレス棒をプッシュ（1/16 &quot;鋼10センチ）（E）トリガーの側面。 </l私&gt; <li>抜けケーブルタイを防止するために、ダクトテープ（F）でスプレーボトルの底部を包みます。 2プラスチック製のケーブルタイを使用して、木質部C（11のx 2.5×1.8センチメートル3）（28センチメートル）（G）へのスプレーボトルを取り付けます。 </li><li> 011サーボモータ（I）を遮断し、サーボ制御（H）のケーブルが緩んでいないでそれを再接続します。そして、ダクトテープを使用して、木質部A（12.5 X 2.5×1.8センチメートル3）の上部にサーボモータを接続します。 </li><li>ペーパークリップ（K）を使用して、サーボモータレバーに鉛筆（J）を取り付けます。しっかりとプラスチックカバーされツイスト線（L）を使用して、スチールロッドループに鉛筆の最も外側の部分を接続し、ダクトテープと鉛筆の端を固定します。 </li><li>サーボモータ制御装置の磁気ケーブルコネクタ（M）を遮断し、スピーカーケーブル（N）に再接続します。そして、木質部B（12.7 X 10.7 1.8×cm 3）とするサーボモータ制御装置をテープ。半分に磁気コネクタ付きW1ケーブルをカットし、銅sの緩い最後に1部を添付ピーカーケーブル（1メートル）。 （磁気）12トグルスイッチとp1の電源が利用できW1ケーブルと9Vバッテリーに接続します。 </li></ol>法の2.感度決意<ol><li> 1.5 mLのマイクロ遠心チューブでは、260μgの（347ナノモル）、52μgの（69ナノモル）、26μgの（34ナノモル）の量で逆浸透水（100μL）の[3のRu（bpyで）]のCl 2の溶液を調製、5μgの（6.9ナノモル）、3μgの（3.5ナノモル）、520 ngの（694ピコモル）、260 ngの（347ピコモル）、52 ngの（69ピコモル）、26 ngの（34ピコモル）、5 ngの（6.9ピコモル）、および3 ngの（3.5ピコモル）。 </li><li>各100μLをミックス[のRu（bpyで）3]顕微鏡スライド上の硝酸セリウムアンモニウムの水溶液100μL（（NH 4）2 Ceの（NO 3）6）の水（25 mM）のでのCl 2溶液。 </li><li> イメージングソフトウェアを初期化することにより、生物発光リーダーに買収を設定します。 <ol><li>ユーザプロファイルにサインインし、アックイを探しますジションコントロールパネル。 「初期化」をクリックすると、機器の準備ができるまで待ちます。 </li><li>チェックされ、「画像表示モード」を探し、「発光」と「写真」がチェックされていることを確認し、その「蛍光」。 </li><li> 20秒に「発光」の設定「露出時間」に変更します。 「発光」のための残りの設定を設定し、次のように：「ビニング」：中。 「F /ストップ」：1。そして、「発光フィルタ」：オープン。 注：露光時間は、提示さ設定と異なる場合は、使用機器および実験設定に応じて適応させることが必要になる場合があります。 </li><li> 「露出時間」：次の設定を使用」、写真」のためのオート。 「ビニング」：ミディアム。および「F /ストップ」：8.「フィールドビューの「ドロップダウンメニュー用のtarget.Lookを画像化するに従って、「件名の高さ」を調整してください。初期設定は「C」でありますCとの間の「B」に変更します（14センチメートル距離アメーラと試料ステージ）。 </li></ol></li><li> 酸化剤から保護するために撮影室の床に黒い画用紙のシートに顕微鏡スライドを配置することによって、噴霧器を設定します。 [のRu（bpyで）3]の100μLdroplet（NH 4）の水溶液100μLでのCl 2 -溶液を混ぜる2のCe（NO 3）6.緑色のボックスの十字線を観察します。 <ol><li>関心領域は、試料ステージ上に表示される緑色のライトボックスの十字線の中央にあるように、黒画用紙に被写体を配置します。木製のサポートから、プラスチック製のスプレーボトルを取り外して噴霧器を準備します。そのプラスチック製のリザーバーに、木製のサポートにそれを再接続します（水/エタノール中3 1）のトリエチルアミンの溶液を埋めます。 </li><li>生物発光リーダーの内部噴霧器を配置し、電源コードがネブライザーコードから切り離されていることを確認します。その電源スイッチを確認してください上で、トグルスイッチがオフになっている、と赤色のLEDが点灯します。スプレーノズルヘッドによる被写体に向けてカメラからの眺め閉塞を最小限に抑えながら、噴霧流は、被写体上の関心領域に向かって指摘されるように噴霧器を置きます。 </li><li>スプレーからそれらを保護するために、任意の潜在的なホットスポット（顕微鏡スライドまたは注射部位に例えば、白マーク）の上に画用紙の小さな黒い駒を置きます。場所が撮像対象、噴霧器、または磁気ドアラッチと干渉しないように、撮像チャンバ内部ネブライザ遠隔コードの少なくとも40センチ、。イメージングシステムのドアを閉じます。 注：十字線がで設定」ビューのフィールド」に基づいてサイズを変更します」リビングイメージ; &quot;これは「B」に設定されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>撮像シーケンスを開始することにより画像を取得します。で、「取得」をクリックして「取得コントロールパネル。」第1の撮像sequ上レンスは、必要に応じて自動保存を有効にする（推奨）とデータフォルダを選択します。シーケンスの最後まで「編集イメージングラベル」ダイアログを無視します。 注：制御ソフトウェアは、機器のアクションは、ステップバイステップでリアルタイムに表示されます。測定を調製し、正しい位置に試料ステージを移動した後、それはカメラのシャッターを開き、測定時間をカウントします。シャッター開口部は、機械によって生成され、クリック音によって聞くことができます。 </li><li>化学発光を生成するために、トグルスイッチを3回切り替えることにより：シャッターが開くと、トリエチルアミンの溶液の3バースト（水/エタノールで3、スプレーバーストあたり0.24±0.04 mLの1）をスプレー。 注：試料ステージは、測定中に移動します。これを可能にするために、機器の内部に十分な（最小40センチメートル）ケーブルを残します。解決策は、上昇管によって熱望することができ、噴霧器によって噴霧されることと配管内に気泡がないことを確認します。いくつかの予備バッテリー含みを持っています必要な場合には準備ができてネブライザーのための。 </li></ol>全身静脈内注射後のin vivoイメージング3 <ol><li> 1.5 mlのマイクロ遠心管中で、[Ruの（BPY）3] Cl 2をナノモル8〜33を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液100μLを調製します。同時に、（NH 4）の水溶液2のCe（NO 3）水に6（25 mm）を準備します。 </li><li>静脈内に健康なマウスの尾静脈に[のRu（bpyで）3] Cl 2を100μLを注入した（n = 5）。 </li><li> CO 2窒息を介してマウスに注射後10分を安楽死させます。 <ol><li>心臓や肺を露出するようにU字状に肋骨弓を削除した後、胴体からYカットで皮膚を取り除きます。右心房にコンセントを切断し、左心室18に24ゲージの針を介してPBSの20mLのを注入することにより、マウスを灌流。慎重に腹を切って皮膚や腎臓および肝臓を露出させます。目に見えるカットを作成するために臓器を通って長手方向にカットします。 </li></ol></li><li> 以下の変更を行い、ステップ2.3から2.6に記載されているように買収を設定します。 <ol><li>十分ネブライザプラスチックリザーバを洗浄した後、代わりにトリエチルアミン水（NH 4）2の溶液のCe（NO 3）6（25ミリモル）でそれを埋めます。 注：徹底的に（NH 4）2 Ceの（NO 3）6は、いくつかの使用後にスプレーノズルを破壊する可能性を結晶化するので、使用するたびに、ネブライザーノズルを洗浄することが重要です。 </li></ol></li><li> 動物全体または器官のサンプルは、イメージングのために使用します。 <ol><li>腹部全体イメージングのために、カメラ、機器の背面を指して頭に直面して開いた腹部とマウスの死体を置きます。緑色のライトボックスの十字線で画像化される臓器（ 例えば、肝臓や腎臓）を中央に配置します。 </li><li> Fまたは臓器イメージングおよび定量個々の、イメージング装置からマウスを削除し、それを突き止めます。すでにオープンした体腔から出発し、内部器官（ 例えば、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、脳、および心臓）を切り出します。筋肉組織を切除するために後肢の皮膚を介してカットします。慎重に脳を切除するメスで頭蓋骨を開きます。 <ol><li>関心のある器官は、肝臓、腎臓、脾臓の場合は、縦方向に半分にすべての器官をカットし、黒画用紙のシャーレまたは片に各臓器を置きます。 </li></ol></li><li>単一臓器のための化学発光トレーサーの相対発光を確立するためのステップ2.3から2.6に記載されている手順に従ってください。 </li></ol></li></ol>リンパ節のin vivoイメージング4. <ol><li> [のRu（bpyで）3] Cl 2を80ナノモルを含むPBS溶液10μLを準備します。水溶液（NH 4）2 Ceと準備（NO 3）6ワシントン州同時にター（25 mM）の。 </li><li>健康なマウスの後肢に皮下溶液10μLを注入した（n = 5）。陰性対照として、純粋なPBSの10μLと反対側の足を注入。 15分注射後、CO 2窒息を介してマウスを生け贄に捧げます。膝窩リンパ節までのリンパ運河を露出するために、両方の後ろ足の皮膚を取り除きます。 </li><li>ステップ3.4で説明したように買収を設定します。 </li><li>定量化のために、両方の後肢からの膝窩リンパ節を除去半分にそれらを切断し、ペトリ皿上に酸化剤とそれらをスプレー、前述したように（ステップ3.5.3）。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、光学的、化学発光レポーターによって作成された光子の放出を介して組織の輪郭を描くことのできる技術を提示しています。他のとは対照的に、多くのこの化学発光レポーター系は、非放射性であり、非常に高感度レベルでの検出を容易に画像化プローブを用い、技術4、5、6、7、8、9、確立されました。おそらくもっと重要なのは、化学発光イメージングは自己蛍光を最小化し、大幅にバックグラウンドシグナルを減少させる特性、 図20（光学的蛍光イメージングのように）入射光源を必要としません。 ルテニウム記者[のRu（bpyで）3] Cl <su...

ここ数十年では、イメージング技術は、医師が病気を診断し、監視する方法に革命をもたらしてきました。これらのイメージング技術は、しかしながら、例えば、陽電子放射断層撮影（PET）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）、コンピュータ断層撮影（CT）、磁気共鳴イメージング（MRI）などの全身画像化システムに大きく制限されています。特に注意は、がんが注目されている、技術イメージングブレークスルーを大幅にこの病気を診断し、治療される方法を改善しています。手術室：これらの進歩にもかかわらず、これらのイメージング技術がちょうど収まりきらない一つの場所があります。全身イメージング技術は、手術計画に役立つことができますが、それらは一般的に、腫瘍組織の全てが除去された又は残留腫瘍組織を切除縁1に隠されたままかどうかを医師がリアルタイムで決定するのに役立つのに十分に高い空間分解能を欠いています。ノー浸潤がしていることを確認し腫瘍マージンが最も重要な外科的な目標の一つであり、外科医は、厳格かつ慎重な組織切除の間にタイトロープを歩く必要があります残されています。あまりに多くが除去されると、患者に対する望ましくない副作用が悪化します。少なすぎるが削除された場合、再発率は2、3に増加しています。したがって、正確な腫瘍のマージンを描くために重要であり、我々は、化学発光術中イメージングは​​、そうでなければ、確立された技術で検出されない状態になる可能性があり、悪性組織を可視化するために外科医を支援することにより、腫瘍のマージンの識別の精度を向上させるために助けることができると信じています。 現在術中イメージングシステムとしてのそれらの可能な有用性について研究されている多くのイメージング技術があります。これらは、β-およびγ線放出プローブ4、光学蛍光5、ラマン分光法6を含みます</sup&gt; 7、及びチェレンコフ発光8、9。しかし、今日まで、これらのいずれも、標準的な臨床ツールとして確立されていません。光学蛍光イメージングは​​、これまで、これらの技術の中で最も有望であることが判明している、したがって、最も探索されます。既に多くの用途のための貴重なツールであることが示されているが、それには限界がないわけではありません。確かに、その主な欠点は、本質的に自家蛍光生体組織によって生成されたバックグラウンド蛍光です。このバックグラウンド自己蛍光シグナルは、蛍光シグナルの生成に必要な外部光源により、フルオロフォアに加えて、周囲の組織の励起との積です。実用的な観点から、この自己蛍光は、潜在的に手術室では、この技術の有用性を制限することができる低信号対雑音比をもたらすことができます。 校長蛍光画像上の化学発光画像化の利点は、励起光が必要でないことです。その結果、バックグラウンド自己蛍光はありません。化学発光イメージングでは、励起エネルギーは、代わりに、化学的に生成されます。このプロセスには意図されないバックグラウンド信号を生成しないので、より高い信号対雑音比をもたらすことができます。これは、最終的に切除縁のより精密かつ正確に検出される可能性があります。やや驚くべきことに、術中イメージング技術として、このアプローチの有用性は、10未踏のままです。実際、この手法に最も近い例は、マウス11、12、13におけるミエロペルオキシダーゼによるルミノールの酸化です。化学発光生物医学イメージングは​​、したがって、次のような利点を提供できる研究のかなり未踏の領域です：ハイとローバックグラウンド信号が得られる（1）最小限の自家蛍光gher信号対雑音比。 （2）可視光から近赤外までの化学発光放出の調整可能な波長を、 （3）リンカ技術とすでに存在している標的とする生体分子と結合し、官能化化学発光錯体を、対象となる分子イメージングプローブ14の全体のライブラリへのアクセスを提供します。 この証明の原理研究は、ルテニウムベースの造影剤を使用して、生物医学的環境において化学発光画像化の潜在的な有用性を示しています。この化合物の化学発光特性は、よく1960年代半ば15にさかのぼる調査で、研究されています。化学的活性化の際に、薬剤は、医療用イメージングのために適している約600 nmの16の光を生成します。活性化エネルギーは、励起状態の水17 -follで650ナノ秒の寿命を有するに至る酸化還元反応によって提供されますこの励起状態の緩和時に光子の生成によって負っ。特別に設計されたリモートネブライザーの使用を介して、我々は、化合物の両方のエキソビボおよびインビボで検出することができました。最初の実験の結果は、この技術のさらなる調査を示唆し、非常に有望です。

<table><tbody><tr><td>木材部品A(12.5倍、2.5倍、1.8cm)</td><td>&nbsp;木工品</td><td>131404</td><td>3/4 "x 24" x 30 "白樺合板シート</td></tr><tr><td>木材部品B(12.7 &times; 10.7 &times; 1.8 cm)</td><td>木工品</td><td>131404</td><td>3/4 "x 24 " x 30 "白樺合板シート</td></tr><tr><td>木材部品C(11 &times; 2.5 & 1.8 cm)</td><td>木工品</td><td>131404</td><td>3/4 "x 24 "x 30&からカットrdquo;白樺合板シート</td></tr><tr><td>ネジ(4回; 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values 3オンスミニ噴霧器</td><td>ベッド、バス、ビヨンド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼棒(10 cm of 1/16 "鋼)</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>ペンシルクラシックHB</td><td>ペーパーメイト</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>ペーパークリップ</td><td>オフィスデポ</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>スピーカーケーブル</td><td>RCA株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AH1650SNエナジャイザー 9Vアルカリ乾電池</td><td>エナジャイザーホールディングス株式会社</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG マイクロ サーボ モーター、出力トルク 3.4 kg/cm @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>28センチメートルプラスチックケーブルタイ</td><td>ゼネラルエレクトリック株式会社</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>ダクトテープ</td><td>(株) 3M</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1</td><td>ワイヤーlittleBits株式会社</td><td>w1線</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 power</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 power</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 トグルスイッチ</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 トグルスイッチ</td><td></td></tr><tr><td>littleBits 011 servo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011サーボ</td><td></td></tr><tr><td>20 cmプラスチック被覆ワイヤーツイストタイ</td>フォー<td>スタープラスチック71TIE8000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス(2,2&プライム;-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)六水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>硝酸アンモニウムセリウム(IV)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>バクスターヘルスケア</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>シグマ-アルドリッチ株式会社</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td>は、Milipore Mili-Q (R &ge; 18 M&Omega;) を使用して精製されました。</td></tr><tr><td>雌ヌード(近交系)マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>1929</td>年<td>、5〜6週間</td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU/J雄マウス&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>age 6 &ndash; 8 週間</td></tr><tr><td>IVIS 200 生物発光リーダー</td><td>Caliper Live Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 ソフトウェア</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

術中イメージング技術は、外科的介入をより安全で効果的なものにする可能性を秘めています。これらの理由から、そのような技術は急速に手術室に移行しています。ここでは、術中イメージングでまだ探求されていない技術である化学発光イメージングを利用する新しいアプローチを紹介します。この方法では、ルテニウムベースの化学発光レポーターと特注のネブライザーシステムを使用して、高いS/N比でex vivoまたはin vivoの画像を生成します。ルテニウムベースのレポーターは、酸化水溶液に曝露し、周囲の組織内で再還元した後、光を生成します。この方法により、6.9 pmol/cm2という低いレポーター濃度を検出することができました。この研究では、マウスの皮下注射および静脈内注射を含む概念実証のin vivo研究の視覚的なガイドを紹介します。この結果は、この技術がさらなる前臨床研究の有望な候補であり、最終的には手術室で有用なツールになる可能性があることを示唆しています。

プロトコル項1に記載のネブライザーシステムは、低コストで容易に入手可能な材料から構成することができます。リモートトリガ生物発光リーダー（ 図1）の内部に還元/酸化剤の噴霧用のインセットであることが意図されます。私たちのデザインは、レンズ〜14センチの距離での生物発光リーダー内の噴霧器の安全な操作を可能にします。レンズのない曇りやボケは、動作中に観察されませんでした。我々は、市販の化学発光剤[のRu（bpyで）3]、その低価格に基づいて提案手法の開発のためのCl 2、水溶液、十分に記載の酸化還元挙動、および化学発光特性の安定性（ 図 2）19を選択しました。 [のRu（bpyで）3] Cl 2の（100μLの1滴を酸化することにより、プロトコル部2に記載されているように、最小の検出可能な信号を決定することができる6.9 pmol- 34H ...

このプロトコルは、ルテニウム錯体を化学発光発光源として使用する新しい術中イメージング技術を説明しています。これにより、in vivoイメージング中に高い信号対雑音比が生成されます。術中イメージングは、外科的処置の実施方法に革命をもたらす可能性のある拡大している分野です。

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

このプロトコルの全体的な目標は、S/N比と検出限界の点で既存の光学技術よりも利点を提供できる、新しい前臨床の相互運用化学発光イメージング技術を提供することです。この方法は、生物科学に関連する多くの分野で、従来の光学イメージング技術ではアクセスできなかった重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、信号対雑音比が高く、瞬時の光も放射も必要としないことです。つまり、この技術の意味は、この技術が提供する高いS/N比により、がんを含む複数の疾患状態の相互手術イメージングにまで及ぶことがわかりました。この手法には入射光は必要ないため、入射光の吸収に問題はありません。さらに、化学発光コア分子を官能基化するために利用できる大きな化学ツールボックスがあります。手順を開始するには、逆浸透水にトリス(ビピリジン)ルテニウム(II)クロリドの100マイクロリットルの標準溶液を準備します。次に、各標準試料を、顕微鏡スライド上の逆浸透水中の硝酸セリウムアンモニウム溶液の25ミリモル溶液100マイクロリットルと組み合わせます。生物発光リーダーイメージングソフトウェアを開き、[初期化]をクリックします。イメージングモードでは、発光と写真がチェックされ、蛍光がチェックされていないことを確認してください。発光露光時間、ビニング、f /ストップ、および発光フィルターのパラメーターを設定します。写真の露光時間、ビニング、f/ストップのパラメータを設定します。次に、撮像するサンプルに応じて被写体の高さを設定します。カメラとサンプルステージの間の距離を14cm離すように、視野をBに設定します。サンプルステージの生物発光リーダーイメージングチャンバーの床を黒い画用紙で覆います。次に、標準混合物の液滴を含む最初のスライドを、液滴が緑色のライトボックスの十字線の中央にあるサンプルステージに置きます。次に、特注のネブライザーの3オンスのスプレーボトルに、水とエタノールの50/50溶液にトリエチルアミンの1:3溶液を入れます。吸引パイプに気泡がないことを確認してください。噴霧ノズルを撮像する液滴に向け、カメラが液滴のビューを妨げないように、ネブライザーアセンブリをイメージングチャンバーに置きます。ネブライザーの電源スイッチと電源インジケーターがオンになっており、磁気トグルスイッチがオフになっていること、および電源ネブライザーとリモートコードが絡まっていないことを確認します。スライド上のマークなどのホットスポットを黒い画用紙で覆います。ネブライザーのリモートコードの少なくとも40センチメートルをイメージングチャンバーに配置します。ネブライザーコードを圧着せずにチャンバードアを静かに閉めます。装置ソフトウェアで、「取得」をクリックし、自動保存を有効にして、データファイルのパスを設定します。イメージングシーケンスを開始します。シャッターがカチッという音で開いたら、ネブライザーのトグルを3回切り替えて、トリエチルアミン溶液を3回サンプルに噴霧します。各標準スライドでこの手順を繰り返して、ルテニウム造影剤の最小検出可能濃度を決定します。in vivoイメージング手順を開始するには、リン酸緩衝生理食塩水に8〜33ナノモルの塩化トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)を含む溶液を100マイクロリットル調製します。硝酸セリウムアンモニウムの25ミリモル水溶液を準備します。次に、ルテニウム造影剤100マイクロリットルを健康なマウスの尾静脈に静脈内注射します。注射の10分後にマウスを二酸化炭素窒息により犠牲にします。Y字型に切って胴体から皮膚を切除し、次に肋骨弓を切除して心臓と肺を露出させます。右心房に出口を切り取り、24ゲージの針を通して20ミリリットルのPBSを左心室に注入します。腹部の皮膚を切り裂き、腎臓と肝臓を露出させます。関心のある臓器が肝臓、腎臓、または脾臓である場合は、臓器を目に見える縦方向に切り込みます。生物発光リーダーソフトウェアで新しいイメージングシーケンスを調製します。腹部全体のイメージングを行うには、マウスをイメージングチャンバーに入れ、開いた腹部をカメラに向けて、頭を機器の背面に向けてください。目的の臓器を緑色のライトボックスの十字線の中央に配置します。スプレーボトルとノズルをネブライザーアセンブリから完全に洗い流し、ボトルに硝酸セリウムアンモニウム溶液を充填します。ネブライザーをイメージングチャンバーに配置し、スプレーノズルをイメージングサイトに向けます。カメラが遮られていないこと、コードが絡まっていないこと、リモートコードの少なくとも40センチメートルがチャンバー内にあることを確認してください。チャンバーを閉じて、イメージングシーケンスを開始します。カチッとシャッターが開くので、トグルを3回切り替えて、酸化剤を3回噴射します。イメージング後、ネブライザーアセンブリを取り外し、スプレーノズルを十分にすすいで、硝酸セリウムアンモニウムの結晶化を防ぎます。その後の個々の臓器のイメージングと定量のために、マウスを機器から取り外し、開いた体腔から内臓器を切除します。後肢の皮膚を切開して、筋肉組織サンプルを切除します。目的の臓器が肝臓、腎臓、または脾臓の場合は、臓器を縦半分に切ります。次に、オルガンをペトリ皿または黒い画用紙の上に置きます。動物全体と同じように各臓器を画像化し、各シーケンスの後にスプレーノズルをすすぎます。この手順では、マウスにルテニウムベースの造影剤を注入し、目的の組織に酸化剤を噴霧して化学発光を誘導しました。これらの条件下では、造影剤の最小検出可能濃度は6.9ピコモル/センチメートル二乗であると決定された。目的の臓器の白色光画像での化学発光は、生物発光リーダーで取得しました。化学発光シグナルは、静脈注射後の腎臓で主に観察され、親水性のトリス(ビピリジン)ルテニウム(II)カチオンの腎排泄を示しました。造影剤とPBS単独のS/N比は、腎臓で27:1、肝臓で21:1でした。マウス膝窩リンパ節も、ルテニウムベースの造影剤のより濃縮された溶液の皮下注射で評価されました。造影剤を含むリンパ節は、PBSのみを含むリンパ節よりも有意に大きな輝度を示しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を試みる際には、周囲光を除外し、ルテニウムトリスbpyによる汚染を避けることを忘れないでください。この技術の開発後、この技術は、生体分子イメージングの分野の研究者がマウスのがんなどの疾患状態を調査する道を開くことになります。この手法は、従来の光学イメージング技術ではアクセスできなかった問題に対する洞察を得ることができますが、従来の技術で調査できた問題は、化学発光で対処できる可能性があります。

a-novel-technique-for-generating-observing-chemiluminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。...

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

ここに我々は彼らの成長と転移時に転移性乳癌細胞で発現ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ酵素の両方の生物発光反応を構築可視化し、定量化するための方法を説明...

生体デュアル基質生物発光イメージングにおける

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

この記事はの管理について説明し...

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

このビデオでは、薬物の高感度かつ迅速なスクリーニングのための生物発光アッセイの有用性を強調する方法について説明します。これらの薬剤は、単独で、または組み合わせて試験して、作用機序の相乗効果を評価することができます。...

細胞生物発光ベースのアッセイ:コンビナトリアル薬物スクリーニングのためのハイスループット法

細菌性生物発光遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞（...

細胞毒性の継続とリアルタイム監視のための自律的に生物発光哺乳類細胞

タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。...

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

関連する原則を調査し、フルオロフォアおよび抗体標的条件は多岐との互換性を実証することによって発光（燃料）から未励起によって蛍光の基礎と応用性を拡大しています。...

BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ)...

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

発光細菌クオラムセンシングなどのメカニズムのさまざまな光の生産を調節します。この手法では、生物発光における原位置調査および細胞密度に発光の相関をことができます。人工の発光性大腸菌システムはluxオペロン、ルクスのタンパク質及びその相互作用の特性をことができます。...

その場で測定と細胞密度の相関、発光細菌の発光

小分子基質であるルシフェリンを酸化するルシフェラーゼ酵素によって放出される生物発光光は、光感覚タンパク質を活性化するために利用することができ、それによって光刺激に別の次元を加え、時間的および空間的スケールにわたって細胞内の多数の光媒介機能の操作を可能にする。...

生物発光光遺伝学2.0:生体内および生体内で光感覚タンパク質を活性化するための生物発光の利用

学ぶルテニウム錯体を用いた新規化学発光イメージング手法。侵襲的手術中の高S/N比による生体内イメージングで、従来の光学技術では困難だった病態観察を可能にし、がんなどの疾患研究に応用できます。

生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術

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