生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術

このプロトコルの全体的な目標は、S/N比と検出限界の点で既存の光学技術よりも利点を提供できる、新しい前臨床の相互運用化学発光イメージング技術を提供することです。この方法は、生物科学に関連する多くの分野で、従来の光学イメージング技術ではアクセスできなかった重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、信号対雑音比が高く、瞬時の光も放射も必要としないことです。

つまり、この技術の意味は、この技術が提供する高いS/N比により、がんを含む複数の疾患状態の相互手術イメージングにまで及ぶことがわかりました。この手法には入射光は必要ないため、入射光の吸収に問題はありません。さらに、化学発光コア分子を官能基化するために利用できる大きな化学ツールボックスがあります。

手順を開始するには、逆浸透水にトリス(ビピリジン)ルテニウム(II)クロリドの100マイクロリットルの標準溶液を準備します。次に、各標準試料を、顕微鏡スライド上の逆浸透水中の硝酸セリウムアンモニウム溶液の25ミリモル溶液100マイクロリットルと組み合わせます。生物発光リーダーイメージングソフトウェアを開き、[初期化]をクリックします。

イメージングモードでは、発光と写真がチェックされ、蛍光がチェックされていないことを確認してください。発光露光時間、ビニング、f /ストップ、および発光フィルターのパラメーターを設定します。写真の露光時間、ビニング、f/ストップのパラメータを設定します。

次に、撮像するサンプルに応じて被写体の高さを設定します。カメラとサンプルステージの間の距離を14cm離すように、視野をBに設定します。サンプルステージの生物発光リーダーイメージングチャンバーの床を黒い画用紙で覆います。

次に、標準混合物の液滴を含む最初のスライドを、液滴が緑色のライトボックスの十字線の中央にあるサンプルステージに置きます。次に、特注のネブライザーの3オンスのスプレーボトルに、水とエタノールの50/50溶液にトリエチルアミンの1:3溶液を入れます。吸引パイプに気泡がないことを確認してください。

噴霧ノズルを撮像する液滴に向け、カメラが液滴のビューを妨げないように、ネブライザーアセンブリをイメージングチャンバーに置きます。ネブライザーの電源スイッチと電源インジケーターがオンになっており、磁気トグルスイッチがオフになっていること、および電源ネブライザーとリモートコードが絡まっていないことを確認します。スライド上のマークなどのホットスポットを黒い画用紙で覆います。

ネブライザーのリモートコードの少なくとも40センチメートルをイメージングチャンバーに配置します。ネブライザーコードを圧着せずにチャンバードアを静かに閉めます。装置ソフトウェアで、「取得」をクリックし、自動保存を有効にして、データファイルのパスを設定します。

イメージングシーケンスを開始します。シャッターがカチッという音で開いたら、ネブライザーのトグルを3回切り替えて、トリエチルアミン溶液を3回サンプルに噴霧します。各標準スライドでこの手順を繰り返して、ルテニウム造影剤の最小検出可能濃度を決定します。

in vivoイメージング手順を開始するには、リン酸緩衝生理食塩水に8〜33ナノモルの塩化トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)を含む溶液を100マイクロリットル調製します。硝酸セリウムアンモニウムの25ミリモル水溶液を準備します。次に、ルテニウム造影剤100マイクロリットルを健康なマウスの尾静脈に静脈内注射します。

注射の10分後にマウスを二酸化炭素窒息により犠牲にします。Y字型に切って胴体から皮膚を切除し、次に肋骨弓を切除して心臓と肺を露出させます。右心房に出口を切り取り、24ゲージの針を通して20ミリリットルのPBSを左心室に注入します。

腹部の皮膚を切り裂き、腎臓と肝臓を露出させます。関心のある臓器が肝臓、腎臓、または脾臓である場合は、臓器を目に見える縦方向に切り込みます。生物発光リーダーソフトウェアで新しいイメージングシーケンスを調製します。

腹部全体のイメージングを行うには、マウスをイメージングチャンバーに入れ、開いた腹部をカメラに向けて、頭を機器の背面に向けてください。目的の臓器を緑色のライトボックスの十字線の中央に配置します。スプレーボトルとノズルをネブライザーアセンブリから完全に洗い流し、ボトルに硝酸セリウムアンモニウム溶液を充填します。

ネブライザーをイメージングチャンバーに配置し、スプレーノズルをイメージングサイトに向けます。カメラが遮られていないこと、コードが絡まっていないこと、リモートコードの少なくとも40センチメートルがチャンバー内にあることを確認してください。チャンバーを閉じて、イメージングシーケンスを開始します。

カチッとシャッターが開くので、トグルを3回切り替えて、酸化剤を3回噴射します。イメージング後、ネブライザーアセンブリを取り外し、スプレーノズルを十分にすすいで、硝酸セリウムアンモニウムの結晶化を防ぎます。その後の個々の臓器のイメージングと定量のために、マウスを機器から取り外し、開いた体腔から内臓器を切除します。

後肢の皮膚を切開して、筋肉組織サンプルを切除します。目的の臓器が肝臓、腎臓、または脾臓の場合は、臓器を縦半分に切ります。次に、オルガンをペトリ皿または黒い画用紙の上に置きます。

動物全体と同じように各臓器を画像化し、各シーケンスの後にスプレーノズルをすすぎます。この手順では、マウスにルテニウムベースの造影剤を注入し、目的の組織に酸化剤を噴霧して化学発光を誘導しました。これらの条件下では、造影剤の最小検出可能濃度は6.9ピコモル/センチメートル二乗であると決定された。

目的の臓器の白色光画像での化学発光は、生物発光リーダーで取得しました。化学発光シグナルは、静脈注射後の腎臓で主に観察され、親水性のトリス(ビピリジン)ルテニウム(II)カチオンの腎排泄を示しました。造影剤とPBS単独のS/N比は、腎臓で27:1、肝臓で21:1でした。

マウス膝窩リンパ節も、ルテニウムベースの造影剤のより濃縮された溶液の皮下注射で評価されました。造影剤を含むリンパ節は、PBSのみを含むリンパ節よりも有意に大きな輝度を示しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。

この手順を試みる際には、周囲光を除外し、ルテニウムトリスbpyによる汚染を避けることを忘れないでください。この技術の開発後、この技術は、生体分子イメージングの分野の研究者がマウスのがんなどの疾患状態を調査する道を開くことになります。この手法は、従来の光学イメージング技術ではアクセスできなかった問題に対する洞察を得ることができますが、従来の技術で調査できた問題は、化学発光で対処できる可能性があります。