Name: セル形状変化のイメージングと細胞運動でショウジョウバエ原腸陥入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: 学ぶショウジョウバエ原腸陥入における細胞形状変化と運動のライブイメージング手法。頂端収縮と細胞再配列を可視化し、発生生物学における形態形成運動の理解を深める。

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この研究は、アステラス代謝障害研究財団(HT)、武田科学振興財団(HT)、および文部科学省私立大学戦略研究財団(HT)の支援を受けて行われました。

注：DE-CAD :: GFP 10：本研究で使用したトランスジェニックハエは、以下のものが挙げられます。 アップルプレートの調製<ol><li>電子レンジで12.5グラム寒天、125 mLの100％市販のリンゴジュース、12.5グラムのグルコース、および375mLのH 2 Oの熱混合物の混合物を準備し、3センチメートル細胞培養皿にそれを注ぎます。将来の使用のために4℃で混合物を保管してください。 </li><li>リンゴのプレートを準備した後、ハエが卵を産むことができるように、その上に混練した酵母ペーストの薄い層を追加します。 </li></ol> 2.胚の調製とライブイメージングプロトコル<ol><li>交尾し、その後混練酵母に覆われたリンゴのプレート上で一晩卵を産むために瓶の中に約50ハエ（25人の男性と25人の女性）を配置します。瓶の口にリンゴジュースのプレートを設定します。 インキュベーター中で逆さまにボトルを保管してください。目を促すためにアルミホイルでプラスチックショウジョウバエストックボトルを包みますeはより多くの卵を産むために飛びます。 </li><li>翌朝は、新しいものと古いリンゴジュースのプレートを交換してください。 </li><li>ハエはアルミホイルで瓶を包むことにより、3〜4時間の卵を産むしてみましょう。 </li><li> 3〜4時間後、ブラシや綿悪いを使用して、リンゴジュースのプレートから胚ストレーナーで胚を収集し、PBSでそれらを洗ってください。 12ウェル培養皿に胚をPBSで2〜3回洗浄します。 </li><li> 12ウェル培養皿中で5分間、50％の漂白剤を用いて胚をDechorionate。 </li><li> dechorionationプロセスの後、PBSで胚を2〜3回洗浄します。 </li><li>国境での透明性のレベルに基づいて、PBSを選択し、ステージ顕微鏡下で5胚を含む3センチメートル細胞培養皿に胚を移します。 200μLのピペットチップを使用して段階的な胚をピペット。 </li><li>次に、ガラスカバースリップ上で選択した2つの胚を置き、細かくねじれたティッシュペーパーで余分なPBSを除去します。オリエント胚は、最大のサイド背側細かくねじれたティッシュペーパーを使用してカバースリップ。その後、微細な針とねじれたティッシュペーパーを用いてシリコングリスをカバーガラスに胚を添付します。 </li><li>スライドの下部にあるいくつかのスペースを残して、胚のハロカーボン油700の小滴を追加し、逆さまにインデントスライド上の胚を含むカバースリップを配置。 </li><li>共焦点イメージングシステム、アルゴン/ 488レーザー、油浸対物レンズ（63X）を使用して胚を調べます。 注：適切な発達段階での胚の識別は、原腸陥入イベントの画像をキャプチャすることが重要です。これらの条件下では、ほとんどすべての胚を分析胚が大人として成長するために、さらに培養することができる少なくともステージ14まで正常に発育観察します。 </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

Drosophilla1の原腸陥入過程のライブ画像を撮影する同様の手順を以前に報告しましたが、ここで説明する方法は詳細で内因性カドヘリン発現を追跡しやすいため、原腸陥落に関与する重要な因子の遺伝子スクリーニングに非常に役立ちます。このイメージング手順の成功を最大化するには、インデントされたスライドを使用することが不可欠です。機械的圧力は時々胚死を引き起こします。したがって、機械的ストレスは胚原腸陥入のプロセスを混乱させる可能性があるため、胚をできるだけ穏やかに扱うことも重要です。胚固定中に適切な量のグリースを使用すると、ライブイメージング手順の結果がさらに向上します。
胚の脱毛毛と選択の両方が迅速に行われるようにすることが、このプロトコルで成功するための重要な要素です。この手順で結果を最大化するには、完全に乾燥する前に細い針を使用して胚を接着することも不可欠です。胚を固定した後、DE-カドヘリンで標識されたGFPを共焦点顕微鏡で検査します。ライブイメージング実験では、画像は 10 秒ごとに 30 分未満で撮影されました1...

原腸形成は、 ショウジョウバエ 1,2などの多細胞動物の胚発生中に発生する形態学的に動的なイベントの最初のセットです。興味深いことに、証拠出現すると、このプロセスは、機械的および分子機構3との間の相互作用を介して調節されることを示唆しています。また、原腸形成において重要なプロセスである間葉移行（EMT）、上皮はまた、癌転移4-8、ヒト疾患過程に関与しています。このように、頂端収縮を制御する多くの遺伝子はまた、癌転移9で観察されたEMTにおいて重要な要因であることが知られています。このように、原腸陥入時の根尖狭窄は、前述の調節メカニズムを調査すると癌転移の我々の理解を高めるための優れたモデルです。この技術の利点は、我々はリアルタイムで原腸陥入時の細胞運動を観察することができ、したがって、私たちはなるということです原腸形成だけでなく、癌の転移に関与する遺伝子をスクリーニングすることができます。 比較的未知のが、細胞-細胞接着は、頂端狭窄1において中心的な役割を果たしていると考えられています。 ショウジョウバエの遺伝学は、規制分子メカニズムを探求する単一細胞レベルの研究に適しています。このモデルは、原腸陥入時の頂端収縮の重要性を明らかにすることが可能となります。また、この方法は、癌の転移に関与する遺伝子をスクリーニングするために使用することができます。 ショウジョウバエの原腸形成のライブ画像をキャプチャすること、さらに、より詳細に組織再編成を支配する分子メカニズムを理解することができました。ここで、我々はこれを達成するための簡単な方法の包括的な説明を提供します。

<table><tbody><tr><td>ハロカーボンオイル 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>真空グリース シリコン</td><td>ベックマン</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ&nbsp;</td><td>松波ガラス</td><td>厚さNo1</td><td>24 - 36 mm</td></tr><tr><td>胚stariner</td><td>Corning</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックドロソフィラストックボトル</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Cadherinノックインフライ</td><td></td><td></td><td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

セル形状変化のイメージングと細胞運動でショウジョウバエ原腸陥入

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

原腸形成は、 ショウジョウバエのような多細胞動物の胚発生中に発生する形態学的に動的なイベントの最初のセットです。この形態学的変化はまた、間葉移行（EMT）に上皮として認識されています。 EMTの調節不全は、線維症および癌転移に関連しています。 EMTは、分子機構の数によって制御されることを出現の証拠があります。このように、頂端収縮を制御する多くの重要な遺伝子はまた、癌転移で観察されたEMTにおいて重要な要因であることが知られています。 ショウジョウバエの原腸形成の間にEMTのように、上皮細胞は、その形状を変更するように誘導することができ、様々な他の細胞型に向けて細胞の運命をリダイレクトするように再プログラムされます。ここでは、胚発生のこの段階の間に形態形成の細胞運動の開始と細胞運命の識別をアッセイするために、ショウジョウバエの原腸陥入の堅牢な撮像方法を提供します。この方法を使用して、我々は、cを識別しますエル原腸陥入時の再配列およびGFPを用いて、原腸陥入時の頂端収縮の重要性を実証するには、DEカドヘリンを標識しました。

ここでは、ショウジョウバエの胚の原腸陥入のイベントや胚の調製手順の概要（ 図1）を示します。細胞膜は、DE-カドヘリン:: GFPおよび細胞運動のライブイメージングは、 ショウジョウバエにおいて原腸形成の時点で行われる（ 図2）を用いて標識されます。 DEカドヘリンGFPのハエは、私たちは細胞接着接合を可視化することを可能にしますので、我々はこのシステムを使用して、頂端細胞の形状や動きを追跡することができます。さらに重要なことは、このシステムはまた、私たちは、内因性のDEカドヘリンの発現パターンをトレースすることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54764/54764fig1.jpg"> 図1：胚の準備手順の総括。 A）産卵のためにハエを設...

ここでは、ショウジョウバエの原腸陥入のライブ画像を撮影する手順を説明します。これにより、初期発生に関与する頂端狭窄をより深く理解し、組織構造修飾中の細胞の動きを支配するメカニズムをさらに解析することが可能になりました。

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの原腸陥入中の細胞の形状と動きをよりよく理解することです。ここでは、胚発生のこの段階での形態形成細胞運動の開始をアッセイするために、ショウジョウバエの原腸陥入の堅牢な測定方法を提供します。この技術の主な利点は、原腸陥入時の細胞再配列を、原腸陥入中の頂端狭窄とともに特定できることです。実験を開始するには、375ミリリットルの水の混合物を準備します。125ミリリットルの100%市販のリンゴジュース。 12.5グラムの寒天。12.5グラムのブドウ糖。次に、寒天が溶けるまで電子レンジで混合物を加熱します。そして、それを3cmの細胞培養皿に注ぎます。将来の使用のために、混合物を摂氏4度で保管します。りんご皿を準備した後、ハエが卵を産むことができるように、その上に練り込んだイーストペーストの薄層を追加します。練り酵母で覆われたリンゴ皿の上のボトルに25匹のオスと25匹のメスのハエを置きます。プラスチック製のショウジョウバエのストックボトルをアルミホイルで包み、ハエがさらに卵を産むように促します。ボトルを逆さまにしてインキュベーターに一晩置いておきます。翌朝、リンゴジュースプレートを新しいものと交換します。次に、ボトルをアルミホイルで包み、ハエが3〜4時間産卵するのを待ちます。ハエが卵を産んだら、綿棒で皿から卵をほぐします。胚をストレーナーに集め、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗います。12ウェル培養皿で、PBSで胚をさらに3回洗います。胚を50%漂白剤で12ウェル培養皿で脱角化します。デコレーションプロセスに続いて、PBSで胚をさらに3回洗浄します。PBSを含む3cmの細胞培養皿に胚を移します。そして、顕微鏡下でステージ5の胚を、その境界の透明度に基づいて選択します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、病期胚を採取します。次に、選択した2つの胚をガラスカバースリップに置き、ティッシュペーパーで余分なPBSを取り除きます。細かくねじったティッシュペーパーで、胚の背側をカバースリップに向けてください。次に、細い針を使用して、胚をシリコングリースでガラスカバースリップに取り付けます。胚上に中空カーボンオイル700の小滴を加え、胚を含むカバーガラスを逆さまにしてインデントスライドの上に置きます。スライドの下部にスペースを残します。次に、カバースリップをスライドに貼り付けます。最後に、共焦点イメージングシステム、アルゴン488レーザー、および油浸対物レンズを使用して胚を検査します。DE-cadherin GFPを使用して、500秒にわたる細胞移動のライブイメージングからタイムラプス画像を撮影し、原腸陥入中のショウジョウバエの個々の細胞の頂端領域を分析しました。500秒で、頂端の狭窄と陥入がはっきりと見えます。私たちの方法を使用して。さらに、ショウジョウバエの原腸陥入、およびがんの転移に関与する上皮から間葉への移行の分子メカニズムを理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、開発の初期段階はよくイメージングアプローチに適している細胞の形状の変更の数によって特徴付けられる。この記事では、ショウジョウバエの胚のライブ共焦点イメージングに必要な基本的なツールと方法を説明します、そして細胞化と呼ばれる細胞の形状変化に焦点を当てます。...

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

ここでは、蛹の完全除去を含む、蛹期の ショウジョウバエ...

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

学ぶショウジョウバエ原腸陥入における細胞形状変化と運動のライブイメージング手法。頂端収縮と細胞再配列を可視化し、発生生物学における形態形成運動の理解を深める。

セル形状変化のイメージングと細胞運動でショウジョウバエ原腸陥入

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