Name: からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ天然物の生合成遺伝子クラスター同定法。抗生物質活性を持つ化合物を精製し、ゲノムマイニングで遺伝子クラスターを特定する手法をStreptomyces diastatochromogenesを用いて解説。抗生物質発見に有用です。

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S. Zhang は、China Scholarship Council によって資金提供を受けています。著者らは、この研究室でポリケトマイシンプロジェクトに携わった元方々、そしてポリケトマイシン生産者を提供してくださったテュービンゲン大学のHans-Peter Fiedler教授に大変感謝しています。この研究はDFG(RTG 1976)の支援を受けました。

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<li>Kalan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryptic+polyene+biosynthetic+gene+cluster+in+Streptomyces+calvus+is+expressed+upon+complementation+with+a+functional+bldA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene.</a> Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).</li>
<li>Gessner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+Biosynthetic+Profiles+by+Expressing+bldA+in+Streptomyces+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains.</a> ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このラボでは、ストレプトミセスdiastatochromogenesのゲノムコスミドライブラリーが生成され、非常に時間のかかるプロセスを経てpolyketomycin遺伝子クラスターの同定、その結果、何年も前にスクリーニングしました。単一の遺伝子の特徴付けは、標的遺伝子の欠失と、得られた変異体12の分析を使用して可能でした。最近、 エス・diastatochromogenesのドラフトゲノム配列はpolyketomycin生合成遺伝子クラスターの高速同定を可能に得られました。ドラフトゲノム配列は、まだ多くのコンティグが含まれていますが、我々は簡単に、生合成遺伝子を検出することができました。記載された方法はヶ月以内に達成することができます。しかし、この手順は多くのステップを含みます。シングルステップは、その後の工程への進行を防止、数回失敗することがあります。 ストレプトマイセス属の生物活性化合物を生成するその能力のために知られています。彼らはしばしば20以上の経歴を運ぶながら、ynthetic遺伝子クラスターは、通常、1つまたは2つの化合物は、実験室条件下で製造されます。サイレント遺伝子クラスターをウェイクアップするOSMACアプローチ（さまざまな条件の下で1株の栽培）の適用は、時には十分ではありません。このような多面的な調節遺伝子ADPA 44とbldA 45,46などの調節遺伝子の遺伝子操作は、他の二次代謝産物の産生を活性化するための有効な方法です。 NMR分析により、例えば 、化合物の構造の解明については、精製された化合物の通常以上の2mgが必要です。そのため、10以上のL培養液の発酵はしばしば必要とされます。酸素、pHおよび温度条件を維持することができる発酵槽がなければ、文化やその後の抽出のこの量を処理するために、小さな研究室で挑戦されることがあります。精製中に、化合物は、酸化による、放射線や温度に変化させてもよいです。また、多くの精製工程が高く、分解の可能性を使用しています。 天然物の構造、およびゲノム内のクラスタを分析するとき、時には適切なクラスタを識別することは容易ではありません。唯一のドラフトゲノム配列がある場合はまず、クラスタの一部が失われることがあります。第二に、生合成に必要とされていない全ての遺伝子は、クラスタ内にあります。第三に、時々クラスタは、多くのキロベースにより互いに分離2つの部分に分割されます。第四に、適切な遺伝子クラスターであるかを決定することは困難です。モジュールの数に基づいて、延長部の数を計算し、あるいは、選択領域の解析によって、単一のエクステンダー単位を特定することができる大型PKS I型またはNRPS系の場合には簡単になります。しかし、反復作業酵素の場合に合成した化合物の予測は、特にストラ場合、しばしば不可能です中には40以上の遺伝子クラスターを持っています。第五に、自然は非常に複雑で、まだ未知の化合物がいっぱいです。多くの場合、生合成は、異なる経路の混合物です。新規化合物はまだ同定、またはしない他の化合物に関連していない場合には、クラスタを識別するために生合成のモデルを提案し、それを証明することは困難です。 クラスタが識別されると、単一のクロスオーバー技術は、仮説を検証するために良いと迅速な方法です。 PCRは、自殺ベクター、抱合、陽性クローンの選択、産生アッセイへのクローニングに必要な唯一のステップです。この技術の一つの欠点は、染色体へのベクターの組込みを伴うさらなる組換え事象に安定していないということです。したがって、さらなる単一の遺伝子を分析するために、正確な遺伝子欠失が必要です。また、遺伝子レベルでストレプトミセス株を操作するためにトリッキーなことがあります。 記載された手順は、Tを割り当てることができストレプトミセス株または他の微生物によって産生される任意の他の化合物O。生合成遺伝子クラスターとその合成された化合物についての知識は、私たちに多剤耐性病原体との戦いのためにそれらを改善する目的で、既存の分子を修飾するためのさらなる機会を提供します。

植物や微生物由来の天然物は、常に臨床薬剤開発や研究のための重要な源となっています。最初の抗生物質ペニシリンは、アレクサンダー・フレミング1によって菌から1928年に発見されました。今日、より多くの天然物は、臨床治療に使用されます。 異なる生物活性との二次代謝産物の様々な種類を生産する能力のために知られている一つの属は、Streptomycesです。 ストレプトマイセスは、グラム陽性菌であり、放線菌のクラスと放線菌目に属します。臨床的に使用される抗生物質のほぼ三分の二は、3またはテトラサイクリン4ダプトマイシン、アムホテリシン2のように、主にストレプトミセスから、放線菌由来しています。二つのノーベル賞は、 ストレプトミセス抗生物質研究の分野で授与されています。第1は、ストレプトマイシンの発見、最初のANのためセルマン・ワクスマンに行ってきました結核に対して有効tibiotic。 5 2015年、医学生理学でのノーベル賞の一環として、S。アベルミチリスからのアベルメクチンの発見は、同様に授与されました。アベルメクチンは、寄生虫疾患6,7の治療のために使用されます。 そのようなストレプトマイセスなどの微生物で天然物の発見のための伝統的なアプローチは、一般に、異なる増殖条件下で菌株の栽培だけでなく、二次代謝産物の抽出と分析を含みます。生物活性アッセイ（抗菌および抗癌活性についてのアッセイなど ）は、化合物の活性を検出するために行われます。最後に、目的の化合物を単離し、化学構造が解明されています。 天然産物の構造は、多くの場合、複雑な分子を形成している単一の部分から構成されています。圏の構築につながるいくつかが、限られた、主要な生合成経路があります。天然物の生合成のために使用されるKS、。主要な生合成経路は、糖部分に至るポリケチド経路、アミノ酸を用いテルペノイドおよびアルカロイド、経路に至る経路、および経路です。各経路は、特定の酵素8のセットによって特徴付けられます。化合物の構造に基づいて、これらの生合成酵素を予測することができます。 最近では、次世代シーケンシングとバイオインフォマティクス解析と組み合わせた化合物の詳細な構造解析が責任を生合成遺伝子クラスターを識別するのに役立ちます。クラスタ情報は、さらに、天然物の研究のための新しい方法を開きます。これは、天然の生成物の収率を増加させるための異種発現を含む、遺伝子欠失もしくは改変、および他の経路からの遺伝子と組み合わせ生合成により化合物の修飾を標的。 Polyketomycinは、培養ブロスから独立して単離しました。2株、 ストレプトミセス・エスピー。 MK277-AF1 9およびストレプトミセスdiastatochromogenesTü602810。構造は、NMRおよびX線分析によって明らかにされました。 Polyketomycinは、β-D-amicetoseおよびα-L-axenose 2デオキシ糖部分によってリンクされ、四環decaketidとジメチルサリチル酸で構成されています。それも、そのようなMRSA 11などのグラム陽性多剤耐性株に対して、細胞傷害性および抗菌活性を表示します。 S. diastatochromogenesTü6028のゲノムコスミドライブラリーが生成され、何年も前にスクリーニングしました。 41遺伝子を含む、52.2キロバイトのサイズでpolyketomycin遺伝子クラスターを特定の遺伝子をプローブ使用して、強烈なワーク12の数ヶ月後に同定されました。最近、 エス・diastatochromogenesのドラフトゲノム配列はpolyketomycin生合成遺伝子クラスターの高速同定につながる得ました。この概要では、この方法は、iDENはに貢献します天然物をtify、その生合成遺伝子クラスターは、一例としてpolyketomycin用いて、説明する明らかにする。 ここでは、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028によって生成polyketomycinのために示され、その生合成遺伝子クラスターに天然物から導く単一の手順を説明します。プロトコルは、抗生物質特性を有する天然産物の同定および精製を含みます。また、構造解析および生合成遺伝子クラスターの同定ゲノムマイニングリードからの結果との比較。この手順は、Streptomyces株または他の微生物に由来する任意の他の化合物にも適用することができます。

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, カールスルーエ, ドイツ</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td>麦芽エキス&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大豆粉&nbsp;</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany</td><td></td><td>Hensec-Vollsoja</td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>X938.3</td><td>Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>yeast extract&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Solvents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>アセトン&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorofrom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9 atom% D</td><td>ARMAR Chemicals, D&ouml;ttingen, Switzerland</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric</td><td>acid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリメラーゼ&nbsp;</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment</td><td>Promega GmbH, Mannheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramycin</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany&nbsp;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomycin</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG PGCGTGTGCCCccatgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCCCCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>グラム陽性試験株&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>strain for conjugation</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 Blue</td><td>Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td><td>グラム陰性試験株+クローニングホスト&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml;6028</td><td>Paululat et al., 1999</td><td>Polyketomycin producer</td><td></td></tr><tr><td>Online services</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td><td>http://antismash.secondarymetabolites.org/</td> <td>Detection of secondary metabolite gene cluster</td><td></td></tr><tr><td>BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>、<td>生物学的配列</td><td></td>間の類似性領域を見つけます</tr><tr><td>GenDB</td><td>https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td><td>ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Database of biosyntetic gene clusters</td><td></td></tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>Detection of seconary metabolite gene cluster</td><td></td></tr><tr><td>NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td> <td>Annotation of ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>NRPSドメイン</td><td></td>の検出</tr><tr><td>Prokka (rapid prokaryotic genome annotation)</td><td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>ORFsのアノテーション&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RAST(高速アノテーション・システム技術)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>ORFのアノテーション&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>その他のプログラム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td>HPLCの取り扱いプログラム&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>科学および教育用ソフトウェア、米国ケーリー</td><td>クローニング実験の設計&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td><td>シーケンシングリードのアライメント reads</td><td></td></tr><tr><td>Machines&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler: G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm;粒子サイズ:3.5 & マイクロ;m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column:Xbridge C18 (100 mm &times; 4.6 mm;粒子サイズ:3.5 &mu;m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm;粒子サイズ:5 & マイクロ;m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep カラム: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm;粒子サイズ:5 & マイクロ;m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser: G1322A&nbsp;</td><td>Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternaryポンプ:G1311A</td><td>Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diodeアレイ検出器(DAD)G1315B(&lambda; = 254 nmおよび400 nm)</td><td>Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quadrupole質量検出器(MSD)G1946D(2-3000 m / z)</td><td>Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>_heatingバス Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum pump system SC 920 G</td><td>KNF&nbsp;グローバル戦略&nbsp;AG, Sursee, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>その他の素材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロマフィルPVDF-45 / 15MS(細孔サイズ0.45 & micro;m;フィルター&オスラッシュ;15 mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml;ren, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPE カラム Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, カールスルーエ,</td><td></td><td>ドイツ 媒体: LB, 組成: LB, 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, カールスルーエ,</td><td></td><td>ドイツ 媒体: LB, 組成: LB, 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>媒体: TSB, 組成: CASO Boullion, 1 L H2O: 30 g</td></tr><tr><td>菌類&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td></td><td>媒体:YPD、組成:酵母抽出物、1 L H2O:10 g</td></tr><tr><td>菌&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>媒体: YPD, 組成: ペプトン, 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>菌類&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td></td><td>媒体:YPD、組成:グルコース、1 L H2Oへの量:20 g</td></tr><tr><td colspan="4">寒天プレートの場合、2%寒天を追加します</td></tr></tbody></table>

からpolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへストレプトミセスdiastatochromogenestü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

ストレプトミセス株は、様々な生理活性を有する異なる化合物の多くを生成する能力のために知られています。異なる条件下での栽培は、多くの場合、新規化合物の生成をもたらします。したがって、株の産生培養物を酢酸エチルで抽出し、粗抽出物をHPLCにより分析します。さらに、抽出物を異なるアッセイによって、それらの生物活性について試験します。構造解明のための関心対象の化合物は、様々なクロマトグラフィー法の組合せにより精製されます。 ゲノムマイニングに結合されたゲノム配列は、別のコンピュータープログラムを使用して天然物の生合成遺伝子クラスターの同定を可能にします。正しい遺伝子クラスターが同定されたことを確認するために、遺伝子不活性化実験を実行しなければなりません。得られた変異体は、特定の天然産物の生産のために分析されます。正しい遺伝子クラスターは、不活性化されると、株は、化合物を生成するために失敗する必要があります。 ワークフローは、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028によって生成される抗菌性化合物のpolyketomycinのために示されています。約10年前、ゲノム配列決定はまだ非常に高価だったときに、遺伝子クラスターのクローニングおよび同定は非常に時間のかかるプロセスでした。ゲノムマイニングと組み合わせた高速ゲノムシーケンシングは、クラスタ識別の裁判を加速し、生合成を探索する遺伝的方法によって、新規な天然物を生成するための新しい方法を開きます。この論文に記載されているプロトコルは、Streptomyces株または他の微生物に由来する任意の他の化合物に割り当てることができます。

この概要では、その生合成遺伝子クラスターにつながる抗生物質の同定から単一の手順を説明します。何年も前に私たちは、 大腸菌宿主細胞を形質導入し、ファージにそれらをパッケージ化、コスミドライブラリーをクローニングし、polyketomycinクラスタの重複領域を有するクローンを同定するためにコロニーの数千人を選別しなければなりませんでした。コスミドの配列決定も困難と高価なプロセス12でした。 株にさらなる研究を行うために、我々は、 ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028の全ゲノム配列を決定しました。ドラフトゲノム配列で、私たちは簡単にpolyketomycinと有望な化合物をコードする他のクラスターの生合成遺伝子クラスターを同定しました。 図7は、コスミドライブラリーと精巧スクリーニングのクローニングにより生合成クラスターを識別する「古い」方法を比較し、粗い時間スケールで、その後のゲノムマイニングと全ゲノム配列決定による「新しい」方法。新しいシーケンシング技術や新ゲノムマイニングプログラムは、全体のプロセスをスピードアップします。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg"> 図7：生合成遺伝子クラスターの割り当ての「古い」と「新」法の比較。 「古い」方法は、それぞれのコスミド（複数可）（上記）の陽性クローン及び配列の選択とコスミドライブラリーのクローニングを含み、 「新しい」メソッドは、全ゲノム配列決定および系統（以下）のゲノム上に位置する全ての二次代謝産物の遺伝子クラスターを同定するために-miningを含みます。単一ステップの所要時間は大まかな時間スケールで示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、抗生物質活性を有する天然物の識別、（B）化合物の精製、（C）は、その生合成の最初のモデル、（D）ゲノムシーケンシング/ -miningと（（A）の詳細なプロトコルを提示しますE）生合成遺伝子クラスターの検証。

からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

このワークフローの全体的な目標は、抗生物質活性を持つ天然物を同定し、化合物を精製し、ゲノムマイニングを通じてその生合成遺伝子クラスターを決定することです。myto耐性病原体の数が増加しているため、新しい抗生物質が緊急に必要とされています。ストレプトマイシン株は既知の抗生物質生産者であり、その可能性を活用すべきです。抗生物質バイオシンヘテロゲンクラスターの知識があれば、生合成経路を提案し、化合物をさらに修飾することができます。これらの手順は、対応する遺伝子クラスターを特定するのに役立ちます。ラジオはストレプトマイシン株で実証されています。しかし、それは他の微生物にも適用できます。まず、ストレプトマイシン株を異なる培地やインキュベーション時間などのさまざまな条件下で投げます。3, 000倍Gで10分間遠心分離することにより細胞を収穫し、上清を新しいフラスコに移す。培養液からの化合物抽出には、1モルの塩酸を添加して上清をPH4に調整します。そして、それを分離漏斗に移します。次に、同量のエタールアセテートを加え、混合物を180rpmで30分間振とうします。次に、エータルアセテート相を採取し、濾紙を通して丸底フラスコに移します。摂氏40度と240バールでの回転蒸発により、エータルアセテートを蒸発させます。菌糸体からの化合物抽出のために、細胞を2倍量のアセトンに再懸濁します。チューブ内の細胞を180rpmで30分間振とうします。濾紙で液体をろ過します。次に、ロータリーエバポレーターを使用して摂氏40度、550バールでアセトンを蒸発させます。乾燥抽出物を20ミリリットルの水エタールアセテートに溶解し、以前と同様に化合物の抽出を続けます。次に、乾燥抽出物をメタノールに溶解します。0.45マイクロメートルの細孔サイズフィルターでろ過します。そして、抽出物をHPLCバイアルに移します。サンプルをHPLCマシンに注入し、テキストプロトコルで説明されているように粗抽出物を分析します。ディスク拡散アッセイを使用して抗生物質活性を同定するには、さまざまな試験株のプレカルチャーをそれぞれの寒天プレートに広げます。次に、溶解した抽出物の20〜50マイクロリットルを滅菌紙ディスクにピペットで移します。また、溶媒を用いたネガティブコントロールと適切な抗生物質を用いたポジティブコントロールを調製します。紙ディスクを30分間乾燥させた後、試験培養物と一緒にプレートに移します。試験ひずみプレートを適切な条件下でインキュベートします。次に、各テスト株の見かけの阻害ゾーンを決定します。阻害ゾーンが存在する場合は、大規模培養から原因化合物を精製し、テキストプロトコールに記載されているように構造を解明します。精製中、化合物は酸化、放射線、または温度によって変化することがあります。精製タブを多く使用するほど、劣化の可能性が高くなります。最大5ミリグラムの化合物、これは一般的な遺伝子の分析に必要な最小限です。単離された化合物の化学構造を解析し、その生合成に関与する可能性のある酵素を予測します。ここでは、ポリシドマイシンを例として使用して、手順を示します。まず、構造を明らかな単一の部分に分割します。ポリシドマイシンは、四環式部分、2つの単糖類、およびジメチルサリチル酸で構成されています。次に、部分が由来する可能性のあるクラスター内の推定遺伝子を予測します。ここで、四環式部分は、ポリキー型シンフェーズタイプII.Whileジメチルサリチル部分は、反復ポリキー型シンフェーズタイプI.Likelyから得られる2つの糖部分、すなわち6つのデオキシ糖は、生合成中にdNDP-グルコース-4、6-デヒドラターゼを含むグルコースから合成され、2つのグリコシルトランスフェラーゼによって結合される可能性がある。次世代シーケンシング技術によるゲノムDNAのシーケンシング二次代謝物遺伝子クラスターの同定のために、antiSMASH、Natural Product Domain seeker、NRPS predicterなどのプログラムを実行します。ゲノム配列をfasta形式で登録してください。数時間後、結果は電子メールのリンクで送信されます。ストレプティマイオセス・ジアスタトクロモゲネスのドラフトゲノムにおいて、antiSMASHは22の推定遺伝子クラスターを同定した。推定遺伝子クラスターの酵素経路を解析します。化合物の合成に関与する可能性のある遺伝子を含むクラスターを検索します。アスタトクロモゲネスでは、クラスターIIにはpoly keytype synphase II型遺伝子、反復PKSタイプIの3つの遺伝子、dTDP-グルコース-4、6-デヒドラターゼ遺伝子、および遺伝子をコードする2つの糖転移酵素が含まれています。クラスターを他のクラスターと比較するために、antiSMASHは、類似の生合成遺伝子クラスターとその製品に関する注釈と詳細情報を含むMIBiGデータベースへのリンクを提供します。化合物の構造を他の既知の化合物と比較して、類似性を確認します。原因となる生合成遺伝子クラスターの同定は、簡単なことかもしれません。しかし、場合によっては、それは非常に難しいこともあります。提案した遺伝子クラスターが化合物の生合成に関与していることを検証するために、クラスター内の遺伝子を探索し、生合成の中心的な機能を持つ酵素をコードします。ポリシドマイシン遺伝子クラスターを確認するために、PKSタイプIIのケトシンターゼαをコードする遺伝子pokPI oneを選択し、フレーム外欠失により不活性化した。テキストプロトコルに記載されているように、単一のクロスオーバーコンストラクトのクローニングおよびコンジュゲーション後。単一のクロスオーバー変異体を確認します。これを行うには、100ミリリットルの生産培地に、確認された遺伝子の中断を含む単一のクローンを接種します。以前使用したのと同じ条件下で細胞をインキュベートします。前に示したように、粗抽出物の抽出に進みます。最後に、テキストプロトコルに記載されているHPLC MS Analysisによる産生を確認します。HPLC クロマトグラムの対応するピークと化合物の質量は検出できないはずです。ポリシドマイシン生合成遺伝子クラスターは、遺伝子欠失実験によって検証されました。ここに示されているのは、野生型 S.Diastatochromogenes の粗抽出物と、interrupte pokPI one 遺伝子を持つ変異株の HPLC クロマトグラムです。変異株はもはやポリシドマイシンを産生しません。一度習得すれば、この手順は数ヶ月以内に行うことができます。何年も前、生合成遺伝子クラスターの同定には多くの時間がかかりました。今日、ゲノムシーケンシングとゲノムマイニングは、このプロセスを強力に加速しています。このビデオを見れば、新規化合物からその生合成遺伝子クラスターに到達する方法をよく理解できるはずです。手順全体を1つのステップで示したので、他の天然物生産者に今すぐ割り当てることができます。遺伝子クラスターとその合成化合物に関する知識は、生合成経路についての洞察を与えてくれます。これにより、既存の分子を改良するために、さらに修飾する機会を得ることができます。

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排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

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進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

学ぶ天然物の生合成遺伝子クラスター同定法。抗生物質活性を持つ化合物を精製し、ゲノムマイニングで遺伝子クラスターを特定する手法をStreptomyces diastatochromogenesを用いて解説。抗生物質発見に有用です。

からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028

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