アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更
December 31st, 2016
単一卵胞の単離、細胞質RNAマイクロインジェクション、周囲の細胞層の除去、およびXenopus卵子におけるタンパク質発現のための最適化された手順が説明されています。さらに、リガンド依存性イオンチャネルを用いた電気生理学的実験における迅速な溶液変化のための簡単な方法が提示されます。
この手順の全体的な目標は、Xenopus卵子のイオンチャネルなどの新しいタンパク質を発現させることです。この方法は、関数式システムを必要とするあらゆる分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術のバリエーションの主な利点は、卵母細胞の速度、信頼性、および生存率の向上です。
この方法により、イオンチャネルの機能に関する洞察を得ることができます。さらに、他のタンパク質の研究にも適用できます。この方法を最初に思いついたのは、従来の方法では卵子の生存率が低いことに気付いたときでした。
テキストプロトコルに従って雌のカエルから卵巣の葉を取り除いた後、ペニシリンとストレプトマイシンを添加した滅菌修飾バルト溶液に葉を入れます。.ローブを切り開いて、組織が酸素にアクセスできるようにします。ステージ5〜6の卵胞を選び出すには、鉗子を使用して卵巣を保持し、次に卵胞の上にプラチナループを下げ、ループをゆっくりと引き抜いて、卵胞と結合組織を卵巣組織から破壊します。
プラチナループを使用して健康に見える卵子を選別します。先端を直径1.5mmにカットしたプラスチック製パスツールピペットを使用して、選択した卵胞を直径35mmのシャーレに移します。GABA A受容体用のcRNAとテキストプロトコルに従ってマイクロインジェクションピペットを調製した後、パラフィンオイルと細い針付きの10ミリリットルシリンジを使用して、マイクロインジェクションピペットを埋め戻します。
次に、ピペットを自作のマイクロインジェクション装置に取り付けます。滅菌プラスチックチップ付きのピペットを使用して、耐湿性熱可塑性プラスチック片のきれいな面にmRNA溶液の液滴を置きます。次に、インジェクションピペットの先端を液滴に浸し、モーターをオンにしてプランジャーを引っ込めます。
mRNA溶液はピペットに入り、オイルと目に見える界面を形成する必要があります。次に、ピペットの先端を液滴から引っ込め、インジェクションピペットの内側に陽圧を加えます。mRNA溶液の液滴が注入ピペットの先端に形成されるはずです。
ナイロンメッシュを底に接着し、MBSで覆った60mmのシャーレで注入用として、卵胞の栄養極を上に向けて並べます。マイクロマニピュレーターを使用して、インジェクションピペットを個々の卵胞の上に置きます。注入針を植物柱の中央に挿入し、ピペットの内側に陽圧を加えると、毎分0.6マイクロリットルの流量で50ナノリットルのmRNAが注入されます。
メッセンジャーRNAの漏れを避けるために、注射ピペットチップを卵胞から取り外す前に5〜10秒待ちます。注入した卵胞を2ミリリットルのMBSで満たされた新しいペトリ皿に移します。摂氏18度に設定されたワインクーラーに皿を置きます。
新たに発現したタンパク質の同一性に応じて、記録する前に注入した卵胞を1〜7日間インキュベートします。卵胞を剥がすには、0.5ミリリットルのMBS、コラゲナーゼ1ミリリットルあたり1ミリグラム、およびトリプシン阻害剤1ミリリットルあたり0.1ミリグラムを含むホウケイ酸ガラス管に10個の注入卵胞を移します。.チューブを摂氏36度の水浴に浸し、卵胞を20分間インキュベー
トします。ここの温度は、さらに1度進むと卵子が死滅する可能性があるため、非常に重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む2番目のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。次に、卵胞を4ミリモルのEGTAを含む0.5ミリリットルの二重濃縮MBSを含む3番目のチューブに移し、サンプルを室温で4分間インキュベートし、時々チューブを振とうします。
4分間のインキュベーション時間は、卵胞層が卵子から確実に剥離するために重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む別のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。卵子を2ミリリットルのMBSを含む35ミリメートルのシャーレに移します。
次に、実体顕微鏡下で、プラチナループを使用して、裸の卵子を押しのけるだけで外側のエンベロープを卵胞から分離します。むき出しの卵子は使用するまで保管してください。この実験では、機械的に選別されたXenopus卵子に、GABA A受容体サブユニットのmRNAコーティングをマイクロインジェクションしました。
その後、濾胞細胞層を除去しました。卵子は負の80ミリボルトで電圧クランプされ、GABAの濃度の増加と、GABA A受容体の強力な正のアロステリックモジュレーターであるTHDOCの存在にさらされました。このパネルは、GABA濃度に応じて誘発される電流振幅を示しており、このサブユニットの組み合わせのGABAに対する感度を示しています。
使用された式はI(c)Imax/n)で、cはGABAの濃度、EC50は1マイクロモルのTHDOCの存在下でのGABAの濃度であり、半値の最大電流振幅を誘発します。Imaxは最大電流振幅です。Iは電流振幅、nはHill係数です。
α 4 beta two delta GABA A受容体のEC50は0.41 0.12マイクロモルに達し、nは0.76 0.04でした。開発後、この技術は、研究者がXenopus卵子のタンパク質発現手順を改善する道を開きました。このビデオを見れば、濾胞細胞層に囲まれたXenopus卵母細胞を分離する方法、mRNAをマイクロインジェクションする方法、その後の濾胞細胞層の除去方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この記事では、キセノプス卵胞細胞における単一卵胞の分離と細胞質RNAマイクロインジェクションを行うための最適化された手順について説明しています。また、リガンド依存性イオンチャネルを含む電気生理学的実験における迅速な溶液変更の方法も提示しています。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- キセノプス卵胞細胞は、タンパク質発現の研究モデルとして一般的に使用されています。
- 従来の方法では、卵胞細胞の生存率が低いことがよくあります。
- 改良された技術は実験の信頼性と速度を向上させることができます。
- イオンチャネルの機能を理解することは、様々な生物学的研究にとって重要です。
研究目的
- 機能的なシステムで新しいタンパク質、特にイオンチャネルを発現させること。
- イオンチャネルの機能に関する洞察を提供すること。
- 実験中の卵胞細胞の生存率を向上させること。
使用した方法
- キセノプス卵胞細胞からの単一卵胞の分離。
- 細胞質RNAマイクロインジェクション。
- 周囲の細胞層の除去。
- 迅速な溶液変更を伴う電気生理学的実験。
主要な結果
- 最適化された手順により、卵胞細胞の生存率が高くなりました。
- タンパク質発現の速度と信頼性が向上しました。
- 卵胞細胞でイオンチャネルの発現に成功しました。
- イオンチャネルの機能性についての理解が深まりました。
結論
- 説明された方法は、イオンチャネル以外の様々なタンパク質にも適用できます。
- これらの技術は、機能的発現システムの研究における重要な進歩を表しています。
- さらなる研究により、これらの方法をより広範な生物学的問題に適用することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optimized Xenopus oocyte microinjection and follicular cell removal protocols enable robust functional expression of ion channels and membrane proteins, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The system's low endogenous channel background and rapid solution exchange facilitate quantitative electrophysiological assays, enhancing predictive confidence for lead identification and screening. These methods streamline the transition from molecular hypothesis to functional readout, reducing biological ambiguity at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate ion channels and transporters in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating protein-specific activity from endogenous background.
- Facilitates quantitative assessment of ligand-gated receptor pharmacology for target validation.
- Provides a platform for rapid hypothesis testing and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, scalable preparation of oocytes for downstream electrophysiological assays.
- Enables standardized, quantitative current measurements for compound screening.
- Supports assay readiness for high-throughput evaluation of channel modulators.
- Allows platform reuse for diverse membrane protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant ion channel pharmacology when appropriate.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of channel function.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative electrophysiological data.
- Supports translational biomarker development for ion channel targets.
Pipeline & Workflow Integration
These optimized Xenopus oocyte protocols position functional expression and electrophysiological analysis at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of membrane protein function and pharmacology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative current measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables EC50, Hill coefficient, and maximal current calculations for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models for ion channel targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse protein expression studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput of functional assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ion channel and transporter programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, oocyte handling, and electrophysiological recording.
- Demands access to specialized instrumentation for voltage clamp and solution exchange.
- Necessitates cross-team standardization of oocyte preparation and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different protein classes or ligand types.
- Temperature and incubation parameters are critical for oocyte viability and assay success.
