アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

この手順の全体的な目標は、Xenopus卵子のイオンチャネルなどの新しいタンパク質を発現させることです。この方法は、関数式システムを必要とするあらゆる分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術のバリエーションの主な利点は、卵母細胞の速度、信頼性、および生存率の向上です。

この方法により、イオンチャネルの機能に関する洞察を得ることができます。さらに、他のタンパク質の研究にも適用できます。この方法を最初に思いついたのは、従来の方法では卵子の生存率が低いことに気付いたときでした。

テキストプロトコルに従って雌のカエルから卵巣の葉を取り除いた後、ペニシリンとストレプトマイシンを添加した滅菌修飾バルト溶液に葉を入れます。.ローブを切り開いて、組織が酸素にアクセスできるようにします。ステージ5〜6の卵胞を選び出すには、鉗子を使用して卵巣を保持し、次に卵胞の上にプラチナループを下げ、ループをゆっくりと引き抜いて、卵胞と結合組織を卵巣組織から破壊します。

プラチナループを使用して健康に見える卵子を選別します。先端を直径1.5mmにカットしたプラスチック製パスツールピペットを使用して、選択した卵胞を直径35mmのシャーレに移します。GABA A受容体用のcRNAとテキストプロトコルに従ってマイクロインジェクションピペットを調製した後、パラフィンオイルと細い針付きの10ミリリットルシリンジを使用して、マイクロインジェクションピペットを埋め戻します。

次に、ピペットを自作のマイクロインジェクション装置に取り付けます。滅菌プラスチックチップ付きのピペットを使用して、耐湿性熱可塑性プラスチック片のきれいな面にmRNA溶液の液滴を置きます。次に、インジェクションピペットの先端を液滴に浸し、モーターをオンにしてプランジャーを引っ込めます。

mRNA溶液はピペットに入り、オイルと目に見える界面を形成する必要があります。次に、ピペットの先端を液滴から引っ込め、インジェクションピペットの内側に陽圧を加えます。mRNA溶液の液滴が注入ピペットの先端に形成されるはずです。

ナイロンメッシュを底に接着し、MBSで覆った60mmのシャーレで注入用として、卵胞の栄養極を上に向けて並べます。マイクロマニピュレーターを使用して、インジェクションピペットを個々の卵胞の上に置きます。注入針を植物柱の中央に挿入し、ピペットの内側に陽圧を加えると、毎分0.6マイクロリットルの流量で50ナノリットルのmRNAが注入されます。

メッセンジャーRNAの漏れを避けるために、注射ピペットチップを卵胞から取り外す前に5〜10秒待ちます。注入した卵胞を2ミリリットルのMBSで満たされた新しいペトリ皿に移します。摂氏18度に設定されたワインクーラーに皿を置きます。

新たに発現したタンパク質の同一性に応じて、記録する前に注入した卵胞を1〜7日間インキュベートします。卵胞を剥がすには、0.5ミリリットルのMBS、コラゲナーゼ1ミリリットルあたり1ミリグラム、およびトリプシン阻害剤1ミリリットルあたり0.1ミリグラムを含むホウケイ酸ガラス管に10個の注入卵胞を移します。.チューブを摂氏36度の水浴に浸し、卵胞を20分間インキュベー

ここの温度は、さらに1度進むと卵子が死滅する可能性があるため、非常に重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む2番目のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。次に、卵胞を4ミリモルのEGTAを含む0.5ミリリットルの二重濃縮MBSを含む3番目のチューブに移し、サンプルを室温で4分間インキュベートし、時々チューブを振とうします。

4分間のインキュベーション時間は、卵胞層が卵子から確実に剥離するために重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む別のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。卵子を2ミリリットルのMBSを含む35ミリメートルのシャーレに移します。

次に、実体顕微鏡下で、プラチナループを使用して、裸の卵子を押しのけるだけで外側のエンベロープを卵胞から分離します。むき出しの卵子は使用するまで保管してください。この実験では、機械的に選別されたXenopus卵子に、GABA A受容体サブユニットのmRNAコーティングをマイクロインジェクションしました。

その後、濾胞細胞層を除去しました。卵子は負の80ミリボルトで電圧クランプされ、GABAの濃度の増加と、GABA A受容体の強力な正のアロステリックモジュレーターであるTHDOCの存在にさらされました。このパネルは、GABA濃度に応じて誘発される電流振幅を示しており、このサブユニットの組み合わせのGABAに対する感度を示しています。

使用された式はI(c)Imax/n)で、cはGABAの濃度、EC50は1マイクロモルのTHDOCの存在下でのGABAの濃度であり、半値の最大電流振幅を誘発します。Imaxは最大電流振幅です。Iは電流振幅、nはHill係数です。

α 4 beta two delta GABA A受容体のEC50は0.41 0.12マイクロモルに達し、nは0.76 0.04でした。開発後、この技術は、研究者がXenopus卵子のタンパク質発現手順を改善する道を開きました。このビデオを見れば、濾胞細胞層に囲まれたXenopus卵母細胞を分離する方法、mRNAをマイクロインジェクションする方法、その後の濾胞細胞層の除去方法についてよく理解できるはずです。