Name: アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションと濾胞細胞層除去の最適化手法。高速溶液交換を用いた電気生理学実験により、イオンチャネル機能解析の信頼性と生存率を向上させる革新的なタンパク質発現システムを確立する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、スイス国立科学財団の助成金315230_156929/1によって支援されました。M.C.M.はフェローシップ(CONICYTのBeca Chile Postdoctorado, Ministerio de Educacion, Chile)の受賞者です。

動物実験は、ベルン州Kantonstierarztの地方委員会、KantonalerVeterinärdienstベルン（BE85 / 15）によって承認されています。 アフリカツメガエル卵母細胞の調製<ol><li>厳密に20°Cに維持され、水に12時間/ 12時間の明/暗サイクルでカエル（ アフリカツメガエル）を維持します 。 </li><li>女性のカエル9から卵巣のローブを削除します。 注：ローブの除去は、再生のための刺激である、と多くの場合、卵母細胞の品質は手術で改善されます。卵母細胞は、卵黄膜、毛包細胞の層、および血管21を含む結合組織で覆われています。全体の構造は、「毛包」と呼ばれます。 </li><li>ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した密滅菌バース生理食塩水7（MBS）に卵母細胞を含む卵胞が充てんされてい卵巣のローブを置きます（88のNaCl、1 mMの塩化カリウム、2.4 mMのNaHCO 3、0.82ミリモルのMgSO 4、0.41ミリモルのCaCl 2、0.33ミリモルのCa（NO 3）2、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸; HEPES（pHは7.5、NaOHで）、100μg/ mLのペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシン）。 </li><li>シングルアウトステージV-VI 21包。ピンセットで卵巣葉を持ちます。卵胞の上に白金耳（ 図1）を下げ、静かに卵巣組織から卵胞を含む結合組織を破壊するためにループを撤回。 注：（ -直径1.2ミリメートル1.0）と暗い色素性動物半球と黄色がかった植物半球間の良好なコントラストによりステージV-VI 21包は、その大きさによって特徴付けられます。 </li><li>プラスチック製パスツールピペットを用いて直径35mmのペトリ皿（1.5ミリメートルの開口径に背をカット）に（ すなわち、完全な球形と無傷の色素沈着を持つ）のみ健康そうな卵胞を転送します。 </li></ol>注：ここで説明するマイクロインジェクションシステムはKressmannとBirnstiel 22によって報告されたことに由来します。 <ol><li> in vitro転写による受容体、ポリ（A +）尾部、およびRNA定量の添加は、ゲル電気泳動23によってα4β2δGABAのサブユニットをコードするそれぞれのcDNAからcRNAをを準備します。 </li><li>マイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー（1.0ミリメートル、外径（OD）、0.58ミリメートル、内径（ID）、長さ100mm）からマイクロインジェクションピペットを準備します。ベベルチップで15ミクロン - 12の先端径を作成するために、マイクロマニピュレーターとミクロフィラメントを使用して、顕微鏡下でガラスキャピラリーの先端を折り。 </li><li> 10 mLシリンジを使用して、パラフィンオイルとマイクロインジェクションピペットを埋め戻し、その後、手製のMICR上にマイクロインジェクションピペットをマウントoinjection装置（ 図2）。 注：手製油油圧式射出装置は、フットペダルスイッチによって制御グリルモーターで構成されています。追加のスイッチは、モータの回転モードを変更します。このモーターは、10μLのガラスシリンジのプランジャーを前進または後退させるマイクロメータねじ（0.5ミリメートル/ターン）を駆動します。注射は約3回転の速度であり、0.5ターンは卵胞に50 nLの注入に対応しています。注射器の先端は、それ自体がタイゴンチューブの非常に短い一片によって注射針に接続されている厚肉ポリテトラフルオロエチレンチューブに接続されています。注射キャピラリーをマイクロマニピュレーターによって制御されるドリルチャックによって保持されています。システム全体は、パラフィン油で満たされています。それらは、注入システムが損なわれるように、気泡は、避けるべきです。セットアップは、冷光源で点灯されます。実体顕微鏡は、光制御のために必要とされます。卵胞はstereomicrで冷光下で可視化されていますOSCOPE（40X倍率）。注射セットアップのパフォーマンスは、 アフリカツメガエル卵母細胞への放射性トレーサーの注入によってテストされています。 45の容積 - 55 nLのは、1回の注射送達されるべきです。 </li><li>滅菌プラスチックチップでピペットを用いて、耐湿性の熱可塑性（2×2センチ）のクリーン内側に滅菌水の液滴を配置することによって、セットアップをテストします。この液滴への注入ピペットの先端を浸し、その後、プランジャー（注入用ピペット内の負圧）を後退させるモーターを回します。 注：水はピペットを入力して、油で目に見えるインタフェースを形成すべきです。 </li><li>液滴からのピペットの先端を撤回し、注入ピペットの内側に正の圧力を加えます。水滴は、注入用ピペットの先端に形成すべきです。 </li><li>植物極はナイロンメッシュ（G：0.8ミリメートル）の隙間に上向きでそれらを並べることにより、卵胞の注入の準備をPeとの底に接着MBSで覆われたトライディッシュ（60ミリメートル）。 </li><li>熱可塑性のクリーン内側に滅菌プラスチックチップでピペットを用いて、mRNAの2μLを分注します。注入ピペットの内部に負圧を印加することによって、注入ピペットへのmRNAを取ります。 </li><li>マイクロマニピュレーターを用いて、個々の卵胞の上に注入ピペットを置きます。 </li><li>植物極の中心に注射針を挿入し、ピペットの内側に正の圧力を加えることによって0.6μL/分の流速でのmRNAの50 nLのを注入します。 mRNAのエスケープを避けるために、卵胞から注入ピペットチップを取り外す前に、10秒 - 5待ちます。 注：mRNAは動物半球に位置する核への注入を避けるために、植物（黄色っぽい）極に注入する必要があります。 </li><li> MBSの2 mLを満たした新しいペトリ皿（35ミリメートル）に注入された卵胞を転送します。 18℃に設定したワインクーラーに皿を置きます。 1のために注入された卵胞を培養します -7日記録する前に、新たに発現したタンパク質の同一性に応じて。 </li></ol> 3.卵胞のストリップ（図3） 注：上記のように、血管24を含んでいる卵黄層、卵胞細胞、および結合組織で覆わ卵母細胞として知られている「毛包」。細胞表面へのソリューションのアクセスを妨げることなく、機械的安定性を提供卵黄層を除く全ての層は、電気生理学的実験の前に除去しなければなりません。周囲の細胞層なしの卵胞は、以前「剥皮」卵母細胞25と呼ばれています。この工程は、通常の電気生理学的実験と同じ日に行われます。 <ol><li>トランスファー10は、MBS 0.5mLの、1mg / mlのコラゲナーゼ、および0.1mg / mLのトリプシンインヒビターを含むホウケイ酸ガラス管に卵胞を注入しました。 36℃に維持した水浴中でチューブを浸します。インキュベート20分間の卵胞と時折チューブを振ります。 </li><li> RTでMBSの1 mLを含む第二の管にそれらを転送することにより卵胞をすすぎます。約10秒間チューブでそれらを残します。 </li><li> 4mMのエチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）を含む二重濃縮MBS 0.5 mLを含む第3チューブに卵胞を転送- Nは、N、N &#39;、N&#39;-四酢酸（EGTA）、及び4分のためにそれらをインキュベートRT。時折チューブを振ります。 注：高張液（二重濃縮MBS）は、それにより卵母細胞の卵胞細胞層を剥離、卵胞細胞層内で卵母細胞の収縮を誘導するために使用されます。 EGTAは、コラゲナーゼ活性を阻害するために添加されます。 </li><li> RTでMBSの1 mLを含む第二の管にそれらを転送することにより卵胞をすすぎます。約10秒間チューブでそれらを残します。 </li><li> MBSの2 mLを含むペトリ皿（直径35mm）に卵母細胞を転送します。実体顕微鏡下で、によって卵胞から外封筒を分離単純に白金耳を用いて、離れて裸の卵母細胞をプッシュ。 注：卵母細胞の外側エンベロープは、培養皿にしっかりと付着し、容易に卵母細胞から分離することができます。いくつかの卵母細胞は自発的にそれらの外側エンベロープを失い、裸化卵母細胞として回収されます。この手順では、卵母細胞の球状の外観を保持し、比較的安定した準備になります。 </li></ol>卵母細胞の周り4.高速解法の変更<ol><li> 9,26を説明したように、電圧クランプ実験を行います。 </li><li>実験で必要とされる灌流スイッチを回して重力供給灌流システムのソリューションを変更します。 <ol><li> 6 mLの1.35ミリメートルの内径を有するガラスキャピラリーを通して/分、卵母細胞の周りのアゴニスト濃度の急速な変化を可能にするために、卵母細胞の表面から約0.4mmに配置された河口に灌流液を適用します。 注：変化率は以前に推定されています0.5未満の27で70％D。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この資料に記載された方法は、伝統的に7-9使用されるものから外れます。 1〜2時間コラゲナーゼ処理8に卵巣のローブを露出するための規格です。損傷を受けていない、裸に卵母細胞を分離します。およびmRNAは、市販の注入装置を使用してそれらを注入します。卵母細胞は、コラゲナーゼの高濃度に長時間暴露によって損傷される可能性が高い1）：これは古典的な手順は以下の欠点を有します。 2）不安定な裸化卵母細胞は、実験まで保存しておく必要があります。 3）裸化卵母細胞は卵胞よりマイクロインジェクションの間に苦しむ可能性が高くなります。商用の注入装置は、損傷の比較的高い速度をもたらす可能性が大径（約20μm）注射針を使用します。裸化卵母細胞を格納する必要がない、コラゲナーゼへの曝露は、20分に制限され、ピペットの小さな先端径（約12から15μm）はmicroinjectiに使用：次のようにここで説明する改良された手順の利点は、mRNAを注入するための包の前に「defolliculation」を必要としません。単一の重要なステップは、コラゲナーゼ溶液中の卵胞のインキュベーション温度は慎重に36℃に調整されるべきであ...

アフリカツメガエル卵母細胞は、広く（ - 3、およびその中の参考文献参考文献2）発現系として使用されます。彼らは、適切に組み立て、それらの形質膜に機能的に活性な多サブユニットタンパク質を組み込むことができます。このシステムを使用して、機能的に変異した、キメラ、または連結されたタンパク質の特性を研究するため、および潜在的な薬物をスクリーニングするために、単独で、または他のタンパク質と組み合わせて膜タンパク質を調査することが可能です。 他の異種発現システムより卵母細胞を使用する利点は、巨細胞の簡単な取り扱い、外来遺伝情報を発現する細胞の高い割合、浴灌流によって、卵母細胞の環境の簡単な制御、および膜電位の制御を含みます。 この発現系の欠点は、多くの研究室17〜20において観察された季節変動です。この変化の理由明確にはほど遠いです。さらに、卵母細胞の質は、多くの場合、強く変化することが観察されます。伝統的な方法7-9は卵巣ローブの分離、いくつかの時間のためのコラゲナーゼに卵巣ローブの露出、裸に卵母細胞の選択、および卵母細胞のマイクロインジェクションが含まれています。ここで、代替、高速手順の数は、私たちは、卵母細胞の品質の無い季節変動や変化の少ない、30年以上にわたってこの発現システムで動作することが許可されていることが報告されています。 改変及び改良された卵母細胞の単離のためにここに記載された方法、cRNAをマイクロインジェクションし、及び濾胞細胞層の除去は、 アフリカツメガエル卵母細胞における選択の任意のタンパク質の発現のために使用することができます。卵母細胞の周囲の培地の高速解の変化のための非常に簡単な方法は、任意のリガンド依存性イオンチャネルのキャリアの研究に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</>Σ</td><td></td> <td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &MU;gペニシリン/ mLおよび100 μ;g ストレプトマイシン/mL</td></tr><tr><td>プラチナ ワイヤー ループ</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット プーラー</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>80300</td><td>10 &mu;L、タイプ701N</td></tr><tr><td>厚肉ポリテトラフルオロエチレンチューブ</td><td>LabmarketGmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>パラフィンオイル</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンネット、G: 0.8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml;より豊かなBeuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ NB 標準グレード</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤 I-S</td><td>シグマ</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>ガラス キャピラリー</td><td>ジェンコンス (サイエンティフィック) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (灌流用)、代替会社: Harvard Apparatus Limited</td></tr> ホ<tr><td>ウケイ酸ガラス キャピラリー</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&nbsp; 0.58 ID x 100 長さ mm (マイクロインジェクション用)&nbsp;</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー&nbsp;</td><td>ハーバード・イスクライム・リミテッド</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 長さ mm (2 電極電圧クランプ用)</td></tr><tr><td>&γ;-アミノ酪酸 (GABA)</td><td>シグマ</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&、21-ジヒドロキシ-5&-プレグナン-20-ワン (THDOC)</td><td>シグマ</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>グリルモーター</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>DCマイクロモーター タイプ2230 ギア付き タイプ22/2</td></tr><tr><td>マイクロメータースクリュー</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>滅菌プラスチックトランスファーピペット</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

タンパク質の異種発現系としてアフリカツメガエル卵母細胞は、第一のガードンらによって記載されました。 1、広くその発見以来使用されている（文献2から3、およびその中の参考文献）。外国のチャンネル発現のための卵母細胞は、魅力的な特徴は、内因性イオンチャネル4の貧しい豊富です。この発現系は、それらのリガンド依存性イオンチャネルの中で、多くのタンパク質の特徴付けのために有用であることが証明されました。 アフリカツメガエル卵母細胞におけるGABA A受容体の発現およびそれらの機能的特徴付けは、卵母細胞、cRNAを、濾胞細胞層を除去しながら、微量注入、および電気生理学的実験で高速なソリューションの変化の分離を含め、ここに記載されています。手順は、この研究室5,6で最適化し、日常的に7-9を使用したものから逸脱しました。伝統的に、露出した卵母細胞を調製しますRTで卵巣ローブの長期のコラゲナーゼ処理、およびこれらの裸化卵母細胞にmRNAをマイクロインジェクションしています。最適化された方法を使用して、多様な膜タンパク質が発現されており、そのような組換えGABA A受容体10-12、ヒト組換えクロライドチャネル13、トリパノソーマカリウムチャネル14、及びミオの -イノシトールトランス15、16のように、このシステムを研究しました。 ここに詳述した方法は、 アフリカツメガエル卵母細胞における選択の任意のタンパク質の発現に適用することができ、迅速な溶液交換は、他のリガンド依存性イオンチャネルを研究するために使用することができます。

アフリカツメガエル卵母細胞は、機械的に白金耳（ 図1）を使用して選び出しました。 0.5：2.5のfmol /卵母細胞（ 図2）卵母細胞は、mRNAは、受容体サブユニットは4、β2、δ、0.5をαGABAをコードをマイクロインジェクションしました。 4日後、卵胞細胞層（ 図3）を除去しました。電圧は、卵母細胞を-80mVでクランプし、1μM3α、21ジ​​ヒドロキシ5α-プレグナン-20-1（THDOC）、の強力な正のアロステリックモジュレーターの存在下で、γアミノ酪酸（GABA）の増加する濃度にさらされましたGABA A受容体。 図4Aは、このような実験で記録されたオリジナルの電流トレースを示します。 図4Bは、GABAの濃度に応じて誘発された電流振幅を示しています。これは、GABAに向けて、このサブユニットの組み合わ...

単一卵胞の単離、細胞質RNAマイクロインジェクション、周囲の細胞層の除去、およびXenopus卵子におけるタンパク質発現のための最適化された手順が説明されています。さらに、リガンド依存性イオンチャネルを用いた電気生理学的実験における迅速な溶液変化のための簡単な方法が提示されます。

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

この手順の全体的な目標は、Xenopus卵子のイオンチャネルなどの新しいタンパク質を発現させることです。この方法は、関数式システムを必要とするあらゆる分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術のバリエーションの主な利点は、卵母細胞の速度、信頼性、および生存率の向上です。この方法により、イオンチャネルの機能に関する洞察を得ることができます。さらに、他のタンパク質の研究にも適用できます。この方法を最初に思いついたのは、従来の方法では卵子の生存率が低いことに気付いたときでした。テキストプロトコルに従って雌のカエルから卵巣の葉を取り除いた後、ペニシリンとストレプトマイシンを添加した滅菌修飾バルト溶液に葉を入れます。.ローブを切り開いて、組織が酸素にアクセスできるようにします。ステージ5〜6の卵胞を選び出すには、鉗子を使用して卵巣を保持し、次に卵胞の上にプラチナループを下げ、ループをゆっくりと引き抜いて、卵胞と結合組織を卵巣組織から破壊します。プラチナループを使用して健康に見える卵子を選別します。先端を直径1.5mmにカットしたプラスチック製パスツールピペットを使用して、選択した卵胞を直径35mmのシャーレに移します。GABA A受容体用のcRNAとテキストプロトコルに従ってマイクロインジェクションピペットを調製した後、パラフィンオイルと細い針付きの10ミリリットルシリンジを使用して、マイクロインジェクションピペットを埋め戻します。次に、ピペットを自作のマイクロインジェクション装置に取り付けます。滅菌プラスチックチップ付きのピペットを使用して、耐湿性熱可塑性プラスチック片のきれいな面にmRNA溶液の液滴を置きます。次に、インジェクションピペットの先端を液滴に浸し、モーターをオンにしてプランジャーを引っ込めます。mRNA溶液はピペットに入り、オイルと目に見える界面を形成する必要があります。次に、ピペットの先端を液滴から引っ込め、インジェクションピペットの内側に陽圧を加えます。mRNA溶液の液滴が注入ピペットの先端に形成されるはずです。ナイロンメッシュを底に接着し、MBSで覆った60mmのシャーレで注入用として、卵胞の栄養極を上に向けて並べます。マイクロマニピュレーターを使用して、インジェクションピペットを個々の卵胞の上に置きます。注入針を植物柱の中央に挿入し、ピペットの内側に陽圧を加えると、毎分0.6マイクロリットルの流量で50ナノリットルのmRNAが注入されます。メッセンジャーRNAの漏れを避けるために、注射ピペットチップを卵胞から取り外す前に5〜10秒待ちます。注入した卵胞を2ミリリットルのMBSで満たされた新しいペトリ皿に移します。摂氏18度に設定されたワインクーラーに皿を置きます。新たに発現したタンパク質の同一性に応じて、記録する前に注入した卵胞を1〜7日間インキュベートします。卵胞を剥がすには、0.5ミリリットルのMBS、コラゲナーゼ1ミリリットルあたり1ミリグラム、およびトリプシン阻害剤1ミリリットルあたり0.1ミリグラムを含むホウケイ酸ガラス管に10個の注入卵胞を移します。.チューブを摂氏36度の水浴に浸し、卵胞を20分間インキュベートします。ここの温度は、さらに1度進むと卵子が死滅する可能性があるため、非常に重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む2番目のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。次に、卵胞を4ミリモルのEGTAを含む0.5ミリリットルの二重濃縮MBSを含む3番目のチューブに移し、サンプルを室温で4分間インキュベートし、時々チューブを振とうします。4分間のインキュベーション時間は、卵胞層が卵子から確実に剥離するために重要です。卵胞を室温で1ミリリットルのMBSを含む別のチューブに移してすすぎ、チューブ内に約10秒間放置します。卵子を2ミリリットルのMBSを含む35ミリメートルのシャーレに移します。次に、実体顕微鏡下で、プラチナループを使用して、裸の卵子を押しのけるだけで外側のエンベロープを卵胞から分離します。むき出しの卵子は使用するまで保管してください。この実験では、機械的に選別されたXenopus卵子に、GABA A受容体サブユニットのmRNAコーティングをマイクロインジェクションしました。その後、濾胞細胞層を除去しました。卵子は負の80ミリボルトで電圧クランプされ、GABAの濃度の増加と、GABA A受容体の強力な正のアロステリックモジュレーターであるTHDOCの存在にさらされました。このパネルは、GABA濃度に応じて誘発される電流振幅を示しており、このサブユニットの組み合わせのGABAに対する感度を示しています。使用された式はI(c)Imax/n)で、cはGABAの濃度、EC50は1マイクロモルのTHDOCの存在下でのGABAの濃度であり、半値の最大電流振幅を誘発します。Imaxは最大電流振幅です。Iは電流振幅、nはHill係数です。α 4 beta two delta GABA A受容体のEC50は0.41 0.12マイクロモルに達し、nは0.76 0.04でした。開発後、この技術は、研究者がXenopus卵子のタンパク質発現手順を改善する道を開きました。このビデオを見れば、濾胞細胞層に囲まれたXenopus卵母細胞を分離する方法、mRNAをマイクロインジェクションする方法、その後の濾胞細胞層の除去方法についてよく理解できるはずです。

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

私たちは、Xenopus laevisの未熟卵子の操作方法、卵子の卵子へのin...

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

タンパク質合成制御は主に翻訳開始段階で行われ、その欠陥は多様な障害に関連しています。それらの病因をよりよく理解するために、ここでは、翻訳開始因子eIF4G1の変異体の存在下でmos転写産物の翻訳を評価するXenopus...

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

私たちは、有能な外胚葉で応答を誘発することができる遺伝子の発現クローニングのためのXenopus卵子と動物キャップシステムについて説明し、そのような遺伝子のその後の解析技術について議論します。このシステムは、幅広い遺伝子産物の機能同定に役立ちます。...

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

この記事では、マレイミド色素の代わりに蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を用いて、イオンチャネルの構造的再配列を調べる従来の電圧クランプ蛍光光度法（VCF）の強化について説明します。この手順には、 アフリカツメガエル卵母細胞DNA注入、RNA / fUAA共注入および同時電流および蛍光測定が含まれる。...

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

ここでは、 アフリカツメガエル...

アフリカツメガエル卵母細胞からのギャップ接合電流の記録

学ぶアフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションと濾胞細胞層除去の最適化手法。高速溶液交換を用いた電気生理学実験により、イオンチャネル機能解析の信頼性と生存率を向上させる革新的なタンパク質発現システムを確立する。

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

さらに動画を探す