LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法
2017年1月24日
我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。
この手順の全体的な目標は、LC-MS/MS分析を使用して、核補因子と相互作用するタンパク質を同定することです。この方法は、遺伝子制御分野における転写メカニズムに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、核補因子と相互作用するタンパク質を同定できることです。
さらに、この方法により、標的核因子の転写制御メカニズムをよりよく理解することができます。トランスベクションの36時間後に、ARIP4を発現するHEK293細胞を、氷冷PBSで細胞シートを洗浄し、細胞スクレーパーで細胞を回収して回収します。細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、8000gで摂氏4度で2分間遠心分離します。
上清を吸引し、細胞ペレットをペレット量の5倍のHigh Salt Bufferに再懸濁します。混合物を摂氏4度で20分間回転させます。20分間の回転後、チューブを17、700gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、上清の3倍の体積に希釈バッファーを追加します。別のセトリフュージングを行い、次に上清を新しい2ミリリットルチューブに移します。10分間の遠心分離中に、50マイクロリットルのアンチフラッグビーズをPBSで洗浄します。
次に、チューブを2000gで摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を取り除き、最初に1モルの塩酸グリシンで洗浄手順を繰り返し、次に1モルの塩酸トリスで洗浄します。その後、低塩緩衝液で2回洗浄します。
次に、50マイクロリットルの洗浄したビーズを全細胞抽出物と混合します。混合物を摂氏2〜4度で4時間静かに回転させます。次に、鈍い先端を使用してサンプルをマイクロスピンカラムに移し、溶液を1.5ミリリットルのチューブに滴
下させます。液体窒素で流れをスナップ凍結し、マイナス80°Cで保存します。次に、フラッグビーズを低塩緩衝液で5回洗います。溶出するには、カラムを1.5ミリリットルのチューブに入れ、2000gで1分間遠心分離してビーズを乾燥させます。
カラムの底にキャップをし、50マイクロリットルの1モル塩酸グリシンを追加します。室温で10分間静かに振とうします。10分後、カラムを新しい1.5ミリリットルチューブに入れ、2000gで1分間遠心分離します。
溶出した溶液を1モルトリス塩酸塩10マイクロリットルで中和し、ピペッティングとボルテックスでよく混合します。50マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウムを追加します。アセトニトリル10マイクロリットル、ジチオスレイトール2マイクロリットル、中和サンプル50マイクロリットル
。摂氏56度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを室温で10分間放置します。次に、10マイクロリットルの333ミリモルヨードアセトアミドをサンプルに加え、暗闇で30分間37°Cでインキュベートします。混合物に10マイクロリットルのトリプシンを加え、摂氏37°Cで一晩インキュベートします。
翌日、最終製品をLC-MS/MS施設または第三者の質量分析ラボに輸送して分析します。この画像は、HEK 293細胞で発現したARIP4とタグ付けされたフラッグエピトープの銀染色を、フラッグ特異的抗体による免疫沈殿と電気泳動による分離後の様子を示しています。対照として、外因性タンパク質を発現しないHEK293細胞に対して模擬精製を行いました。
私たちの方法を使用すると、目的の転写因子を介して推定される核補因子を特定し、転写制御メカニズムの理解を深めることができます。
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概要
本記事では、LC-MS/MS分析を用いて核共因子と相互作用するタンパク質を同定するための詳細なプロトコルを紹介します。本手法では、HEK 293細胞からFlagタグ付き核共因子を免疫共沈降させ、次に質量分析を行うことで、転写調節に関連するタンパク質間相互作用を明らかにします。このアプローチにより、研究者は遺伝子発現を制御する複雑なネットワークを解明することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 分子生物学
- プロテオミクス
- 転写調節
背景
- 転写共調節因子は、核内クロマチン構造を効率的に制御するために不可欠です。
- 共調節因子は転写因子と相互作用し、ヒストンやタンパク質を修飾することで、クロマチンのコンフォメーションを変化させることができます。
- これらのネットワーク内におけるタンパク質間相互作用を理解することは、遺伝子調節メカニズムを解明する上で極めて重要です。
- LC-MS/MSは、タンパク質の結合パートナーを同定するための検証済みの手法です。
研究目的
- 核共因子と相互作用するタンパク質を同定するための、迅速で信頼性の高い手法を確立すること。
- 転写調節に関与するタンパク質複合体のハイスループット解析を促進すること。
- 遺伝子発現制御の根底にある分子メカニズムへの理解を深めること。
使用方法
- HEK 293細胞におけるflagタグ付きARIP4の発現。
- 高塩濃度バッファーを用いた細胞の回収および溶解。
- anti-flagビーズを用いた免疫沈降によるタンパク質複合体の単離。
- 結合タンパク質の逐次洗浄および溶出。
- trypsinによるタンパク質消化およびLC-MS/MS用サンプル調製。
- 質量分析によるタンパク質相互作用の解析。
主な結果
- HEK 293細胞からFLAGタグ付きARIP4および関連タンパク質の単離に成功した。
- 銀染色により、免疫沈降されたタンパク質の存在を確認した。
- コントロール実験により、精製プロセスの特異性を検証した。
- LC-MS/MSを用いて、推定される核共役因子の結合パートナーを同定した。
結論
- 記載されたプロトコルは、核共因子と相互作用するタンパク質を効果的に同定します。
- 本手法は、転写調節機構の研究を前進させます。
- これは、遺伝子調節におけるタンパク質ネットワークのさらなる探索のための基盤を提供します。
よくある質問
産業界における重要性
LC-MS/MSを用いた核共役因子のタンパク質相互作用の高スループット同定は、早期探索におけるリスク低減および転写調節ネットワークの解明に不可欠です。本ワークフローにより、バイオファーマのチームはメカニズムに関する仮説を検証し、直接的なタンパク質間相互作用のエビデンスに基づいて標的の優先順位を決定することが可能になります。探索段階で堅牢なインタラクトームマッピングを統合することは、予測の信頼性を高め、ポートフォリオの選別決定に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 機能的なターゲット検証に向けた、核共因子の結合パートナーの系統的な同定を可能にする。
- 転写調節経路を明らかにすることで、メカニズム面でのリスク低減をサポートする。
- 遺伝子調節に関連するタンパク質相互作用ネットワークの直接的な根拠を提供する。
- 分子相互作用が検証されたターゲットの優先順位付けを容易にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの定量 LC-MS/MS 分析に向けて、検証済みのタンパク質複合体を調製します。
- 再現性のあるインタラクトームプロファイリングのために、免疫沈降とサンプル調製を標準化します。
- アッセイ開発およびスクリーニング準備を裏付ける定量データを生成します。
- タンパク質間相互作用に対する化合物の影響を、信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 核共因子が病理に関与している場合に、インタラクトームデータと疾患関連の転写メカニズムを整合させます。
- 調節タンパク質ネットワークをマッピングすることで、発見から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- メカニズムに関する知見に基づき、リスク調整後の進展決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このタンパク質調製およびLC-MS/MSワークフローは、初期探索とリード同定の境界領域に適しており、下流のトランスレーショナルリサーチのための基礎的なインタラクトームデータを提供します。
- 探索生物学：核共因子の相互作用をマッピングすることで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物スクリーニングにおいて、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：質量分析に基づいたタンパク質複合体の同定および定量を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：関連がある場合、分子相互作用データと疾患モデルとの整合性を可能にします。
- エンタープライズでの再利用：標的やプログラムを越えて適用可能な、インタラクトームマッピングのための拡張性と再利用性のあるワークフローを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：標的バリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：タンパク質複合体の単離およびLC-MS/MS解析を標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：直接的な相互作用データに基づいて開発を進めることで、意思決定（go/no-go判断）の精度を向上させ、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの分子メカニズムに基づいた、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 免疫沈降、タンパク質化学、およびLC-MS/MS分析の専門知識が必要です。
- 質量分析装置および分析インフラストラクチャへのアクセスが必要です。
- サンプル調製およびデータ分析プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、異なる核共因子やタグ付きタンパク質システムに適応可能です。
- 信頼性の高い免疫沈降には、抗体の特異性と品質が重要となります。
