Name: LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学ぶLC-MS/MS分析を用いた核補因子相互作用タンパク質のハイスループット同定法。HEK 293細胞でflagタグ付きARIP4を発現させ、免疫沈降と質量分析で転写制御に関わるタンパク質ネットワークを解明する手法です。

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この研究は、アステラス代謝障害研究財団(HT)、武田科学振興財団(HT)、および日本学術振興会科学研究費補助金若手研究者(B)の支援を受けて行われました。

1.トランスフェクション<ol><li> 100 mmの培養プレートでHEK293細胞を播種（2×10 6細胞/皿）。培養10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのストレプトマイシン、および100単位/ mlのペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中の細胞。 5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、製造業者の指示11に従ってトランスフェクション試薬を40μlを用いて、FLAGタグ付きARIP4プラスミド10μgの細胞をトランスフェクト。 </li></ol> 2.タンパク質抽出<ol><li>約36時間のトランスフェクション後、氷冷PBSで細胞を洗浄し、スクレーパーを用いて細胞を採取します。 1.5 mltubeに細胞を移し、4℃で2分間、8,000×gで、それを遠心します。吸引した上清と5倍に細胞ペレットを再懸濁し、0.4MのKClバッファーのペレット体積（高塩緩衝液：20mMのトリスHCl（pH8.0）、0.4 MのKCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、0.1％NP-40、10mMのB -メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 4℃で20分間、混合物を回転させます。 </li><li> 4℃で10分間、17,700×gでチューブを遠心。 </li><li>新しい2 mLのチューブに上清（全細胞抽出物）を転送し、3×0 MのKCl緩衝液（希釈緩衝液の初期容量追加：20mMのトリス-HCl（pH8.0）に、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、 0.1％NP-40、10mMのβメルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 </li><li>別の遠心分離（4℃で10分間、17,700×gで）を実行し、新しい2 mlチューブに上清（全細胞抽出物）を転送。 </li></ol> 3.免疫沈降<ol><li>遠心分離（2.4）中、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液で2回洗浄し、続いてPBSで抗FLAGビーズ、0.1 Mグリシン - 塩酸、次いで1 Mトリス塩酸、50μlの洗浄：20mMのトリスを塩酸液（pH 8.0）、0.1 MのKCl、5mMのMgCl 2を、10％グリセロール、0.1％NP-40 10 m個Mβ-メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。この洗浄工程の遠心分離を4℃で1分間、2,000×gで行われます。 </li><li>全細胞抽出物でFLAGビーズの50μLを混合し、穏やかに2-4°C（全細胞抽出物を1％ステップ2.4からは、将来の使用のために-80℃で維持されるべきで4時間混合物を回転させます）を入力として。 </li><li>マイクロスピンカラム（重力落下）にサンプルを転送します。 （入力フロースルーウェスタンブロット分析を使用して、両方のタンパク質レベルをチェック）、1.5mlチューブにフロースルーを保つ液体窒素を用いて凍結し、-80℃で保管します。 </li><li> FLAGビーズ（重力落下）を洗浄するために、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液）の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 3.4少なくとも4回（5回の洗浄の合計のための）手順を繰り返し。 </li></ol> 4.溶出<ol><li>それは1分間2,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に列を配置します。ビーズが乾燥します。 </li><li>の底部キャップ列。 </li><li> 0.1 Mグリシン-HCl（pH2.5）の（FLAGビーズの容積に等しい）50μLを加えます。 </li><li>穏やかに室温で10分間混合物を振ります。 </li><li>新しい1.5 mlチューブにカラムを置き、1分間2000×gでそれを遠心します。 </li><li>溶出した溶液を1 Mトリス-HCl（pH8.0）10μlので中和します。ピペッティングによりまたは渦機を用いてよく混ぜます。 </li></ol> 5.アルキル化し、トリプシン処理<ol><li>混合物（112μlの総容量）に100mMのNH 4 HCO 350μlの、CH 3 CN10μlの、及びジチオスレイトールの2μLを加えます。 </li><li> 56℃で30分間、試料をインキュベートします。 </li><li> 10分間、室温でサンプルを配置します。 </li><li>ヨードアセトアミドサンプルに333 mMと10μlを添加して、37℃で30分間、暗所でそれをインキュベートします。 </li><li>混合物にトリプシン10μlの（33 ngの/μl）を加え、37℃で一晩静置します。 </li></ol><ol><li>一晩のトリプシン処理後、LC-MS / MS機能または分析12のためにサードパーティの質量分析研究所に、最終製品を輸送します。 </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

効率的なトランスフェクションは、このプロトコルで成功した結果を得ることが不可欠です。したがって、我々は免疫沈降FLAGタグ付きタンパク質レベルを決定するために、ウェスタンブロット分析を使用することをお勧めします。このステップでは、IPが正常に実行されたこと、また、興味のあるタンパク質が適切に過剰発現していることを確認し、することができます。 FLAG標識タンパク質レベルはまた、質量分析の前にチェックする必要があります。 モックサンプルは、偽陽性の結果を得ることを避けるために、真の相互作用から背景を区別するため、陰性対照として使用されるべきです。ヒトタンパク質を研究するときにまた、実験では、汚染を避けるために、比較的クリーンな環境（ 例えば、クリーンルーム）で行われるべきです。高塩濃度（0.3〜0.4 M）を有するタンパク質抽出緩衝液は、時折核タンパク質を抽出するために使用することができるが、0.1〜0.15 Mの塩濃度を有するIP緩衝液は、最もあり10お勧めします。これは、IP手順は、タンパク質 - タンパク質相互作用を中断することなく続行することができます。さら...

タンパク質 - タンパク質相互作用は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たしています。このように、これらの相互作用は、シグナル伝達に関与しています。細胞膜を横切るタンパク質輸送;細胞代謝; DNA複製、DNA損傷修復、組換え、および転写1、2、3、4を含む、いくつかの核プロセス。これらの相互作用に関与するタンパク質を同定することは、これらの細胞プロセスの理解を進めることが重要です。 免疫沈降（IP）は、タンパク質 - タンパク質相互作用を分析するために使用される検証技法です。共免疫沈降したタンパク質の同定を容易にするために、質量分析がしばしば利用されて5、6、7、8、9。抗体とタンパク質複合体の既知のメンバーを標的とすることにより、タンパク質複合体を単離するために、続いて質量分析を介して、その未知の成分を同定することが可能です。 ARIP4（アンドロゲン受容体相互作用タンパク質4）、転写補調節因子は、文脈に依存した方法9、10でその標的プロモーターを活性化または抑制するために、核内受容体タンパク質と相互作用します。より良いこれらの核因子を支配する転写調節機構を理解するために、我々は、精製し、LC-MS / MSシステムを使用してARIP4相互作用するタンパク質を同定するための包括的方法を記載しています。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Columns</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms / ms分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

転写補助因子は、核クロマチン構造の効率的な転写調節に不可欠です。共調節因子は、転写の調節においてさまざまな役割を果たします。これには、転写因子との直接的な相互作用、ヒストンや他のタンパク質の共有結合修飾、時折のクロマチンコンフォメーション変化などが含まれます。したがって、このネットワーク内で相互作用するタンパク質を比較的迅速に同定する方法を確立することは、根底にある調節メカニズムの理解を深めるために重要です。LC-MS/MS を介したタンパク質結合パートナーの同定は、タンパク質間相互作用の解析に使用される検証済みの手法です。以前に同定されたタンパク質複合体のメンバーを抗体(場合によってはタグ付きタンパク質の抗体)で免疫沈降させることにより、質量分析によって未知のタンパク質相互作用を同定することができます。ここでは、核補因子とその結合パートナーが関与するタンパク質相互作用の LC-MS/MS を介したハイスループット同定のためのタンパク質調製法を紹介します。この方法により、標的核因子の転写制御メカニズムをより深く理解することができます。

私たちは、160 KDaの周りに、強いARIP4信号を識別し、同様にモックサンプル制御および他のいくつかの未知のタンパク質（ 図1）のもの。 LC-MS / MS分析は、FLAGビーズ（ 表1）の画分内ARIP4複合ペプチド及び潜在的なペプチド補因子の両方を同定しました。 P62（Sequestosome1）、既知ARIP4補因子11は、このシステム11の有効性を確認する、分析（ 表1）において同定されました。また、ARIP4と対話する他の多くの以前に報告されているタンパク質を同定しました。このようにして、SUMO2 10とDryK 13は、LC-MS / MS分析によって検出しました。 ARIP4ペプチドはまた、IPは、高品質であったことを示唆してLC-MS / MS分析を用いて同...

我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。

LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

この手順の全体的な目的は、LC-MS/MS分析を用いて核共因子と相互作用するタンパク質を同定することです。この手法は、遺伝子調節分野における転写メカニズムに関連する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、核共因子と相互作用するタンパク質を同定できることです。さらに、この手法により、標的となる核因子の転写調節メカニズムをより深く理解することが可能になります。トランスフェクションの36時間後に、氷冷PBSで細胞シートを洗浄し、セルスクレイパーで回収して、flagタグ付きARIP4を発現させたHEK 293細胞を回収します。細胞を1.5 mLチューブに移し、4°Cで8000gで2分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットをペレット体積の5倍量のHigh Salt Bufferで再懸濁します。混合物を4°Cで20分間回転混和します。20分間の回転後、チューブを4°Cで17,700g、10分間遠心分離します。次に、上清を新しい2 mLチューブに移し、上清の3倍量の希釈バッファーを加えます。再度遠心分離を行い、上清を新しい2 mLチューブに移します。この10分間の遠心分離の間に、50 µLのanti-flagビーズをPBSで洗浄します。その後、チューブを4°Cで2000g、1分間遠心分離します。上清を除去し、まず1 M glycine hydrochlorideで、次に1 M tris hydrochlorideで洗浄ステップを繰り返します。その後、Low salt bufferで2回洗浄します。次に、洗浄したビーズ 50 µL を全細胞抽出液と混合します。混合物を 2～4 °C で 4 時間、緩やかに回転させます。その後、先端を丸めたチップを使用してサンプルをマイクロスピンカラムに移し、溶液が 1.5 mL チューブに滴下して落ちるまで待ちます。フロースルーを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。次に、FLAGビーズをLow salt bufferで5回洗浄します。溶出を行うため、カラムを1.5 mLチューブに入れ、2000gで1分間遠心分離してビーズを乾燥させます。カラムの底部にキャップをし、1 M glycine hydrochlorideを50 µL加えます。室温で10分間、混合物を静かに振盪させます。10分後、カラムを新しい1.5 mLチューブに移し、2000gで1分間遠心分離します。10 µLの1 M Tris-HClを用いて溶出液を中和し、ピペッティングとボルテックスで十分に混合します。100 mM 重炭酸アンモニウムを50 µL、アセトニトリルを10 µL、ジチオスレイトールを2 µL、および中和したサンプルを50 µL加えます。56 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを室温で10分間放置します。次に、333 mMのヨードアセトアミドを10 µLサンプルに加え、37 °Cの暗所で30分間インキュベートします。混合物にトリプシンを10 µL加え、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、最終産物をLC-MS/MS施設または外部の質量分析ラボに輸送し、分析を行います。この画像は、Flag特異的抗体による免疫沈降および電気泳動による分離後、HEK 293細胞で発現させたFlagエピトープタグ付きARIP4を銀染色したものです。コントロールとして、外来タンパク質を発現していないHEK 293細胞を用いて擬似精製（mock purification）を行いました。本手法を用いることで、目的の転写因子を介して推定される核共因子を同定することが可能となり、転写調節メカニズムへの理解をさらに深めることができます。

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私たちは、真と偽のタンパク質 -...

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

このビデオでは、タンパク質間相互作用解析のためのPVDF膜上の共免疫沈降タンパク質複合体のデモを行っています。複合体から還元されたタンパク質をトリプシンで処理して、小さなペプチドで個々のタンパク質を切断し、残りのペプチドをPVDF膜から抽出しました。次に、複合体中の両方のタンパク質に由来するプルペプチドを乾燥させ、さらなる分析のために低濃度のギ酸に再懸濁しました。...

相互作用研究のための共免疫沈降タンパク質の調製のための膜上タンパク質消化

タンパク質相互作用：SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。...

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

ここでは、質量分析用サンプルの調製のための膜上消化技術のプロトコルを提示する。この技術は、タンパク質とタンパク質の相互作用の便利な分析を容易にします。...

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける動的リソソーム微小環境を特徴付けるために、ニューロンリソソーム近接標識プロテオミクスプロトコルについて説明します。リソソーム膜タンパク質およびリソソームと相互作用するタンパク質(安定または一過性)は、生きたヒトニューロンにおいて優れた細胞内空間分解能でこの方法では正確に定量することができる。...

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

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