January 24th, 2017
我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。
この手順の全体的な目標は、LC-MS/MS分析を使用して、核補因子と相互作用するタンパク質を同定することです。この方法は、遺伝子制御分野における転写メカニズムに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、核補因子と相互作用するタンパク質を同定できることです。
さらに、この方法により、標的核因子の転写制御メカニズムをよりよく理解することができます。トランスベクションの36時間後に、ARIP4を発現するHEK293細胞を、氷冷PBSで細胞シートを洗浄し、細胞スクレーパーで細胞を回収して回収します。細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、8000gで摂氏4度で2分間遠心分離します。
上清を吸引し、細胞ペレットをペレット量の5倍のHigh Salt Bufferに再懸濁します。混合物を摂氏4度で20分間回転させます。20分間の回転後、チューブを17、700gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、上清の3倍の体積に希釈バッファーを追加します。別のセトリフュージングを行い、次に上清を新しい2ミリリットルチューブに移します。10分間の遠心分離中に、50マイクロリットルのアンチフラッグビーズをPBSで洗浄します。
次に、チューブを2000gで摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を取り除き、最初に1モルの塩酸グリシンで洗浄手順を繰り返し、次に1モルの塩酸トリスで洗浄します。その後、低塩緩衝液で2回洗浄します。
次に、50マイクロリットルの洗浄したビーズを全細胞抽出物と混合します。混合物を摂氏2〜4度で4時間静かに回転させます。次に、鈍い先端を使用してサンプルをマイクロスピンカラムに移し、溶液を1.5ミリリットルのチューブに滴
下させます。液体窒素で流れをスナップ凍結し、マイナス80°Cで保存します。次に、フラッグビーズを低塩緩衝液で5回洗います。溶出するには、カラムを1.5ミリリットルのチューブに入れ、2000gで1分間遠心分離してビーズを乾燥させます。
カラムの底にキャップをし、50マイクロリットルの1モル塩酸グリシンを追加します。室温で10分間静かに振とうします。10分後、カラムを新しい1.5ミリリットルチューブに入れ、2000gで1分間遠心分離します。
溶出した溶液を1モルトリス塩酸塩10マイクロリットルで中和し、ピペッティングとボルテックスでよく混合します。50マイクロリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウムを追加します。アセトニトリル10マイクロリットル、ジチオスレイトール2マイクロリットル、中和サンプル50マイクロリットル
。摂氏56度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを室温で10分間放置します。次に、10マイクロリットルの333ミリモルヨードアセトアミドをサンプルに加え、暗闇で30分間37°Cでインキュベートします。混合物に10マイクロリットルのトリプシンを加え、摂氏37°Cで一晩インキュベートします。
翌日、最終製品をLC-MS/MS施設または第三者の質量分析ラボに輸送して分析します。この画像は、HEK 293細胞で発現したARIP4とタグ付けされたフラッグエピトープの銀染色を、フラッグ特異的抗体による免疫沈殿と電気泳動による分離後の様子を示しています。対照として、外因性タンパク質を発現しないHEK293細胞に対して模擬精製を行いました。
私たちの方法を使用すると、目的の転写因子を介して推定される核補因子を特定し、転写制御メカニズムの理解を深めることができます。
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この研究は、LC-MS/MS分析を使用して核内補因子と相互作用するタンパク質を精製する手法を提示しています。この技術は核内補因子と相互作用するタンパク質を同定し、転写調節メカニズムの理解を深めることを目的としています。
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.