頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

このプロトコルの目的は、脂肪由来間質細胞の特定の細胞集団を単離し、in vivoアッセイを用いてその骨形成能を検証することです。この手法は、損傷した骨欠損部において脂肪由来幹細胞を用いて完全に機能的な骨組織をどのように構築できるかなど、頭蓋顔面再生生物学分野における重要な課題を解決するために活用できます。本手法の主な利点は、新鮮なヒト組織から迅速に細胞を単離できる点にあり、これにより、遺伝子や細胞表面マーカーの発現を変化させることが知られている細胞培養工程を経ずに済むことです。

この技術の意義は、癌、外傷、または感染によって生じた広範な骨欠損を持つ患者にまで及びます。将来的には、ASCsの細胞集団を単離し、再生医療的に利用することが可能になるかもしれません。頭蓋骨欠損の作成は、欠損部がドーム状の頭蓋骨上に形成されること、および硬膜に非常に近い位置にあることから習得が困難であり、本技術を視覚的に提示することは極めて重要です。

このプロトコルのために、健康なヒトドナーから腹部、側腹部、または大腿部の皮下脂肪を採取し、プラスチック製の吸引キャニスターに保存しておきます。脂肪に等量の滅菌PBSを加え、30秒間緩やかに撹拌して混ぜ合わせます。水層が沈殿するまで待ち、10 milliliterのプラスチック製ピペットを用いて水層を除去します。

次に、脂肪を大きなプラスチック容器に移し、同量の消化液混合液を加えます。密閉した脂肪容器を70%エタノールで洗浄し、パラフィンで封印します。その後、37 °Cのインキュベーター内で、180 rpmで30分間振盪します。

次に、標準培地を加えて反応液量を2倍にし、消化反応を中和させます。細胞を遠心分離で沈殿させ、上清を注意深く除いた後、各ペレットを5 millilitersの標準培地で再懸濁します。その後、すべての懸濁液を100 micronフィルターに通し、50 milliliterのコニカルチューブに回収します。

ろ液を4°C、300 Gで15分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを室温のRBC溶解バッファー5 mLで再懸濁します。懸濁後、室温で5分間溶解させます。その後、室温で15分間遠心分離し、テキストプロトコルに従って分離ステップを完了させます。

適切な細胞分取がこのプロトコルにおいて極めて重要です。まず、細胞をFACSバッファーで100 µLあたり100万細胞の濃度で再懸濁し、氷上に保持します。次に、少なくとも1,000万個の細胞を、「BMPR-1B」とラベルを貼った氷上のプラスチック製遠心チューブに移します。

100万個の細胞を「unstained」とラベルした氷上のチューブに移し、1 mLのFACSバッファーを加えます。残りの細胞には「unsorted」とラベルを付けます。次に、BMPR-1Bのチューブに抗体を加え、穏やかなピペッティングで混ぜ合わせます。

この混合物を、製造業者が推奨する時間だけインキュベートします。次に、FACSソーティングのために細胞を遠心分離し、1 mLのFACSバッファーで慎重に再懸濁します。その後、この操作を繰り返し、細胞密度を10^6 cells/mLにして再懸濁します。

次に、3つの細胞集団すべてを40 µmのセルストレーナーに通し、ガラス製FACSチューブに回収します。500 µLのFACSバッファーを用いて、フィルターに残った最後の細胞を洗い流してください。続いて、抗体陽性および陰性集団用の回収用バイアルを2本用意します。

それぞれに2 mLの標準細胞培養培地を充填し、FACS装置にて、まず未染色細胞を解析し、その結果を用いて蛍光マーカーのネガティブゲートを設定します。次に、100 µmのノズルを使用して、染色細胞を標準培地を含むそれぞれのチューブにソートします。可能であれば、ソート中はこれらのチューブを4 °Cで冷却して保持してください。

テキストプロトコルに従い、細胞をスキャフォールドに播種します。動物を麻酔した後、手術部位の被毛を刈り取り、露出した皮膚をポビドンヨード溶液、次いで70% ethanolで3回洗浄します。その後、手術部位を露出させたまま、動物にドレープを掛けます。

次に、15番メスを用いて、頭蓋骨背面の大部分に及ぶ正中矢状切開を行います。その後、細歯鉗子を用いて切開線の右側の皮膚を牽引し、右側頭頂骨を露出させます。オートクレーブ滅菌済みの4 mmダイヤモンドコーティングトレパン drill bitをドリルに装着します。

次に、頭頂骨に欠損部を穿孔します。ただし、欠損部を骨を超えて広げないようにし、硬膜層を傷つけないようにしてください。ここで、細胞またはコントロール溶液を含むスキャフォールドを欠損部に配置し、皮膚の切開部をナイロン糸による連続縫合で閉じます。その後、テキストプロトコルに従い、術後のマウスケアプロトコルを進行させてください。

手術当日に実施した頭蓋骨欠損部のマイクロCTスキャンでは、新たな欠損部位が明確に示されています。その後の時点で繰り返しスキャンを行ったところ、BMPR-1B陽性細胞を播種した欠損部は、BMPR-1B陰性細胞または未分画の細胞を播種した部位よりも急速に閉鎖することが示されました。治癒を完全な創傷閉鎖に対する割合（%）として定量化すると、その差が容易に確認できます。

次に、欠損部を含む頭蓋骨の一部を脱灰し、Movat's pentachrome染色を行いました。これにより、軟骨と骨、およびその間のあらゆる成熟段階を区別し、対照群と比較して新しく再生された骨を特定しました。未分画の細胞と比較して、BMPR-1B陽性細胞は再生プロセスに強い影響を及ぼし、特に欠損部の境界に沿って顕著に見られました。このビデオを視聴することで、患者固有のASCを単離し、それを用いて骨欠損を治療するという本実験が持つ臨床的可能性について十分に理解できたはずです。

本手法から、さらに多くの骨治癒に関する疑問に答えるための多くのダウンストリーム実験を展開することが可能です。例えば、異なる系統への分化能を持つASCを単離するためのFACS、時間経過に伴う異なる細胞種や組織の治癒を解析するためのマイクロCT、あるいは本実験における頭蓋骨欠損モデルをヒントとしたさらなる骨治癒実験の考案などが挙げられます。ヒト組織の取り扱いは極めて危険であることに留意してください。手袋の着用、眼の保護具の使用、およびすべての有害廃棄物の適切な処理を含む、適切な予防措置を必ず講じてください。