DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

本手順の全体的な目的は、任意の細胞におけるゲノムワイドな複製タイミングプログラムをマッピングすることです。この手法は、ゲノム複製プログラムが健康状態および疾患状態でどのように変化するかなど、複製分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この手法の主な利点は、さまざまな細胞や条件下での複製タイミングを迅速かつ簡便にマッピングできることです。このプロトコールの執筆者は、医学部のファックス専門家であるDan Lehmannです。通常、この手順では、少なくとも1〜2 × 10⁶個の速増殖非同期細胞から開始します。

接着細胞の場合、各プレートの液を吸引し、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBS 3 mLで洗浄します。PBSを除去し、市販のTrypsin-EDTA 1 mLを各プレートに加えます。細胞が剥離するまで、37°Cで5分間インキュベートします。

3 mLの培地を加えてトリプシンを中和し、15 mLのコニカルチューブまたは5 mLのポリスチレンチューブに細胞を回収します。細胞は氷上で保持してください。この手順を開始するために、細胞を4°Cで300 x G、5分間遠心分離します。

冷PBSを1 mL加え、吸引して細胞を洗浄します。その後、細胞を遠心分離します。2回目の洗浄後、PBSを除去し、冷PBS 250 µLで細胞を再懸濁します。

チューブを穏やかにボルテックスしながら、-20 °C の 100% 高純度エタノール 800 µLをゆっくりと滴下します。これにより、最終的なエタノール濃度は 70 ～ 80% となります。細胞を氷上で 30 分間インキュベートします。

固定した細胞を500 x Gで10分間、4°Cで遠心分離することからこの手順を開始します。上清を注意深く吸引し、1 mLの冷PBSで細胞を2回洗浄します。洗浄の都度、遠心分離を行ってください。

2回目の洗浄後、上清を吸引し、各細胞を以下のPI混合液で再懸濁する。5 µLの10 mg/mL RNAseを含む1 mLのPBSと、50 µLの1 mg/mLプロピジウムヨードである。サンプルを35 µmのメッシュでろ過し、5 mLポリスチレンチューブに回収する。

チューブをパラフィルムで密封します。室温で15分から30分間インキュベートします。プロピジウムヨードは光に敏感であるため、サンプルは遮光して保存してください。

細胞はフローサイトメーターを用いてソートします。561 nmのレーザーを使用し、プロピジウムヨードの強度に基づいて細胞を分画します。最適な結果を得るために、特定の細胞サイズに対して推奨される最小のノズルを使用してください。

ほとんどの細胞において、85 µmです。一定の低速フローを使用してください。通常、毎秒300から500イベントまでとなります。

ゲーティングを用いて、FCS対SSCをプロットすることで、死細胞および細胞内デブリを識別します。生存細胞から、SSC width対SSC height、続いてFFC width対FFC height、そしてプロピジウムアイオダイド width対プロピジウムアイオダイド heightをプロットすることで、ダブレットを識別します。生存シグナル細胞について、細胞のDNA量を示すプロピジウムアイオダイド area強度のヒストグラムを作成します。

低温条件下で細胞をG1期とS期に分取します。S期のゲーティングは幅を広く設定し、G1期およびG2期にまで食い込ませてください。一方、G1期のゲーティングは狭く設定し、可能な限りS期から離してください。

一部の細胞種では、良好な細胞周期分布を得ることが困難な場合があります。S期細胞を含まずにG1期を回収することが最も重要です。ソーターから、分取した細胞が入ったチューブを取り出します。

ソート後、チューブを氷上に保持します。細胞ソートの後、各サンプルのDNAを市販のDNA精製キットを用いて、製造元の指示に従って精製します。次に、フォーカス超音波破砕機を用いてDNAをせん断し、平均ターゲットピークサイズを250 base pairsにします。

電気泳動により、剪断DNAのサイズを確認します。推奨されるサイズ分布は200〜700 bpで、ピークは約250 bpです。その後、テキストプロトコルに記載されている通りにライブラリの調製、シーケンス、および解析を行います。

マウス胚性線維芽細胞における染色体1全体の複製タイミングマップを示します。約50メガベースの領域を拡大して見てみます。点は個々のウィンドウの正規化されたS/G1比を表し、実線は3次スプライン補間による結果を表しています。

S/G1値が高いことは早期複製に対応し、低い値は後期複製に対応します。赤色の矢印は複製時間が一定である領域の例を、緑色の矢印は時間的移行領域を示しています。この図は、マウス染色体1番の同一な18メガベース領域において、マウス胚性線維芽細胞の3反復間と、マウスpre-B細胞の3反復間における複製時間マップの再現性を示しています。

オレンジ色の矢印は、細胞株間で異なる領域の例を示しています。6つのサンプルの間におけるスピアマン相関係数のヒートマップにより、これらの結果がさらに裏付けられます。細胞の回収からマップの作成までのこの手法を習得すれば、適切に実施することで1週間で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、増殖細胞における複製タイミングゲノムマップの作成方法について十分に理解することができます。