誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

この手順の全体的な目的は、誘導性のT7 RNAポリメラーゼの制御下で、複数のタンパク質を同時に発現させるための多遺伝子合成オペロンを構築することです。この手法は、合成生物学や生物化学の研究者が、多タンパク質経路を構築したり、複数の共発現アプローチに依存するタンパク質複合体を研究したりすることを可能にします。この技術の主な利点は、単一のプラスミドからEscherichia coli内で複数の遺伝子を同時に発現させることができる点にあります。

私の研究室の手順を実演するのは、博士課程の学生であるMohamed Hassanと、共同教育課程（Co-op）の学生であるAngela Thompsonです。テキストのプロトコルに従って目的遺伝子の取得および増幅を行った後、最初の目的遺伝子およびpMGXファクターの消化反応液を調製します。0.5から1.5 µgのDNAを含む40 µLの反応液を制限酵素に加えます。

反応液を37 °Cで1時間インキュベートします。その後、EcoRIを添加し、さらに1時間消化を行います。EcoRIより先にNdeIを添加することで、効率的な消化を確実にします。

NdeIは、制限部位の両側にある二本鎖DNAの長さに影響を受けます。まずNdeIを添加することで、フルレングスの環状プラスミドを確実に切断させます。消化反応液を0.7%アガロースゲルにロードし、100 Vで55分間電気泳動を行います。

次に、清潔なメスまたはカミソリの刃を用いて、インサートおよびベクターのバンドを切り出し、切り出したゲルの断片を1.5 milliliterチューブに入れます。ゲル抽出キットを使用し、テキストのプロトコルに従ってDNAを精製します。0.15から0.5 microgramsのベクターDNA、遺伝子のサイズに応じた適量のインサート、および1 microliterのT4 DNA ligaseを含む20 microliterのライゲーション反応系を調製します。

無菌条件下で、化学的コンピテントセルであるXL1-Blue E.coli細胞の100 µL分注液を氷上で5分間解凍します。次に、目的遺伝子を含むライゲーション反応液5 µLを細胞に加えます。形質転換サンプルを氷上で30分間インキュベートします。

次に、42 °Cのウォーターバスで細胞を45秒間ヒートショックします。その後、形質転換細胞を氷上に置き、冷えたLB培地を200 µL加えます。細胞を2分間インキュベートします。

細胞を37°C、220 rpmで1時間インキュベートし、適切な選択マーカーを含むLB寒天平板に100 µLを塗布します。形質転換体の候補となるコロニーをスクリーニングするために、陰性対照とライゲーション平板のコロニー数を比較します。コロニー数の比率が1:2となることが望ましいです。

各ライゲーション反応から4〜8個の単一コロニーを選択し、適切な抗生物質を含む4 mLのLB培地に接種します。培養物を37 °C、220 rpmで一晩インキュベートします。プラスミドDNA単離キットを用い、テキストのプロトコルに従ってプラスミドDNAを精製し、150〜500 ngのDNAにNdeIおよびEcoRIを各1 µLずつ加えて、20 µLの消化反応液を調製します。

消化反応を37 °Cで2時間インキュベートします。遺伝子1を含むpMGXベクターに遺伝子2を挿入するには、目的の最初の遺伝子を含むベクターDNA 0.5〜1.5 µgとAVR2 1 µLを含む40 µLの消化反応液を調製します。反応液を37 °Cで1.5時間インキュベートした後、Calf-intestinal phosphatase 1.5 µLを添加します。

さらに30分間インキュベートします。次に、2番目の目的遺伝子を含むpMGXベクター0.5〜1.5 µgを含む、40 µLの消化反応液を調製します。この際、AVR2とxpolをそれぞれ1 µL使用します。

反応液を37 °Cで2時間インキュベートします。制限酵素消化物を0.7%アガロースゲルで電気泳動します。その後、前述の手順に従い、清潔なメスまたはカッターを用いてインサートおよびベクターのバンドを切り出します。

テキストプロトコルに従ってプラスミドDNAを抽出し、サンプルの定量を行った後、gene 2とpMGX-yfg1を3:1のインサート対ベクター比でライゲーション反応を行います。pMGX-yfg1のみを用いたネガティブコントロールも含めてください。先に示した手順に従い、各反応液5 µLをXL1-Blue細胞に形質転換します。

次に、ネガティブコントロールプレートとライゲーションプレートのコロニー数を比較します。ネガティブコントロールプレートに多数のコロニ－が見られる場合は、CIP処理を確認してください。ライゲーション反応から4〜8個の単一コロニーを選択し、それぞれのコロニーを用いて、適切な抗生物質を添加したLB培地 4 µLに接種します。

37 °C、220 rpmで一晩培養します。前述と同様にプラスミドDNAを単離および定量した後、150～500 ngのDNAと1 µLのEcoRIを含む制限酵素消化反応を行い、2番目の遺伝子が正しく挿入されているかを確認します。反応液を37 °Cで2時間インキュベートします。

スクリーニング目的にはEcoRIが推奨されますが、場合によってはEcoRIによってサイズが似通った2つ以上のインサートが生成され、ゲル上で判別が困難になることがあります。確実に成功させるためには、NdeIなどの代替制限酵素を使用する必要があります。消化反応物をアガロースゲルで電気泳動し、挿入した遺伝子2のサイズに相当するバンドを確認してください。

テキストプロトコルに従って、追加の遺伝子をプラスミドにクローニングします。ポリシストロニックプラスミドを構築するため、まず5つの遺伝子を適切なプラスミドであるpMGX Aにクローニングしました。この図は、pMGX Aプラスミドに含まれるpCR-Blunt-yfg1およびpCR-Blunt-yfg2と、indelおよびEcoRIで消化したpMGX Aを示しています。最初の2つの遺伝子をpMGX Aにクローニングするために、プラスミドをindelおよびEcoRIで消化しました。

クローニング後、正常にクローンが得られたことを確認するために、pMGX-yfg1およびpMGX-yfg2をAVR2およびxpolで消化した。この図は、AVR2で消化したpMGXyfg1ベクターと、目的遺伝子2を単離するためにAVR2およびxpolで消化したpMGX-yfg2ベクターを示している。得られたインサートをpMGX-yfg1にクローニングし、pMGX-yfg1 twoベクターを作製した。

ここで示されているように、EcoRIによるpMGX-yfg1の消化により、目的遺伝子2のpMGX-yfg1へのクローニングが成功したことが確認されました。このゲル画像は、インサートが正しい方向で挿入された消化済みプラスミドと、逆方向に挿入されたものの違いを示しています。インサートが逆方向である場合、2つのEcoRI部位が近接するため、消化によって生じる50 base pairの断片はゲル上で検出不可能となり、バックボーンはより大きくなります。

最後に、5つの遺伝子を含むポリシストロニック発現ベクターを作製し、発現したタンパク質のウェスタンブロットを行うことで、単一のベクターから5種類すべてのタンパク質が発現していることを確認します。なお、yfg5によって産生されるタンパク質はyfg1と同サイズであるため、ゲル上で分離されないことに注意してください。この手法に習熟し、正しく行えば、pMGXバックボーンに挿入される遺伝子1つにつき3〜4日で完了させることができます。

この手順を行う際は、Calf-intestinal phosphataseなどのホスファターゼを用いてベクターを処理および線状化し、ベクターを脱リン酸化することを忘れないでください。この手順に従い、in vivoでの多重遺伝子発現などのさらなる実験を行うことで、天然物生産のための生合成経路の特性解析および利用、あるいはタンパク質複合体の研究が可能になります。この技術は、合成生物学分野の研究者が複雑な炭水化物を合成し、遺伝子組換えE.Coliを作製するための道を開きました。

このビデオを視聴することで、E.coliにおける多遺伝子発現システムの構築方法について十分に理解できるはずです。