蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学
2008年1月8日
我々は我々の研究室では非常に日常的に使用する凍結およびパラフィンセクションの両方に変性した表皮内の免疫局在のための信頼性の高い方法を説明します。
表皮に。免疫組織化学は、特定のタンパク質をその発現コンパートメントに局在させる効率的な手段です。このビデオでは、私たちの研究室で日常的に使用している表皮内のタンパク質の免疫局在化のための信頼性の高い方法を紹介します。
こんにちは、オタワ健康研究所の低層ビルにある慢性疾患プログラムのトリノ博士研究室のタミーです。今日は、マウス表皮のパラフィン包埋組織切片に蛍光抗体を用いた免疫組織化学の手順をご紹介します。当研究室では、BO'S固定組織を用いた免疫局在化表皮分化マーカーのプロトコールを最適化しました。
最適化の一環として、ペーパータオルの上に広げて固定することで、皮膚を平らに保ちます。この手順には、表皮の固定、脱水、パラフィン包埋、切片切断、脱ワックス、補水抗原、抗体標識のマスキング解除、最後にエピ蛍光によるマウントと視覚化が含まれます。それでは始めましょう。
新生児用マウスを使用する場合、背中の皮膚を剃る必要はありません。ただし、毛皮のある高齢のマウスを飼っている場合は、切片を切るのに邪魔にならないように、背中の皮膚を剃る必要があります。解剖を行うときは、アッセイに使用したい皮膚の領域に鉗子を入れないように細心の注意
を払いたいものです。そこで、私たちが行うのは、鉗子を切断する場所の端に置き、その後、非常に慎重に持ち上げて表皮を切断し、実験に使用したい領域に触れないように注意することです。皮膚を固定するときは、皮膚が丸まってチューブの中に入るのは望ましくありません。私たちはそれが素晴らしくて平らであることを望んでいます。
そこで、私たちが行うことは、ペーパータオルの上に皮膚を敷き、固定している間、皮膚が平らになるようにすることです。さて、ペーパータオルの上で肌がきれいに平らになったので、私たちが行うことは、鉗子で損傷した可能性のある部分を取り除くために、端を切り取るか、トリミングすることです。そして、皮を約2ミリメートル×2ミリメートルの非常に小さな断片に切ります。
これでティッシュが固定されます。皮を扱いやすい部分に切った後、ボイン溶液に浸します。チューブにキャップをし、チューブをパーフィルで包み、ロッカーに置きます。
一晩のインキュベーションでは、boin溶液で16〜18時間だけインキュベートすることが重要です。固定期間が短くなったり長くなったりすると、組織が損傷します。インキュベーションは終わりました。
ティッシュをPBSですすぎ、次に30%50%と70%のアルコールを使用して一連のエタノール洗浄を行います。BOの色は黄色で、洗濯をすると、恩恵が薄れるにつれて、洗濯の色が黄色が少なくなることがわかります。毎回30分で2回洗います。
エタノールサンプルでの最後の洗浄に続いて、新鮮な70%エタノールに入れ、パラフィンのいくつかのベントをさらに処理するまで摂氏4度で保存することができます。埋め込み。凍結組織を過剰に使用すると、組織の完全性が優れており、サンプルを長期間保存できる可能性があります。一般に、コア施設は、より再現性の高い結果を生成します。
しかし、その施設と専門知識を持つ専任のオペレーターがいれば、セクションを社内でカットすることができます。良い切片の切り方を学ぶのは、むしろ芸術の域を出ています。そのため、コアファシリティを使用しています。
コア施設からスライドを受け取った後、パラフィンがスライド上に存在することがわかります。スライドを薄膜として、ベイクドポテトのようにアルミホイルで包んだラックに置き、55度で5分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、スライドをすばやく開封し、スライドをトルエンに5分間3回洗浄します。
これらの5分間洗浄機はタイミングがよく、インキュベートが長すぎる必要があり、トルエンは標本に良くないことを覚えておくことが非常に重要です。3回の洗浄とトルエンの後、100パーセントエタノールですばやくすすぎます。エタノールとトルエンは実験を妨げる沈殿物を形成するため、これは覚えておくべき非常に重要なステップです。
次に、サンプルをスライドをインキュベートすることにより、95%エタノールで5分間、70%エタノールで5分間、次いで水中で5分間2回インキュベートすることにより再水和する。この時点で、組織をhおよびeで染色するために処理することができます。そのために、コア施設も利用しています。
抗原のマスキングを解除するには、500ミルの1回のクエン酸緩衝液を1リットルのプラスチックビーカーに入れ、スライドを浸します。金属製のハンドルを取り外し、ビーカーを電子レンジに入れることを忘れないでください。高出力で2回5分間マイクロ波します。
2つのインキュベーションの間に電子レンジを冷やすためにドアを開けることを忘れないでください。電子レンジでの加熱が終わったら、スライドを沸騰したクエン酸緩衝液から取り出し、ぬるま湯を入れた染色皿に入れます。温かい水道水を使用するだけで、その目的はスライドを沸騰状態から室温までゆっくりと冷やすことです。
これで、PBSでスライドを5分間3回洗浄でき、免疫組織化学を開始する準備が整いました。免疫染色を開始するために最初に行う必要があるのは、ティッシュペーパーで標本の周囲を乾燥させることです。抗体のクロスコンタミネーションを防ぐために、リキッドブロッカーで検体の周囲に境界を定めています。
ペトリ皿に濾紙を入れて加湿チャンバーを準備します。水に浸し、余分な水を取り除き、スライドを挿入します。加湿チャンバーを使用する理由は、インキュベーション期間中にスライドが乾燥しないようにするためです。
スライドが乾かないことは非常に重要です。なぜなら、描くと背景が増えるからです。このとき、スライドをインキュベーションバッファーで30分間ブロックします。ブロッキング後、スライドをスライドラックに戻し、洗浄バッファーでインキュベートします。
以前と同様に、余分なバッファを削除します。スライドを加湿チャンバーに戻し、一次抗体と1時間インキュベートします。室温で。
1時間のインキュベーションが終了したら、スライドをスライドラックに戻し、ウォッシュバッファーで10分間3回洗浄します。洗浄後、ティッシュペーパーで標本の周りから余分な洗浄バッファーを取り除きます。スライドを加湿チャンバーに戻し、二次抗体とインキュベートした後、二次抗体と室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーを3回ずつ15分間交換して洗浄します。
次に、5分で3回洗います。PBSでは、試料を囲む余分な液体を取り除き、スライドの背面からPBSを拭き取って、カバースリップをスライドに取り付けます。私たちは2.5%DAB co.でモバイルを使用しています。
退色を抑えるために、スライドに80マイクロリットルのドロップワイズを追加します。気泡が入らないように注意してください。次に、カバースリップを非常にゆっくりと下げます。
泡を残さないように注意してください。気泡が悪いのは、携帯電話が乾いた後に写真を撮りたい場所など、標本のすぐ上に着地することが多いからです。これで、スライドを見る準備が整いました。
ここでは、FITCフィルターを使用した染色の成功例をご紹介します。20 倍の対物レンズでは、表皮のすべての超基底層に関連付けられた Clain six が見られます。当研究室では、表皮におけるクローディンの発現と局在化に非常に興味を持っています。
タイトジャンクションと表皮透過性バリアの形成に関して、マウスの皮膚で免疫組織化学を行う方法を示しました。この手順を行うときは、組織切片を平らにしたいこと、およびインキュベーションの合間にスライドが乾燥しないようにしたいことを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、凍結切片とパラフィン切片の両方に適用可能な、表皮内のタンパク質の免疫局在化のための信頼性の高い方法を提示します。この技術は、表皮分化マーカーの研究のために、研究室で日常的に使用されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫組織化学
- 表皮生物学
- タンパク質局在化
背景
- 免疫組織化学は、特定のタンパク質を局在化させるために不可欠です。
- 表皮分化マーカーのためのプロトコルが最適化されています。
- 適切な固定と埋め込みは組織の完全性にとって重要です。
- 蛍光抗体はタンパク質の視覚化を強化します。
研究の目的
- 信頼性の高い免疫局在化方法を実証すること。
- 表皮分化の研究のためのプロトコルを最適化すること。
- 研究者のための詳細な手順を提供すること。
使用された方法
- マウス皮膚からの表皮の解剖と固定。
- パラフィン埋め込みと切片作成。
- 抗原のアンマスキングと抗体ラベリング。
- 上部蛍光顕微鏡を用いた可視化。
主要な結果
- 表皮分化マーカーの成功した局在化。
- 最適化されたプロトコルを使用した結果の再現性の実証。
- 表皮における免疫組織化学のための包括的なガイドの提供。
- 適切な組織調製の重要性の強調。
結論
- この方法はタンパク質の局在化に信頼性が高く効率的です。
- 最適化されたプロトコルは実験結果を向上させることができます。
- このアプローチは様々な研究用途に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Immunohistochemistry enables precise protein localization in epidermal layers, supporting target validation in dermatology and barrier function research. The method provides mechanistic de-risking by linking protein expression to functional compartments in mouse epidermis. Reliable staining improves predictive confidence in preclinical models of skin biology and permeability barrier formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by localizing proteins to basal, suprabasal, and stratum corneum compartments.
- Operational Value: Uses optimized paraffin and frozen section protocols to ensure reproducible antigen detection.
- Predictive Value: Supports functional inference of epidermal differentiation markers through subcellular expression patterns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence readouts for protein expression across epidermal layers.
- Reproducibility: Standardized fixation (Bouin’s or PFA) and antigen unmasking steps reduce variability between runs.
- Platform Reuse: Compatible with core facility processing and epi-fluorescence microscopy for scalable implementation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links tight junction proteins like claudin-6 to epidermal permeability barrier formation.
- Translational Continuity: Enables progression from discovery localization to preclinical validation of barrier function.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides spatial expression data to prioritize targets involved in skin integrity and dermatological disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of skin-related mechanisms.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by assigning proteins to specific epidermal compartments.
- Screening: Delivers standardized, quantitative immunofluorescence outputs for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Enables comparison of protein localization patterns across conditions using fluorescence intensity and layer-specific signals.
- Translational Research: Connects molecular localization to functional outcomes like barrier formation in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunohistochemistry pipeline for epidermal target validation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through compartment-specific protein localization.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, sectioning, and staining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in skin biology targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on epidermal expression and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, fixation, and sectioning to maintain epidermal integrity.
- Depends on access to core facilities for paraffin embedding, section cutting, and antigen unmasking.
- Necessitates optimization of antibody compatibility with Bouin’s or PFA fixation based on epitope sensitivity.
- Involves standardization of blocking, washing, and mounting steps to minimize background and preserve fluorescence.
- Limited by antibody availability and performance after harsh paraffin processing steps.
