Name: 幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ幼生ゼブラフィッシュの性腺組織解剖法。受精後17日目からの組織採取と分子解析により、性分化の遺伝子制御メカニズムを解明する。発生生物学研究に有用な手法です。

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私たちは、魚のケアのためのCチャンに感謝します。この作品は、中国の国家自然科学基金（GPへ31171074、31371099と31571067）によって及び浦江タレントプロジェクト（GPへ09PJ1401900）によってサポートされていました。

ゼブラフィッシュ実験は、復旦大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。ゼブラフィッシュは、標準的な手順20に従って上昇させて飼育しました。 1.準備<ol><li>幼虫のゼブラフィッシュDPF 17 DPFと25を育成<ol><li>交差前日午後遅く交差タンクに移し2のオスとメスの2大人のゼブラフィッシュ（、3〜6ヶ月、健康的な実験室アブ・ストレイン）。バリアで男性と女性を分離します。翌朝、タンクの水をリフレッシュし、それらが交尾できるようにするために障壁を取り除きます。受精後1〜2時間、100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。 </li><li>初期の開発期間（4日間）の間に28.5°Cで40 mLの胚培地（EM）と100mmのプレートで約40胚を保ち、一日二回EMをリフレッシュ。 1 Lタンク（300 mLのシステム水40幼虫）に幼虫を移し、5 DPF後生ワムシ（全電源、一日二回）で供給。10 DPFの後にライブブラインシュリンプの代わりに、ワムシの食事を養います。 21 DPF 14に再循環水システムの中に魚を転送します。 </li><li> 17 DPF又は25 DPFまで再循環水システムにおける幼虫ゼブラフィッシュを上げます。明/暗サイクルを保証するシステムの水の14/10時間およびpH値は約7.2です。 17 DPF（5.5 6.8ミリメートル）の体長を測定し、25 DPF（8〜11 mm）の幼虫22。 </li></ol></li><li>解剖2％寒天プレートを準備します。 <ol><li> 200mLの滅菌水に4gの寒天を加えます。それが透明になるまでマイクロ波オーブン中で混合物を加熱します。 </li><li>次いで、直径60mmのペトリ皿（プレートのおよそ1/3量）にそれを注ぎ、約15分間、寒天溶液を冷却します。 4°Cで固化寒天プレートを保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.プロトコール1：幼虫DPF 17及び25の生殖組織を分析<ol><li> 17 DPFの幼虫を麻酔するためにタンクに砕いた氷を追加します。転送30 mLの冷リンゲル液でペトリ皿冷却100mMの麻酔幼虫。完全に幼虫を麻酔するために、少なくとも15分間冷却リンゲル液中で培養した魚を保管してください。 </li><li>小さなプラスチックのスプーンで予冷した寒天プレートに幼虫を転送します。 10 mLの全体の魚の体を水没リンゲル液を冷却し、そっとその側にそれを置きます。 </li><li> 25X実体顕微鏡の視野の下で以下の操作を行います。安定化のためのピンセットで魚のトランクをクランプします。ピンセットの別のペアと心に肛門から縦方向に腹部をリッピング。静かに内臓を露出するために、本体の片側に皮膚や筋肉を取り除きます。 </li><li>慎重に浮き袋に腹器官の質量を削除します。浮き袋に添付生殖腺にダメージを与えることは避けてください。 </li><li>浮き袋と前部本体との間の接続を遮断します。優しく全体の浮き袋と生殖腺組織を引き出します。 注：ほとんどの場合S、17 DPFの性腺組織は、上皮組織とprotonephridiumを取り巻く含まれています。それらは容易に分離されていないが、25℃で容易に分離することができるDPF。生殖腺は、肛門に接続されています。肛門で相互に接続され、左右の生殖腺との接合は、はっきりと見えるであろう。 </li><li>慎重に浮き袋から生殖腺組織を分離し、周囲の脂肪組織をクリーンアップするためにピンセットを使用してください。 </li><li>直ちに200μLのリンゲル液を含有する予冷1.5mLの遠心管に、単離された生殖腺組織を移します。すべての生殖腺組織が幼虫から分離されるまで、チューブを氷上に保管してください。 </li><li> 2.7 - 手順2.1に記載したように25 DPFの幼虫の生殖腺を解剖。 </li></ol> 3.プロトコル2：孤立生殖腺組織の遺伝子発現を分析<ol><li>幼虫性腺組織からトータルRNAを抽出します。 <ol><li>新しいRNaseフリー1に分離された生殖腺組織を転送します。5mLのチューブ及びリンゲル液を除去します。 100μLの溶解液を追加します。組織が完全に溶解するまでボルテックス。 </li><li>製造業者の説明書に従って全RNA抽出手順を実行します。 </li><li>私はバッファ10倍DNアーゼの1/10量とRNA溶液にDNアーゼIの1μLを加え、穏やかに混合。 37°Cで20分間インキュベートします。 </li><li> RNA溶液に1/10量のDNase不活性化試薬を追加します。 70°Cで10分間インキュベートします。分光光度計を用いて全RNAの濃度を測定します。 -20℃で保管してください。 </li></ol></li><li>第一鎖cDNA合成を行います<ol><li>製造業者のプロトコルに従って第一鎖cDNA合成を実行するためにオリゴ（dT） - リンカープライマーを使用します。 20μLの総反応容量にRNAの1〜2μgのを追加。 </li><li> 45℃で90分間反応溶液をインキュベートします。 5分間70℃で加熱することによって反応を停止。 </li><li> cDNAに1μLのRNase Hを追加しますので、残留RNAを除去するためにlution。 〜13,000×gで10秒間静かに遠心混ぜます。 37°Cで20分間インキュベートします。 20μlのヌクレアーゼを含まない水を追加します。 -70℃で保管してください。 </li></ol></li><li>蛍光定量的PCRを行います<ol><li>蛍光色素でサイクラーシステム上で定量PCRを行います。 30秒、15秒、15秒、95℃で35サイクル、TM-5°C、68°C以下のPCRサイクル条件を使用します。次のようにプライマー配列を使用する：AMH（FWD：GTGGATGGCAGCAGTACGAC; REV：GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG）、cyp19a1a（FWD：GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV：CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG）、nanos3（FWD：GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）、 ヴァーサ （FWD：ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）とβアクチン （FWD：AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV：GCACTTCCTGTGGACGATGGA）19。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ゼブラフィッシュは、強力なモデルとなっており、広範囲の開発と疾患関連研究に使用されています。例えば、脳、心臓、生殖腺、腎臓などのアダルトゼブラフィッシュにおける臓器の単離のための方法は、ウェル23、24、25を文書化されています。小型及び幼虫のゼブラフィッシュにおける生殖組織の動的再造形に、生殖腺組織の単離は困難な作業です。幼虫の生殖腺26を検査するためにEGFPベースの細胞選別とレーザーマイクロダイセクション：これまでの研究では、全体の解剖トランク組織またはトランスジェニック脈を使用します。栽培中の第4染色体の改変は、家畜ゼブラフィッシュにおける性別決意謎を行います。ここで説明する私たちの方法は、性決定メカを探索するために役立つことができ、さらに形態学的および分子検査のために、比較的きれいで、早期の生殖腺の製剤を提供することができますanisms。 <p class="jove_content"...

野生のゼブラフィッシュ4染色体の主要な女性セックス行列は、1（ すなわち 、共通の実験室株）を紛失したり、飼いならされたゼブラフィッシュに変更されます。代わりに、彼らは、温度、低酸素症、食品の可用性と人口密度などの環境要因を伴う多遺伝子のセックス決意システムを持っています。ゼブラフィッシュのセックス開発の詳細なメカニズムは完全には理解されていません。プライマリ性別決意信号（単数または複数）/何であるか、そのようなゼブラフィッシュ性別決意が発生した場合のように基本的な質問は、であり、遺伝子は、生殖腺の変換の最初のステップは、3 2 に答えされずに残って調節います。 ゼブラフィッシュのセックス、開発の過程では、いくつかの重要な段階では認識されています。開発の初期段階では、4 HPF（時間後に受精）始原生殖細胞（始原生殖細胞）仕様を受け、から出発して生殖隆起に移動および増殖。 PGC番号と生殖細胞と体細胞間の相互の相互作用は、生殖腺の分化4のために重要です。 13 DPF（日受精後）では、生殖腺は、未分化段階にあります。 17のDPFすることにより、生殖腺は、将来、女性と男性の両方における双方向性卵巣へと発展します。卵巣からの精巣にアポトーシス依存遷移は21〜25 DPFから始まり、数週間継続することができます。 35のDPFにより、生殖腺の性別が決定されており、性別特異的配偶子生産は両方の卵巣に進行中であると5精巣、6、7。 現在まで、多様な候補遺伝子とセックス決意のメカニズムが提案されています。プロテオミクスとトランスクリプトーム解析は、性的二型表現で多くの遺伝子を単離したこれらの遺伝子は、ゼブラフィッシュ8に性分化を研究するために利用されてきました</sup&gt; 9、10。例えば、幼生ゼブラフィッシュでは、cyp19a1a遺伝子は特になく、精巣11,12における卵巣において発現されます。また、AMH遺伝子が弱く卵胞顆粒膜細胞で発現するが、強く精巣のセルトリ細胞13れます。対照的に、Vasa遺伝子は、連続的に適切な性腺マーカー14、15作り、女性と男性の両方ゼブラフィッシュの生殖細胞において発現されます。 性腺遺伝子発現レベルを調べることは、特に双電位卵巣ステージ3,9に性別決意と分化の分子機構を理解することが重要です。しかし、幼虫のゼブラフィッシュおよび対応小さな生殖腺のサイズが小さいgonadaの単離を複雑さらなる分子分析のためにL組織。以前の研究では、operculaと肛門の気孔16との間の解剖全体のトランク域を使用しました。この準備は、生殖腺を含むが、複数の組織や器官から構成されています。あるいは、脈などの生殖腺特異的GFP発現を有するトランスジェニック動物：EGFPの蛍光活性化細胞選別（FACS）およびレーザー捕捉マイクロ切開17、18 を介して、性腺組織単離のために使用しました。しかし、彼らの広範なアプリケーションが限られています。ここでは、17 DPFと25 DPFの幼虫のゼブラフィッシュからの性腺組織を分離するための簡単な手順について説明します。我々は、他の器官に対する生殖腺の位置を示し、周囲の組織から形態学的に無傷の生殖腺を分離します。我々はさらに、（例えばヴァーサとcyp19a1aなどの生殖腺特異的遺伝子は高度に定量的PCRを介してトランク組織と比較して、単離された生殖腺で発現される表示します定量PCR）分析。本プロトコルは、それによって性腺組織19のその後の分子分析を可能にする、幼生ゼブラフィッシュから生殖腺特異的遺伝子の同定、単離、RNAの精製及び増幅を可能にします。

<table><tbody><tr><td>細胞培養皿 100 mm</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>胚インキュベーション用</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>必要な1 Lの場合:17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl&#183;2H<サブ>2</サブ>O;次に、0.41 gのKH2PO4、0.412 gのNa2HPO4無水および4.9 gのMgSO4&#183を追加します。7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>蒸留水で20x EMを希釈</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>遺伝子</td><td>121985</td><td>2%寒天プレートの調製用</td></tr><tr><td>Trizol 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>用 メーターガラス</td><td>シェンボー</td><td>250 ml</td><td>2%寒天プレートの調製用</td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>AGAR</td></tr><tr><td>の加熱用ピンセット デュモン#5INOX</td><td>ワールド精密機器</td><td></td><td>解剖用</td></tr><tr><td>500341 実体顕微鏡</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>純水装置</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リンガー'</td><td></td><td></td> 1 <td>Lの溶液が必要な場合:6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl2、および1.19 gのHepesを追加します。pHを7.2に調整します。ろ過により滅菌し、オートクレーブ滅菌した透明なポリカーボネート容器に保管してください。</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Metal bath</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Model GL-150</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>顕微鏡写真用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスケール RNA 単離キット</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>生殖腺組織からのRNA単離用</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>RNA溶液中のDNA消化用</td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientific</td> <td>#K1631</td><td>First-strand cDNA合成用</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td> <td>#EN0202</td><td>cDNA溶液中の残留RNAを消化します。</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>本製品は、Taq DNAポリメラーゼベースのリアルタイムPCR用2倍マスターミックスで、SYBR Green Iとのインターカレーションアッセイに適用できます。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>全RNAの濃度の測定</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 ハンブルク</td><td>遺伝子発現プロファイリング</td></tr></tbody></table>

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

野生のゼブラフィッシュは、ZZ / ZWセックス決意システムを有するが、飼いならされたゼブラフィッシュは、性染色体を失っています。彼らは、ゲノム全体に分布するいくつかの遺伝子は、まとめて、個々の魚の性同一性を決定多遺伝子性別決意システムを利用します。現在、生殖腺の発達の調節に関与する遺伝子とその仕組みは、とらえどころのないまま。通常、生殖腺組織を分離することは、セックスの発生過程を調べるための最初のステップです。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫DPF 17 DPF（日受精後）と25からの性腺組織を分離するための手順を提示します。単離された生殖腺組織は、その後、形態学および遺伝子発現プロファイリングによって調べることができます。

生殖腺の解剖は、アブ・ストレイン幼虫のゼブラフィッシュで行われました。 図1は、17 DPF、25 DPFにおける幼虫のゼブラフィッシュの典型的な性腺組織を示しています。まず、皮膚や腹部の片側の筋肉は内臓を露出するように切断されます。臓器の質量を除去した後、一緒に生殖腺を有する水泳膀胱トランクに残ります。生殖腺は、水泳膀胱（ 図1B &#39;の矢印）の腹側に取り付けました。 17のDPFでは、生殖腺は、双方向性卵巣段階にありました。単離された生殖腺は、左右の生殖腺を含有し（ 図1C）、半透明でした。ほとんどの場合、それは、上皮組織とprotonephridium（ 図1Cの矢印）に囲まれました。性腺DPF 25でしばしば脂肪組織（ 図1D）で...

ここでは、ゼブラフィッシュの性分化とメンテナンスの調査を容易にするであろう幼虫のゼブラフィッシュの生殖腺組織を単離するためのプロトコルを提示します。

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

この手順の全般的な目的は、ゼブラフィッシュ幼魚から生殖腺組織を単離し、単離した組織の分子特性を解析することです。この手法は、生殖腺の発達を制御する遺伝子の保存性や、ゼブラフィッシュの性分化の分子基盤など、ゼブラフィッシュの性発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、受精後わずか 17 日という早期のゼブラフィッシュ幼魚から生殖腺組織を摘出し、細胞学的および分子生物学的な状態を解析できることです。一般的に、ゼブラフィッシュ幼魚の生殖腺組織はサイズが小さく、動的な再構成が行われるため、この手法に慣れていない方は苦労されると思われます。生殖腺の摘出に備えて、成魚のオス2匹とメス2匹を、仕切りのある交配タンクの両側にそれぞれ移します。翌朝、タンクの水を換え、仕切りを取り除いて交配を開始させます。受精から1〜2時間後に、約40個の卵を回収し、40 mLの胚培養基（EM）が入った100 mmプレートに移します。胚を28.5 °Cで4日間培養し、EMを1日2回更新します。培養後、幼魚を1 Lタンクに移します。受精後5日（DPF）から、魚に生きた輪虫を給餌します。仔魚が受精後10日（10 DPF）に達したら、生きたブラインシュリンプを給餌します。その後、14 DPFで魚を循環式水処理システムに移します。ゼブラフィッシュの仔魚を17 DPFまたは25 DPFまで育成します。その後、17 DPFおよび25 DPFにおける幼魚の体長を測定します。200 mLの滅菌水に4 gのアガロースを加えて、解剖用の2%アガロースプレートを作成します。混合物を電子レンジで加熱し、透明になるまで溶かします。アガーを15分間冷却した後、直径60 mmのペトリ皿に注ぎます。凝固したアガープレートを4 °Cで保存します。麻酔をかけた17 DPFの幼魚に対し、タンクに砕氷を加えます。麻酔した幼魚を、30 mLの冷やしたリンガー液が入った100 mmの冷却ペトリ皿に移します。幼魚を完全に麻酔させるため、冷却したリンガー液中で15分以上インキュベートします。プラスチックスプーンを用いて、幼魚をあらかじめ冷却しておいたアガープレートに移します。魚の全身を10 mLの冷却したリンゲル液に浸し、ゆっくりと横向きに寝かせます。実体顕微鏡を用いて25倍の倍率で観察しながら、ピンセットで魚の体幹を挟んで固定します。次に、別のピンセットを使用して、肛門から心臓に向かって腹部を縦方向に切り裂きます。次に、体の片側の皮膚と筋肉をそっと取り除き、内臓を露出させます。その後、浮袋の腹側にある大きな臓器を注意深く取り除きます。浮袋に付着している生殖腺を傷つけないように注意してください。浮袋と体内との接続部を切断します。次に、浮袋全体と生殖腺組織を慎重に引き出します。ピンセットを用いて、浮袋から生殖腺組織を丁寧に分離します。そして周囲の脂肪組織を除去します。単離した生殖腺組織を、200 µLのリンゲル液が入った予冷済みの1.5 mL遠心チューブに直ちに転送します。すべての幼魚から生殖腺組織を分離させるまで、チューブを氷上で保持してください。幼虫の生殖腺組織から全RNAを抽出するには、分離した生殖腺を新しいRNaseフリーの1.5 milliliterチューブに移し、リンゲル液を除去します。次に、lysis solutionを100 microliters加えます。そして、組織が完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。製造元の指示に従って全RNA抽出を行った後、RNA溶液にDNase Iバッファーを液量の10分の1量、およびDNase Iを1 µL加え、チューブの内容物を穏やかに混合します。サンプルを37 °Cで20分間インキュベートします。次に、RNA溶液にDNase不活性化試薬を液量の10分の1量加えます。サンプルを70 °Cで10分間インキュベートします。次に、分光光度計を用いて全RNA濃度を測定します。第1鎖cDNA合成を行うには、メーカーのプロトコルに従い、oligo-dTリンカープライマーと1〜2 µgのRNAを使用します。反応液を45°Cで90分間インキュベートします。次に、サンプルを70°Cで5分間加熱し、反応を停止させます。残留RNAを除去するため、cDNA溶液に1µLのRNase Hを加えます。チューブの内容物を穏やかに混合し、サンプルを約13,000 ×gで10秒間遠心分離します。チューブを37 °Cで20分間インキュベートします。その後、サンプルに20 µLのヌクレアーゼフリー水を加えます。そして、cDNAを-70 °Cで保存します。最後に、テキストプロトコルに記載されている条件とプライマーを用いて、蛍光染料によるqPCRを行います。この図は、17 DPFのゼブラフィッシュ幼魚の典型的な生殖腺組織を示しています。ここで見られるように、生殖腺は浮き袋の腹側に付着しています。17 DPFにおいて、幼魚は半透明の左生殖腺と右生殖腺を有しています。ほとんどの場合、生殖腺は上皮組織と原腎管に囲まれています。25 DPFにおいて、生殖腺はしばしば脂肪組織に包まれており、大小さまざまな生殖腺が観察される場合がある。最後に、単離した生殖腺組織の分子特性を解析するため、生殖腺マーカーであるamh、cyp19a1a、nanos3、およびvasaの発現レベルをQPCRにより検討した。その結果、対照組織と比較して、生殖腺組織においてマーカー遺伝子の有意な増加が示された。この手法に習熟し、適切に実施すれば、1時間で完了させることができます。この手順を行う際は、期待される結果を得るために不可欠であるため、ゼブラフィッシュの稚魚に一貫した飼育条件を提供することが重要です。本手法の開発により、性発達の分野の研究において、ゼブラフィッシュの性決定メカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュの幼魚から生殖腺組織を分離する方法について十分に理解できるはずです。

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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