3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

この手順の目標は、生体適合性側鎖液晶エラストマーに基づく生分解性の3次元フォーム様細胞足場を調製することです。この方法は、液晶エラストマーの特性が細胞の増殖とアライメントに及ぼす影響など、液晶および生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この2次元細胞足場法の主な利点は、2Dマクロ環境ではめったに不可能な空間的な細胞間相互作用の研究を可能にすることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、触覚圧縮テストに苦労するでしょう。この方法のアイデアは、何百ものペトリ皿のメディアを交換する必要があった後に最初に思いつきました。液晶エラストマーは、3Dネットワーク上で筋肉細胞をサポートし、多くのシャーレを使わずに済むのではないかと考えました。

この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、一部のステップで化学物質を慎重に操作する必要があるため、非常に重要です。さらに、金属フォームテンプレートの成形は困難な場合があります。まず、20ミリリットルのアンプルに、トルエン中のPFOTESの2容量%溶液を入れます。

アンプル内の溶液を24時間攪拌して、アンプル内部をシラン化します。シラン化アンプルをイソプロピルアルコールですすぎ、摂氏140度で30分間乾燥させます。3.64グラムの蒸留イプシロン - カプロラクトン、0.5グラムのα - クロロイプシロン - カプロラクトン、および0.25ミリリットルのグリセロールを乾燥アンプルに入れる。

混合物を1分間ボルテックスします。次に、混合物に4.90グラムのDL-ラクチドを加え、アンプルの雰囲気を窒素ガスで1分間パージします。アンプルの開口部をアルミホイルで覆い、120°Cで約2時間加熱してDL-ラクチドを溶かします。

混合物をボルテックスして未溶融の固体をかき乱し、次に、アンプルに66マイクロリットルの10-2-エチルヘキサン酸塩を加え、再びボルテックスします。アンプルをアルミホイルで閉じ、120°Cで10分間加熱してDL-ラクチドを再溶解します。DL-ラクチドが再び溶けたら、混合物を激しくボルテックスし、アンプルの雰囲気を窒素ガスでパージします。

アンプルをゴム製の中隔で密封します。真空ラインに接続された針を中隔に通し、真空を開始します。ゴム栓が溶けないように注意しながら、アンプルのネックをフレームシールします。

ネックが密閉されたら、反応混合物を摂氏140度で48時間加熱します。次に、混合物を室温まで冷まします。アンプルを割って開き、粘性反応混合物を10ミリリットルのジクロロメタンに溶解します。

混合物を分離漏斗に移します。100ミリリットルのメタノールが入ったフラスコをドライアイスとアセトン浴に入れ、メタノールを摂氏約マイナス78度に冷却します。メタノールが冷えたら、分液漏斗をフラスコに固定します。

反応混合物を毎秒2滴の速度で冷メタノールに加えます。得られた白い沈殿物を濾紙に集めます。沈殿物を50〜60°Cの真空オーブンで乾燥させて、3アームα-クロロSBC製品を得ます。

αコレステリル3アームSBCを調製するために、ペンダント塩素原子をアジ化物で置換する。5-ヘキシノ酸コレステリルとのクリック反応により、液晶部分としてペンダントコレステリルが生成されます。液晶エラストマー足場の調製を開始するには、0.75グラムのα-コレステリル3アームSBCを0.25ミリリットルのHDIおよび0.24ミリリットルの蒸留イプシロン-カプロラクトンと組み合わせます。

これに60マイクロリットルの10-2-エチルヘキサン酸塩を加え、混合物を渦巻きます。次に、1センチ×4センチメートルのニッケル金属フォームを切り取ります。ニッケルフォームを直径1センチメートル、高さ1センチメートルの円筒に丸めて、液晶エラストマーフォーム足場のテンプレートを形成します。

テンプレートをガラスバイアルまたはアルミホイルの筐体に入れ、液晶エラストマー混合物をテンプレートに完全に覆われるまで注ぎます。テンプレートを液晶エラストマー混合物に2分間置いてから、ピペットで余分なものを取り除きます。混合物とテンプレートを摂氏80度で一晩加熱します。

次に、アルミホイルを剥がすか、ガラスを割ってください。かみそりの刃を使用して余分な液晶エラストマーを取り除き、ニッケル金属テンプレートを露出させます。泡をフラスコに入れ、塩化鉄3の飽和水溶液70ミリリットルを加えます。

溶液中の泡を室温で3日間攪拌し、ニッケルテンプレートを溶解します。24時間ごとに、脱イオン水で泡を30分間攪拌し、その後、新しい鉄3塩化物溶液で攪拌を再開します。攪拌の2日目の後、液晶エラストマーフォームの触覚圧縮試験を行います。

触覚圧縮に対する耐性は、ニッケルテンプレートがフォームにまだ存在していることを示しています。3日目以降、すべてのニッケルテンプレートが除去され、結果として生じるフォームは非常に柔らかく、完全に圧縮しやすいように見えます。ニッケルテンプレートは完全に排除する必要があります。

触覚圧縮試験を行う際には、液晶エラストマーフォームを塩化鉄で手触りが柔らかくなるまで十分にすすぐことが重要です。これで、液晶エラストマーフォームの足場の特性評価と使用が可能になりました。液晶エラストマーフォームが柔らかくなったら、70%エタノールですすぎ、滅菌します。

播種手順を開始するには、液晶エラストマーフォーム足場を70%エタノール1ミリリットルで2回再度洗浄し、エラストマー表面を滅菌します。その後、足場にUVライトを10分間照射します。足場を70%エタノールの別の1ミリリットル部分で洗います。

足場を滅菌水とリン酸緩衝生理食塩水でそれぞれ1ミリリットルですすいでください。滅菌した液晶エラストマースキャフォールドを24ウェル培養プレートにロードします。目的の細胞の懸濁液を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む適切な細胞増殖培地で調製し、カウントします。

増殖培地を用いて、細胞懸濁液を100マイクロリットル当たり5個目の細胞の1.5倍に希釈する。希釈した細胞懸濁液を各液晶エラストマー足場の上に一滴堆積させます。播種した液晶エラストマー足場を摂氏37度で5%CO2雰囲気で2時間インキュベー

各足場にさらに0.5ミリリットルの成長培地を追加し、インキュベーションを続けます。48時間ごとに、播種した足場を1ミリリットルのPBSで洗い、新鮮な成長培地を追加します。細胞が顕微鏡検査の準備ができるまで、スキャフォールドのインキュベートを続けます。

これらのスメティックLCは、細胞の成長と増殖を促進しながら、複雑な組織構築物の研究を可能にします。細胞の生存率を維持するためには、フォームを滅菌し、培養物の清浄度を常に維持する必要があります。顕微鏡検査の準備をするには、PBS中の4%パラホルムアルデヒド溶液で15分間、細胞を足場に固定します。

サンプルを3ミリリットルのPBSに5分間3回浸します。1つの足場サンプルをエッペンドルフチューブに入れます。500マイクロリットルのPBSに0.1%DAPIの溶液でサンプルを10分間染色します。

サンプルを1ミリリットルのPBSに5分間2回浸します。その後、すぐに共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングします。サンプルにまたがる画像スタックを取得し、画像処理プログラムでデータを分析します。

液晶部分を持つ3アームSBCを、HDIを架橋剤としてニッケルフォームテンプレートに鋳造しました。ニッケルテンプレートをエッチングで除去し、液晶エラストマーフォームを得た。エッチングプロセスを監視するために、圧縮変形試験を定期的に実施しました。

ニッケルが完全に溶解すると、圧縮変形試験では、圧縮時にサイズが70%縮小することが示されました。圧縮を解除すると、液晶エラストマーフォームは一貫して元のサイズと形状に戻りました。この挙動は液晶部分に起因しており、コレステロールのイプシロン-カプロラクトン部分を欠く同様のエラストマーフォームは圧縮から回復しなかった。

内部フォーム形態のSCMは、中空フォームストラットの相互接続されたネットワークを示しました。規則的な形態はニッケルフォームの構造に起因し、適切な金属テンプレートを選択することで細孔サイズと全体的な形状を制御できることを示しています。フォームには神経芽腫細胞が播種され、2日以内にネットワークの壁に付着しました。

播種から30日後、共焦点顕微鏡により、細胞が液晶エラストマーネットワーク上に広がり、エラストマーフォーム全体に分散した複数の層を形成していることが明らかになりました。細胞核の伸長が観察され、細胞の整列と相関していました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば3〜4週間で行うことができます。

このビデオを見れば、特定の細孔サイズと形態を持つ液晶エラストマー細胞の足場を設計および調製する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、各製品を完全に特性評価し、細胞の生存率と増殖をモニタリングすることが重要です。さらに、共焦点顕微鏡画像を簡単に取得するためには、適切な染色技術が重要です。

この手順に続いて、液晶エラストマーは、ストレスや磁場、電場などの外部刺激にもさらされ、液晶エラストマーの異方性分子秩序が細胞応答にどのように影響するかについての追加の質問に答えることができます。この手法は、シミュレートされた疾患活動とその後の修復プロセスに対する外部エージェントの影響を動的に研究するためのプラットフォームを提供するため、疾患プロセスの研究にも当てはまります。このスメクティック液晶エラストマーフォームは、細胞間相互作用に関する洞察を提供するだけでなく、半導体や金属ナノ構造などの他の材料にも使用できます。

この技術は、その開発後、生物医学分野の研究者が生命システムを反映した長期的な実験プラットフォームを設計する道を開きました。