マウスの血管の顔面準備

マウス頸動脈および大動脈の顔面の準備を行う手順が記載されている。そのような調製物は、特異的抗体で免疫蛍光染色されたとき、共焦点顕微鏡法によってタンパク質の局在化および血管壁全体の細胞型の同定を研究することができる。

この手順の全体的な目標は、左頸動脈結紮後の顔面免疫染色のためにマウス大動脈と頸動脈を準備することです。この方法により、免疫染色法における胞状細胞や他の血管細胞の組織化、各タンパク質発現、および可能な状態を研究することができます。En Face Preparationは、血管全体の広い領域の分析を可能にし、さまざまな正常および可能な細胞パラメータの発現における地域差を評価することができます。

その手順を実演するのは、私たちのグループのマイクロサージョンであるDr.Quaicoです。まず、麻酔をかけたマウスを仰臥位の手術用ボードの上に置きます。つま先をつま先でつま先を挟む反応がないことを確認した後、前足をボードに伸ばした位置で、両後ろ足をマウスの右側にして首の左側に露出させます。

頸部周辺の毛を取り除き、露出した皮膚を消毒します。手術部位に穴を開けた滅菌済みの外科用ドレープでマウスを覆い、動物の目に軟膏を塗ります。マウスを解剖顕微鏡下で動かし、頸部の周りに腹側正中線切開を行います。

血管を覆う唾液腺を動物の左側に再配置して、左内頸動脈と左外頸動脈に分岐する左総頸動脈を露出させます。左内頸動脈の周囲と下の結合組織を静かに除去し、鉗子を使用して動脈の下に2.5センチメートルの長さのプレカットシックスOシルク縫合糸を通し、2番目の鉗子を使用して縫合糸をその長さの約3分の1を血管の反対側に引っ張ります。左内頸動脈を結紮します。

次に、先ほど示したように左外頸動脈の周りの結合組織を切除し、左上甲状腺動脈の近位に結紮を行います。後頭動脈を除くすべての動脈が結紮されたら、唾液腺を元の位置に戻し、生理食塩水を2〜3滴垂らして術野を水分補給します。次に、6つのOコーティングされたビクリル縫合糸を使用して皮膚を閉じ、マウスを事前に温めたケージに入れ、完全に横臥するまで監視します。

実験の終了時に、マウスを解剖板上の仰臥位に固定し、虹彩はさみを使用して腹腔を露出させ、正中線切開を行います。肋骨を胸骨に対して横方向に切り込み、胸腔を露出させます。次に、大腿動脈を切開し、左心室の頂点に設定された重力充血に取り付けられた26ゲージの針を挿入して、ヘパリンを補給した生理食塩水で循環器系を大量に使用します。

カットから流れる生理食塩水が透明になるまで、豊富に増殖を続けます。次に、プロフュージョンシステムを生理食塩水からPBS中の4%パラホルムアルデヒドに切り替えます。5分後、マウスを解剖顕微鏡下で動かし、鈍い端のはさみと鉗子を使用して大動脈と左右の頸動脈を採取します。

次に、組織をPBSのペトリ皿に移し、脂肪と結合組織を慎重に除去し、続いて大動脈と頸動脈を分離し、縦方向に分裂させて内皮を露出させます。アンフェイス血管製剤を作る際に覚えておくべき最も重要なことは、乱暴な取り扱いによって内皮細胞が簡単に損傷を受けるということです。特に収穫と清掃のステップ中は、いつでも容器を伸ばさないでください。

次に、各容器をウェルあたり0.5ミリリットルの透過処理溶液を含む12ウェルプレートの個々のウェルに移します。室温で揺さぶって血管を10分間透過処理した後、PBSで短時間洗浄します。TTBSで計画された二次抗体と同じ種由来の10%正常血清に30分間インキュベーションし、室温で揺さぶりながら、非特異的結合をブロックします。

次に、目的の一次抗体をTTBSで希釈し、10%正常血清で一晩、摂氏4度で揺さぶってサンプルを標識します。翌朝、室温で揺さぶりながらTTBSで10分間の洗浄を3回行い、血管をすすぎ、続いてTTBSおよび10%正常血清およびダッピーで希釈した適切な二次抗体でインキュベートします。サンプルをロッカーとカバーに戻して、光から保護します。

室温で1時間後、ロッキング洗浄でサンプルを新しいTTBSで3回洗浄した後、PBSで短時間すすぎ、容器ごとに1滴の退色防止試薬を個々の22 x 50ミリメートルのカバーグラスに置きます。顕微鏡下で、内皮を下に向けて試薬の各滴に1つの容器を入れ、サンプルごとに22 x 75 mmのスライドガラス1個で容器を覆います。スライドを清潔な実験室用ワイプに置き、2枚の実験室用ワイプと3.5キログラムの重りで覆い、血管を平らにします。

最大5分後、重りを取り除き、カバースリップの周りから余分な溶液を拭きます。次に、カバースリップの四隅にマニキュアを塗り、カバースリップ面を上にしてスライドボックスに入れます。翌朝、マニキュアをもっと使ってカバースリップを完全に密封し、マニキュアが乾いたらすぐに容器をイメージします。

ここでは、抗VEカドヘリンおよび抗血管細胞接着分子One Objectsで染色され、肋間動脈の開口部近くで撮影されたマウス大動脈の単一の光学切片を示す、内皮二重の典型的な顔面免疫蛍光画像が示されています。内皮細胞の接着接合部で染色される緑色の直線状のアウトラインと、血流の乱れが発生することが知られている肋間動脈の開口部で染色される強力な抗血管細胞接着分子に注意してください。これらの画像では、手術の1日後に部分的に結紮された左頸動脈とコントロールの結紮されていない右動脈の顔面染色が観察でき、結紮された血管で1つの染色が明らかな抗血管細胞接着分子の増加が見られます。

このビデオを見た後、部分的な左頸動脈結紮を行う方法と、マウスの血管で顔面の準備を行う方法についてよく理解しているはずです。これを光学機器と一緒に他の小動物に持っていきましょう。顔面用調製物の使用は、現在、免疫蛍光染色に限定されていますが、オリオール染色後の全領域の研究やex vivoカウンター実験など、他の方法と一緒に使用することもできます。