Name: リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ オリゴペプチド競合キナーゼアッセイによるリン酸化部位決定法。複数の潜在的リン酸化部位を同時評価し、生化学・細胞生物学研究における翻訳後修飾の役割解明に有用です。

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この研究は、韓国政府の資金援助を受けた韓国国立研究財団（MSIP）（No. 2015R1A2A1A10052663およびNo. 2014M1A3A3A02034698）の支援を受けて行われました。

1.安全性注意：このプロトコールでは、[γ- 32 P] -ATPを用いてAMPKの活性を評価しています。リン-32は放射性同位元素であり、主にβ線を放出する。ベータ粒子のサイズは非常に小さいので、衣類や肌に容易に浸透することができます。ベータ線への外部および内部の両方の暴露は、皮膚の火傷および組織の損傷を引き起こすことを含め、人の健康に有害な可能性があります。 <ol><li>アクリル遮蔽などの適切な保護を使用して[γ- 32 P] -ATPの使用を必要とするすべてのステップを実行します。 </li><li>すべての人員に、すべての手技中に有害な放射線への暴露の程度を監視するために、電子式個人線量計（EPD）が装備されていることを確認する。 </li><li>適切な訓練と規制当局の承認後にのみ、オープンソースの放射線を取り扱うこと。 注：ここでは、すべての実験は、ソウル国立大学でのオープンソース放射線使用の訓練の終了後に行われた韓国政府（nssc.go.kr/nssc/en）の承認を得た。 </li><li>地域の規制に従って放射性廃棄物を処分する。 注：ここでは、ソウル国立大学環境保護安全研究所の指示に従った。以下は、米国および欧州諸国の規制当局のリストである：米国、米国原子力規制委員会（http://www.nrc.gov/）。英国、健康安全局（HSE）（http://www.hse.gov.uk）;フランス、Autoritédesûreténucléaire（https://www.asn.fr/）;ドイツ、連邦環境省、自然環境保全、建築・原子力安全局（BMU）（http://www.bmu.de）などがあります。 </li></ol> 2. インビトロ競合キナーゼアッセイ<ol><li> 競合ペプチドの構築 <ol><li> AMPKによってリン酸化されたコンセンサスモチーフを決定する。 注：AMPKはコンセンサスモチーフを認識し、＃934; - [X、β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ。コンセンサス配列において、Φは疎水性アミノ酸（バリン[V]、ロイシン[L]、メチオニン[M]およびイソロイシン[I]）を表し、βは塩基性アミノ酸（ すなわちリシン[K]、アルギニン[ R]、およびヒスチジン[H]） 1 。 </li><li>上記コンセンサスモチーフに従って、標的配列からセリンまたはスレオニン残基を選択する。ヒトNrf2の3つの推定部位を使用する（Ser153を含む＃1、148-157; Ser335を含む＃2、330-339;およびSer558を含む＃3,553~562）。 </li><li>推定上の部位を模倣する10残基のペプチドを商業的に合成する。合成した生成物を、各ペプチドについて98％以上の純度を有する凍結乾燥粉末として得る。 </li><li>キナーゼ緩衝液を用いてペプチドを溶解し、71.667g / Lの濃度にする。ペプチドがキナーゼ緩衝液に溶解しない場合は、それを20％DMSOに溶解する。それが不溶性のままであるならば、putを模倣するペプチド溶解性を高めるために延長することができる。 </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> インビトロ競合AMPKキナーゼアッセイ <ol><li>以下のように5×キナーゼ緩衝液を調製する：100mM HEPES、pH7.4; 25mM MgCl 2 ; 5mM EGTA; 5mM DTT; 125mMβ-グリセロリン酸（セリン/トレオニンホスファターゼ阻害剤）; 5mM Na 3 VO 4 （チロシンホスファターゼ阻害剤）。 0.5％（v / v）プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII、1mM冷ATP;および500μMAMP。 注：AMPは、AMPK活性を試験するためのキナーゼ緩衝液の必須成分である。この緩衝液は、セリン/スレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼの両方の活性を測定するために使用することができる。 </li><li>以下の組換えタンパク質および合成ペプチドを氷上で解凍する：AMPK; Nrf2;オリゴペプチド＃1、＃2、および＃3を含む。 </li><li>氷上で0.15μgのAMPK、0.4μgのNrf2（〜4pmol）、0.43mgのオリゴペプチド（約300nmol）、および6μLの5×キナーゼ緩衝液の反応緩衝液を調製する。 A滅菌蒸留水（DW）で最終容量を30μLに調整する。 注：反応緩衝液を調製した後の[γ- 32 P] -ATPの添加は、キナーゼ自己リン酸化による放射性シグナルを減少させる可能性がある。 </li></ol></li><li> 反応物質の運転 注記：以下のすべてのプロセスは、アクリルシールド、ラックまたはブロック、および適切な個人用保護具を使用して保護下で行う必要があります。 <ol><li>実験開始前に加熱ブロックを30°Cに設定してください。 </li><li>氷上で[γ- 32 P] -ATP（1μCi）1μLを反応チューブに加えます。ピペッティングにより反応バッファーを数回上下に混合する。 注： 32 Pの放射能は、約14日間の短い半減期を有する。半減期を考慮して（ 例えば、 [γ- 32 P] -ATPの産生から1ヶ月後、[γ- 32 P] -ATPの4μLを添加して）-ATPを1μCiとする）。 </li><li>試料を30℃の加熱ブロックに15〜30分間インキュベートする。この工程中、7.5％ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルを調製する。標的タンパク質のサイズに応じてゲルのパーセンテージを調整する。 </li><li> 10％SDSサンプル緩衝液（10％（v / v）グリセロール、20％（w / v）SDS、15.42％（w / v）ジチオスレイトール、90％（v / v）0.5 Mトリス-HCl（pH6.8）、および0.02％（w / v）ブロモフェノールブルー）を添加した。ピペッティングにより反応バッファーを数回上下に混合する。 </li><li>サンプルを7.5％SDS-PAGEゲルで70Vで20分間、140Vで1時間連続して試験する。 注記：ゲルの最後のブロモフェノールブルーラインには、非常に高い放射性シグナルが含まれています。バックグラウンドシグナルを減らすために次のステップに進む前に、青色の線より下のゲルを取り除くことをお勧めします。 </li><li> SDS-PAGE後、キャスターからゲルを静かに取り出します。ゲルをガラスに入れる次のステップのためにube。 </li><li>固定緩衝液でゲルを20分間固定する（50％メタノールおよび10％氷酢酸）。 </li><li>静かにゲルを濾紙上に移し、透明なラッパーで覆う。ゲルがこの段階で容易に引き裂かれることがあることに注意してください。真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥する。 </li></ol></li><li> 視覚化 <ol><li>燐光体スクリーンまたはX線フィルムのいずれかにゲルを一晩（通常約16時間）さらす。 注：蛍光体スクリーンは、超明るい光にさらされた後に再使用することができます。 X線フィルムを使用する場合は、ゲルを2日間暴露してください。 X線フィルムは、蛍光体スクリーンよりも感度が低い。 </li><li>蛍光体イメージャで蛍光体スクリーンをスキャンします。画像を高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして書き出します。 </li><li>視覚化した後、クーマシーブリリアントブルー（CBB）染色用ガラスまたはプラスチック容器にゲルを移す。 </li><li> DWでゲルを洗う。 DWを破棄して汚れゲルを染色試薬で1時間インキュベートする。 </li><li>試薬を捨て、DWでゲルを1時間または一晩脱染色する。透明なプラスチックフィルム（またはそれに相当するもの）の間にゲルを置き、オフィススキャナーでスキャンします。 </li></ol></li></ol> 3.部位特異的突然変異体を用いるインビトロキナーゼアッセイ<ol><li> pGEX-Nrf2の部位特異的突然変異誘発 <ol><li>変異原プライマー設計 注：突然変異誘発プライマーの設計は突然変異誘発の成果にとって重要です。以下は、突然変異誘発プライマーの設計のためのいくつかの考慮事項です。プライマーの中央に所望の変異を有する25〜45塩基からなるプライマーを作製する。プライマーは40〜60％のGC含量を有し、1つ以上のGまたはC塩基で終結する必要があります。プライマーのT mが、式[T m = 81.5 + 0.41（％GC） - （675 /塩基長） - ％ミスマッチ]に従って78℃以上であることを確認する。 注：その純度は変異効率にとって重要であるからである。変異原性プライマーを設計するためのいくつかのウェブサイトがあります。 <ol><li> 「部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの設計」（http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp）のプライマー設計プログラムを開きます。 </li><li>ヒトNrf2 DNA配列（Access No. NM_006164.4）を貼り付け、「翻訳したものをアップロードする」ボタンを選択します。 </li><li>アラニンに変換される翻訳されたアミノ酸配列からセリン558残基を選択する。突然変異誘発プライマーを使用して、アラニンの代わりにagcからgccへのセリンのコドンを置換する。 </li><li>プライマーの長さ、T mおよびGC含量を考慮する。 注：突然変異誘発プライマーは最終的に5&#39;-ctactgaaaaaaaaaacccccttatatctcgaag-3 &#39;として設計されています。 </li></ol></li><li>ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた変異鎖合成のための反応<ol><li> PCR反応混合物を氷上で調製する：10×反応緩衝液、50ngのpGEX-GST-Nrf2,125ngのフォワードプライマー、125ngのリバースプライマー、1μLのdNTP混合物（各10mM）、2.5UのPfu DNAポリメラーゼ、および滅菌DWを50μLに添加した。 </li><li>以下のサイクリングプログラムを用いてpGEX-GST-Nrf2変異体鎖合成のためのPCRを行う：95℃で30秒間1サイクル; 95℃で30秒間、55℃で1分間、および68℃で90秒間の18サイクル; 68℃で5分間、1サイクル。 注：プラスミドの長さによっては、サイクリングパラメータが変更されることがあります。 </li><li>氷上に2分間置いて次の工程のために反応物を冷却する。あるいは、4℃で一晩保存してください。 </li></ol></li><li> Dpn I消化および突然変異プラスミドの選択<ol><li>冷却後、各反応物にDpn I制限酵素（10U /μL）1μLを添加する。ピペットでよく穏やかに混合し、1分間遠心分離する。 </li><li> 37℃で2時間インキュベートして、親pGEX-GST-Nrf2二本鎖DNAを消化し、一本鎖DNA。 </li><li> DH5αスーパーコンピテント細胞を氷上で静かに解凍する。 </li><li>あらかじめ冷却したDH5αスーパーコンピテント細胞150μLに50μLの反応物を添加し、少なくとも30分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 42℃に予熱した加熱ブロックにチューブを移し、90秒間放置する。 2分間氷上に置く。 </li><li> 形質転換されたDH5α細胞に予熱した溶菌液（LB）を添加し、180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>形質転換された細胞をLB-アンピシリン寒天プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする。 注：プラスミドGEX-GST-Nrf2はアンピシリン耐性マーカーを有するため、アンピシリンを選択に使用する。突然変異誘発されたプラスミドの耐性マーカーに応じて、適切な抗生物質を使用してください。 </li><li>プレートから単一のコロニーを選択し、5mLのLB-アンピシリンに移し、180rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。突然変異誘発配列の確認のために、少なくとも3つのコロニーを評価する。 </li><li> DNA配列分析のためにDNAミニプレップキットを用いてDNAを抽出する;製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>製造者のプロトコールに従って自動DNA配列分析器を用いて突然変異誘発DNA配列を確認する。変異体配列の確認のために少なくとも200 ngのDNA構築物を使用する。 </li></ol></li></ol></li><li> 組換えGST-Nrf2タンパク質の精製 <ol><li>大腸菌における突然変異誘発性GST-Nrf2融合タンパク質の発現 <ol><li>突然変異誘発性pGEX-GST-Nrf2プラスミドをBL21細胞に形質転換する。アンピシリン（100μg/ mL）を含む25 mLのLBブロスに1つのコロニーを接種し、37℃で一晩回転器でインキュベートする。 </li><li>培養した細胞を、100：100の希釈比でアンピシリン（100μg/ mL）を含有する100mLのLBブロスに接種する。 </li><li> 37℃でインキュベートする。または600nmでの吸光度が約0.4〜0.8（約4時間）に達するまで繰り返す。 </li><li> 100μLの1M IPTGを100mLの培養細胞に添加して、1mM IPTGの最終濃度を調製する。 </li><li>タンパク質を発現させるために、回転子上で30℃で6時間または一晩細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞を5,000 xgで20分間遠心分離し、1mLの細菌溶解緩衝液（25mM HEPES、5mM EDTA、2mM DTT、0.1％CHAPS、1μg/ mLペプスタチン、0.5μg/ mLロイペプチン、および1mMのPMSF）を氷上でインキュベートした。 </li><li>最大パワー出力の50％で2分間、2秒間隔で超音波ホモジナイザーを用いて細胞ペレットを溶解する。 </li><li> 12,000×gで15分間4℃で細胞を遠心分離し、上清を集める。 </li></ol></li><li>組換えGST-Nrf2タンパク質の精製<ol><li> 200μLの50％（v / v）グルタチオン - アガロースビーズを調製し、1mLのPBS（pH 7.3; 140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na 2 </sub&gt; HPO 4 、および1.8mM KH 2 PO 4 ）。 500×gで1分間遠心分離してビーズを集める。洗濯を3回繰り返します。 </li><li> 50％（v / v）グルタチオンアガロースビーズ200μLに細胞溶解物を加え、4℃で2時間インキュベートする。 </li><li> 500 xgで1分間遠心分離してGST-Nrf2タンパク質と結合したグルタチオン - アガロースビーズを回収する。 31G針を備えた1mLシリンジを用いて上清を除去する。 </li><li>ステップ1のようにビーズを1 mLのPBS（pH 7.3）で洗浄します。 </li><li> GST-Nrf2と組み合わせたグルタチオン - アガロースビーズに500μLの溶出バッファー（50mM Tris-HClおよび10mM還元グルタチオン、pH 8.0）を添加する。エンドオーバーエンド回転子で4℃、30分間インキュベートする。 </li><li> 500xgで1分間遠心分離し、上清を集める。 </li><li>再度300μLの溶出緩衝液をビーズに加え、3.2.2.5-3.2.2.6の工程を2回繰り返す。 </li></ol></li><li>精製されたGST-Nrf2タンパク質の確認<ol><li> 0.5μgの標準タンパク質BSAでタンパク質量を視覚化するためにサンプル5μLを調製する。 </li><li>サンプルを7.5％SDS-PAGEゲルで70Vで20分間、次いで140Vで60分間実行する。 </li><li> 0.1％CBB染色溶液（0.1gのCBB R250,40mLの99％メタノール、10mLの氷酢酸、50mLの蒸留H 2 O）で2時間染色し、脱色した（メタノール30mL、 10mLの氷酢酸、および60mLの蒸留水）で、バンドがはっきりと示されるまで撹拌する。 </li><li>消化したゲルを濾紙に置き、透明なラッパーで覆う。真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥する。 </li><li> インビトロ AMPKキナーゼアッセイのためのデンシトメトリーによる突然変異体GST-Nrf2タンパク質の量を決定する。 </li></ol></li></ol></li><li> サイト特異的突然変異体を用いたインビトロ AMPK活性アッセイ NOTE： インビトロ AMPKキナーゼアッセイは、0.4μgの精製野生型GST-Nrf2またはGST-Nrf2-S558A突然変異体をペプチド阻害剤なしで使用して、工程2.2〜2.4に従って実施する。手順1で説明した放射線安全ガイドラインにすべて従ってください。 <ol><li> 0.15μgのAMPK、0.4μgの変異型または野生型GST-Nrf2、および6μLの5キナーゼ緩衝液で氷上で反応バッファーを調製する。滅菌DWで30μLまで充填します。 </li><li>氷上で反応チューブに[γ- 32 P] -ATP（1μCi/μL）1μLを加えます。ピペットで上下に数回反応バッファーを混合し、遠心分離します。 </li><li>サンプルを30℃の加熱ブロックで30分間インキュベートする。 </li><li> 3μLの10×SDSサンプルバッファーを加えてキナーゼ反応を停止させます。 </li><li> 7.5％SDS-PAGEゲル中、70Vで20分間、次いで140Vで1時間実行する。 </li><li>固定緩衝液でゲルを20分間固定し、それを濾紙上に移し、透明体でゲルを覆うentラッパー。 </li><li>真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥させ、蛍光体スクリーンまたはX線フィルムのいずれかに一晩さらす。 </li><li>蛍光体イメージャで蛍光体スクリーンをスキャンし、ステップ2.4に従って可視化した後、CBB染色のためにゲルをガラス管に移す。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

AMPKが仲介する予測されるリン酸化部位の真正性を評価する簡単で便利な方法として、競合的なペプチドを用いて特異的なリン酸化部位を発見し、部位特異的突然変異体を用いて検証するために使用できるin vitroキナーゼアッセイをここで説明する。 。 インビトロ競合的AMPK活性アッセイから得られた代表的なデータは、部位特異的突然変異タンパク質を用いたアッセイの結果と一致し、ペプチド競合アッセイがリン酸化部位を決定するための有用なツールであることを示している。この方法は、セリン40 3で Nrf2をリン酸化するPKCδによってリン酸化された特異的部位を同定する研究においても用いられた。ペプチドは競合的にタンパク質に結合するので、結合モチーフ10,11を同定するためのインビトロ GSTプルダウンアッセイに原則を適用することもできる。さらに、このペプチドミメtic法は、リジン残基でのアセチル化のような他の翻訳後修飾の同定にも適用可能である。 こ...

特定の残基でのタンパク質リン酸化は、広範囲の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、シグナル伝達ネットワークの理解は、特異的なリン酸化部位の同定を必要とする。さらに、リン酸化部位は、タンパク質内の個々のドメインが異なる構造および機能を有するため、タンパク質機能に対する効果を決定する。主要な抗酸化転写因子である核因子エリトロイド2関連因子2（Nrf2）の活性は、異なる部位でのリン酸化によって双方向的に調節される。我々の研究は、Nrf2のリン酸化を触媒するキナーゼに焦点を当てている。酸化チャレンジに対するNrf2のストレス応答は、主にセリン40でのリン酸化を介して急速に起こり、Nrf2を活性化するプロテインキナーゼC（PKC）-δによって媒介される3,4 。逆に、Fynは、チロシン5でNrf2の阻害的リン酸化を触媒するアクティビティの厳密な制御のために68。 リン酸化部位を発見するために使用される最も一般的な方法は、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析である。迅速かつ高感度なリン酸化部位マッピングデータをこのように生成することができる。しかし、それにはいくつかの技術的な制限があり、しばしば偽陰性シグナルが生成されます。シーケンスのカバレッジが悪いと、LC / MS分析で頻繁に発生します。リン酸化部位を同定するためには、タンパク質の最大アミノ酸含量に関する情報が必要である6 。消化工程中のいくつかのプロテアーゼによる目的タンパク質のタンパク質分解は、配列カバレッジを改善するのに役立つ可能性がある。リン酸化残基の同定のためのもう一つの障害は、セリンおよびトレオニンリン酸化ペプチドでしばしば観察されるリン酸の容易な損失である6,7。不安定なリン酸部分はしばしば断片化プロセス中にホスホペプチドから放出される。リン酸化部位を探索する場合の第2の選択肢は、ペプチドマイクロアレイ法を用いることである。目的のタンパク質に由来するペプチド断片を含むマイクロアレイチップを用いて、キナーゼ標的部位をスクリーニングすることが可能である。しかしながら、マイクロアレイチップの製造および検出のための装置要件のために、ペプチドマイクロアレイ法は時間がかかりかつ高価であると考えられている。 これらの課題を克服するために、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイを、既知の認識モチーフを有するプロテインキナーゼのために使用することができる。キナーゼのコンセンサス認識モチーフが確立されれば、候補基質の推定上のリン酸化部位を予測することができ、部位の真正性を確認することができる。この手順の最も説得力のある方法は、突然変異体タンパク質におけるリン酸化の抑止を示すことであり、このタンパク質では、d残基は、非リン酸化性アミノ酸（ すなわち、セリンまたはトレオニンからアラニン;チロシンからフェニルアラニン）で置換される。しかしながら、突然変異体タンパク質の産生および単離は時間がかかる。研究の初期段階における選択肢として、競合的ペプチドキナーゼアッセイは簡単で便利である。ここでは、 インビトロペプチド競合アッセイおよびリン酸化部位の確認のためのプロトコールについて記載する。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, LakePlacid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue staining reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>複数の解凍と凍結サイクルを避ける</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオンセファロース 4B</td><td>GEヘルスケア、マールボロ、マサチューセッツ</td>州<td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>酢酸氷</td><td>河Duksan純粋な化学物質、安山、韓国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチルアルコール &nbsp; &nbsp;</td><td>大中化学品 &Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>台風 FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドライヤー</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>ダンシングシェーカー</td><td>FINEPCR, ソウル, 韓国</td><td>CR300</td> ステップPCRマシンの<td>洗浄にはマシンが必要です</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター/シェーカー</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>LABOGENE, Seoul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーカラム</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ヘラクレス、CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

特定の部位でのタンパク質のリン酸化は、その立体配座および他の分子との相互作用を決定する。したがって、タンパク質のリン酸化は、細胞の生物学的機能および特性に影響を及ぼす。現在、リン酸化部位を発見するための最も一般的な方法は、迅速かつ高感度な方法である液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析によるものである。しかしながら、比較的不安定なリン酸部分は、しばしば偽陰性シグナルを生じる断片化段階の間にホスホペプチドから放出されることが多い。そのような場合、部位特異的突然変異体を用いる伝統的なインビトロキナーゼアッセイはより正確であるが、この方法は面倒で時間がかかる。したがって、ペプチド競合を用いる代替方法が有利であり得る。 5 &#39;アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のコンセンサス認識モチーフが確立されており、位置スキャニングペプチドライブラリーを用いて検証したay 2 。したがって、新規基質のAMPKリン酸化部位は、ペプチド競合アッセイによって予測および確認することができた。この報告では、AMPK媒介性核因子赤血球2関連因子2（Nrf2）リン酸化を示すことにより、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細なステップおよび手順を記載する。リン酸化部位を認証するために、我々は部位特異的突然変異体を用いて順次in vitroキナーゼアッセイを行った。全体として、ペプチド競合アッセイは、複数の潜在的なリン酸化部位をスクリーニングし、リン酸化部位突然変異体による検証のための部位を同定する方法を提供する。

図1と図2は、以前に報告された論文8の繰り返し実験の結果を示しています。推定上のAMPK標的部位を模倣する3つの異なる10残基オリゴペプチド（Ser153を含む＃1,148-157; Ser335を含む＃2,330-339;およびSer558を含む＃3,553〜562）を合成し、 inインビトロキナーゼアッセイ。 AMPKによるNrf2のリン酸化は、オリゴペプチド＃3の存在下で大きく減少した（ 図1 ）。次に、部位特異的突然変異誘発アッセイを実施して、ペプチド模倣実験の結果を確認した。 Nrf2のAMPK介在性リン酸化に対するオリゴペプチド＃3の阻害効果を考慮して（ 図1 ）、我々はS558A-Nrf2変異体を生成した。リン酸化レベルを、野生型Nrf2とSインビ...

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

この手順の総合的な目的は、複数の潜在的なリン酸化部位を同時に評価し、その後のリン酸化部位変異体による検証対象となる部位を特定することです。この手法は、細胞シグナル伝達における翻訳後修飾の役割に関する、生化学および細胞生物学分野の重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術を用いることで、目的のタンパク質およびリン酸化部位の、予算を抑えた簡易的な予備スクリーニングが可能になります。リン酸化はヒトの疾患におけるシグナル伝達経路において重要な生化学的イベントであるため、この手法の意義は、炎症や癌を含む疾患の診断および治療へと広がっています。デモンストレーションを補助するのは、私の研究室の大学院生であるSol-Bi Shinで、部位特異的変異導入を行います。まず、50 nanogramsのプラスミドpGEX JST NRF2、125 nanogramsのフォワードプライマー、125 nanogramsのリバースプライマー、1 µLのdNTPミックス、2.5 unitsのPFU DNA polymerase、および10x反応バッファーを氷上で混合します。滅菌蒸留水を加え、全量を50 µLにします。PCRを行い変異鎖を組み込んだ後、サンプルを氷上で2分間冷却します。冷却したサンプルにDPNI制限酵素を1 µL加えます。ピペッティングでサンプルを穏やかに混合し、13,000 ×g で1分間遠心分離します。親の二本鎖DNAを消化させるため、サンプルを37 °Cで2時間インキュベートします。次に、endA1およびRACA1変異を持つ超コンピテントE.coli細胞を氷上で解凍します。冷却した細胞に反応混合液を50 µL加え、氷上で30分間インキュベートします。その間に、ヒーティングブロックを42 °Cに予熱しておきます。インキュベーションが完了したら、混合物を42 °Cで90秒間加熱し、その後、氷上で2分間冷却します。形質転換した細胞に、あらかじめ温めておいたLysogeny brothを加えます。混合物を37 °Cで1時間、180 RPMで振盪しながらインキュベートする。その後、細胞をLBアンピシリン寒天培地プレートに播種し、37 °Cで一晩インキュベートする。単一のコロニーを5 mLのアンピシリン含有Lysogeny brothに転移させる。サンプルを37 °Cで180 RPMで振盪しながら一晩インキュベートします。DNA配列解析用の標準的なミニプレップキットを用いて、サンプルのDNAを抽出します。200 ng以上のHDNA構築物をDNAアナライザーで分析し、変異配列を確認します。検証済みの変異型NRF2タンパク質を発現させ、精製します。キナーゼアッセイに進む前に、産生された変異型NRF2の量を決定します。ペプチド競合アッセイを開始するために、アデノシン一リン酸濃度が500 µMの5Xキナーゼバッファー溶液を調製します。次に、凍結保存したAMPK野生型ヒトNRF2および、NRF2のAMPKリン酸化部位を模倣した3種類のオリゴペプチドのサンプルを融解します。各ペプチドについて、氷上で、0.43 mgのペプチドに0.15 µgのAMPK、0.4 µgのNRF2、および6 µLの5X Kinase Bufferを混合します。滅菌蒸留水を加え、最終容量を30 µLにします。次に、遮蔽エリアにおいて、ヒーティングブロックを30 °Cに設定します。各チューブに1 µCiの$\gamma^{32}$P ATPを加え、ピペッティングにより各溶液を十分に混合します。反応混合物を30 °Cで15〜30分間インキュベートします。インキュベーション中に、7.5%STS PAGEゲルを準備します。次に、各チューブに10X STSサンプルバッファーを3 µL加え、十分に混ぜてキナーゼ反応を停止させます。サンプルをゲルで、70 Vで20分間、その後140 Vで1時間泳動させます。ゲル電気泳動の完了後、ブロモフェノールブルー線より下の高放射性ゲルの部分を慎重に切り出します。ゲルをキャスターからガラスチューブへ静かに移します。50%メタノール、40%水、10%酢酸の溶液中で20分間、ゲルを固定します。次に、ゲルをフィルターペーパーの上にそっと置き、透明ラップで覆います。真空ゲル乾燥機を用いて、80 °Cで1時間、ゲルを乾燥させます。乾燥したゲルを、ホスホスクリーンまたはX線フィルムに、それぞれ約16時間、2日間にわたって露光させます。Phosphorimagerを使用して、スクリーンの高解像度TIFFまたはビットマップファイルを生成します。AMPK活性アッセイを開始するために、AMPK、および変異型と野生型のGST NRF2のサンプルを氷上で解凍します。0.4 µgの変異型GST NRF2を、0.15 µgのAMPKおよび6 µLの5X Kinase bufferと混合します。滅菌蒸留水を加え、液量を30 µLにします。同様の方法で、0.4 µgの野生型GST NRF2を含む別の反応混合液を調製します。各反応バイアルに1 µCiのγ³²P ATPを加えます。混合液をピペッティングで数回混ぜた後、短時間遠心分離します。遮光条件下、30 °Cで30分間インキュベートし、10X STSサンプルバッファー 3 µLを加えてキナーゼ反応を停止させます。競合キナーゼアッセイと同じ条件でSTS-PAGEを行い、ゲルの固定および乾燥を行います。ゲルをホスホリスイーカーに一晩露光させ、Phosphorimagerでスキャンします。ヒトNRF2のAMPKリン酸化部位を模倣した3種類の10残基オリゴペプチド存在下で、in vitro AMPKアッセイを実施しました。Serine 558部位を模倣したオリゴペプチドが、AMPKリン酸化に対して最も強い競合を示しました。その後、558番目のセリンをアラニンに置換したNRF2変異体を合成し、in vitro活性アッセイで評価しました。S558A変異体ではAMPKによるリン酸化がほとんど観察されなかったことから、AMPKがヒトNRF2の558番目のセリンを直接リン酸化することが示されました。ペプチドはタンパク質に競合的に結合するため、この手法の原理は、リシン残基のアセチル化などの他の翻訳後修飾や、タンパク質間相互作用の同定にも適用できる可能性があります。放射性同位元素を取り扱う際は非常に危険を伴うことを忘れないでください。本手順を実施する前に、放射性同位元素の安全トレーニングを必ず受講しておく必要があります。

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生物化学

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リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

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