Name: 分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ分離心室心筋細胞における筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内カルシウム除去機能の評価法。Langendorff灌流系とカルシウムイメージングを用いて、糖尿病や心不全などの病態条件下でのカルシウム動態を解析する。

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この作品は中国の国家自然科学基金からの助成金によって支えられた (号 81100159、修習ライ; 81401147、区張)、医療と健康科学プログラムの浙江省 (号 201646246、修習 Lai)、健康科学、杭州市 (第 2013A28 号、丁林) の技術計画。

機関動物のケアと使用実験研究センター、中国医学科学の中国アカデミー、浙江大学委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物実験を行なった。
 1 ソリューション準備 <ol><li>表 1 で説明したようにすべてのソリューションを準備します。</li></ol>。
 2 分離の左心室 (LV) 心筋 注: 左心室心筋細胞は酵素によって前述 7 Langendroff 灌流システムを使用して分離、、。 8 , 9 , , 10 11.
<ol><li>Langendroff 灌流システムのセットアップ。通常 Tyrode (NT) ソリューションで灌流システムを埋める、36.5 ° C の温度設定、チューブに空気の泡を排除します</li>。
	<li>は、重さし、抱水クロラール (400 mg/kg) の腹腔内注入 (ip) による Sprague-dawley ラットの麻酔。5 分後尻尾や足指のピンチの応答を評価することで麻酔状態を確認</li>
	<li>手術用ハサミで剣状突起下腹腔内を開く、剣状突起を持ち上げ、シザーと胸を開きます。心膜を削除、わずかに持ち上げ心カーブタイプ鉗子で、大動脈弓を識別、心臓から大動脈のルートから鋏による切断します</li>。
	<li>は、60 mm ディッシュに心を転送し、NT ソリューションで洗っています。大動脈を持つ 2 つの微細解剖鉗子と蛍光灌流カニューレにマウントし、しっかりと縛る手術用縫合糸を使用してカニューレに大動脈 。
	注: 熟練したオペレーターが 15 内でこのプロセスを終えることができる s.</li>
	<li>は、冠状動脈の循環を回復する 30 mL NT ソリューションと心臓を灌流します。その後、液を 30 mL Ca 2 + に切り替える-無料の枝 (10 mM タウリン、1 mg/mL BSA) ハートビートを停止します。次に、コラゲナーゼ、分離ソリューション (0.6 mg/mL) 酵素の消化力のために、出納を切り替えます 。
	注: 使用コラゲナーゼは糖尿病ラットやコラゲナーゼ II での実験のための実験の糖尿病ラットなし</li>。
	<li>20-25 分の消化力の後すぐに Ca 2 + を灌流液を変更-無料の消化をさらに停止する枝。中心部を鉗子で保持、カニューレから切って、KB ソリューションを含む 35 mm ディッシュの中心の場所 (テーブル 1 を参照).</li>
	<li>解剖はさみ鉗子と左心室壁です。心房、右心室、房室接合部を切った。残りの組織は LV です。KB ソリューションと新しい 35 mm ディッシュにそれを転送します。LV の組織を細かくミンチします</li>。
	<li>ゆっくりピペットのフィルター処理されたプラスチック スポイト入りと 10 mL KB ソリューションで再停止します</li>。
	<li>は、150 μ m 絞りステンレス フィルター、および 15 mL 遠心管への転送の細胞をフィルター処理します。30 s と破棄上清の 150 x g で遠心分離機します。再 10 mL KB ソリューション、無料で細胞が 6 分のために解決を中断、上澄みを廃棄し、再 10 mL KB ソリューション内のペレットを中断します 。
	注: すべての手順を 100% O 2 毒ガス ソリューションで 36 ° C で行った</li>。
</ol> 3。カルシウム再導入 <ol><li>KB ソリューションで 20 分間定住した後、上澄みを廃棄し、カルシウムの再導入溶液を細胞を再停止 (0.3 mM Ca 2 +、4.5 mL Ca 2 +-無料枝、1.5 mL NT ソリューション)10 分</li>
	<li>カルシウム再導入液と B で上記の手順を繰り返します (0.3 mM Ca 2 +、3 mL Ca 2 +-無料枝、3 mL NT ソリューション).</li>
	<li>は、NT ソリューション (1.2 mM Ca 2 +) で利用可能な細胞を浄化するために上記の手順を繰り返します。このソリューションで孤立した左心室心筋細胞を保存し、研究それらを 4-6,</li>
</ol> 4。設定上の灌流システム <ol><li>NT ソリューション室灌流 ( 図 1 a) の流入管を接続します</li>。
	<li>ターゲット細胞針灌流、多バレルのマニホールド ヒント (例えば、灌流鉛筆、今後鉛筆と呼ばれます) に接続、マニピュレーターで修正、バルブに灌流システムを制御します。NT ソリューションと 10 mM カフェイン ソリューションを鉛筆 ( 図 1 a) の各列に追加します</li>。
	<li>をはずして空気管に空気の泡を避難</li>。
	<li>10 鉛筆数ミクロンの先端から点滴をカウント s、3 ドリップ/10 s のおおよその速度で流れの速度を保つために流量制御を手動で調整</li>
</ol> 5。細胞内 Ca 2 + 過渡的筋節の短縮 7 , 8 , 9 測定 <ol><li>スライドで、ピペット 10 μ L 細胞懸濁液顕微鏡で細胞カウンターで細胞数をカウントし、密度を計算します。おおよそ 50,000 セル/ml 濃度に細胞を希釈します</li>。
	<li>2 μ M に最終濃度をもたらす細胞の懸濁液 1 mL に追加 Fura 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) 株式 (カルシウム敏感な染料) を室温で 20 分間暗闇の中で保持します</li>。
	<li>150 g で 30 s、および再中断 2 時間を NT ソリューションと心筋細胞間遠心します</li>。
	<li>ターン、光と暗闇の中で細胞を維持します。15 分用灌流チェンバに筋紡錘を配置します。その後 NT ソリューション室灌流 (1.5 mL/分) を開始します。5 分刺激 (波期間 4.0 ms パルス振幅 8.0 V) を使用して 1 Hz 刺激と筋紡錘のペース</li>
	<li>形のよい細胞を選択 (棒状、鋭いエッジ、およびクロス縞をオフに)、顕微鏡の対物レンズ × 10 の下で安定した刺激収縮 (自発収縮なし)。次に、顕微鏡の倍率を 40 倍に変更し、水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転します</li>。
	<li>フレーム単一心筋細胞フレーミング アダプターを調整することによって。バック グラウンドが明確であることを確認します</li>。
	<li>340 または 380 nm 波長励起フィルターとキセノン ランプが発する光を細胞を公開し、40 × 対物を介して細胞をイメージします。510 で蛍光シグナルを検出 nm。一方で、心筋の筋節長変化に注意してくださいし、同時に柔らかい端モジュールを使用して記録します</li>。
	光電子増倍管の二重励起蛍光測定システムによる <li>レコード蛍光。カルシウム イメージング システムの録音プログラムを実行をクリックして &#34; ファイル/新しいファイル &#34; 新しい記録ファイルを作成し、クリックする、&#34; 開始 &#34; 蛍光および筋節の長さを同期的に記録します</li>。
</ol> 6。SR Ca 2 + リザーブと拡張期の Ca 2 + 除去機能 7 , 8 , 9 評価 <ol><li>Interlink、&#34; Aux アウト &#34; ポート刺激、&#34; アナログの &#34; バルブ制御システムのポート (例えば バルブの司令官、材料表 を参照) (TTL 信号を同期) に BNC ケーブルで</li>。
	<li>プリセット前述 8 , 9; として自動的に灌流バルブの切り替えのためのプログラム操作の詳細な手順については、次として表示されます。
	<ol><li>プリセット 表 2 に従って、ソフトウェアを制御し、バルブ内のパラメーター、&#34; ダウンロード &#34; プログラムにロード シーケンスをダウンロード] ボタンをクリックします。クリックして、&#34; ・ トリッグ小胞体 &#34; トリガー関数を有効にする] ボタンをクリックします 。
		注: バルブ制御システム TTL 信号を受信した後のシーケンスを実行することができます</li>。
		<li>シーケンス モードに刺激をプリセットし、表 3 に従ってパラメーターを設定します</li>。
	</ol></li> <li>で刺激を設定 &#34; S1 ステップ &#34; LV のペースを細胞 1 Hz では NT ソリューションを 1.5 mL/min の速度で針灌流を開始。 。
	注意: 針ストリームの速度は灌流チャンバーよりも速く、針のストリームの光の屈折が灌流チャンバーの光の屈折とは異なる。光の屈折の違いは、ターゲット細胞をとりまく効果的な針灌流の範囲を示します</li>。
	<li>選択 (上流に下流のシーケンス) の低消費電力ミクロな視点の下でターゲット細胞と確認されるによって到達できる鉛筆のマイクロ チップ。顕微鏡の倍率を 400 倍に変更します。水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転させます。筋紡錘を格納する適切なウィンドウにセル フレーミング アダプターの下の長方形の開口部を調整します。最小限の背景があることを確認します。他の細胞またはこのウィンドウで死んだ細胞の残骸を認めていない</li>。
	<li>鉛筆、マイクロマニピュレーターの固定の位置を調整し、顕微鏡倍率 x 400 未満ターゲット細胞に視界の半径の距離でマイクロ チップを慎重に配置します</li>。
	<li>主ターゲット細胞をカバーし、心筋が針流れによって一掃できないことを確認してください針ストリームの範囲を調整します</li>。
	<li>後 60 s の基本的なペーシング、カーソルを刺激する、&#34; D2 ステップ &#34;. 
	注: プロトコルの残りの部分は、刺激とバルブ コントロール システムによって自動的に実行されます。上記の設定に基づき、プロトコルが自動的に実行される 図 2 a、1 Hz 基本 60 NT ソリューションとペーシングのように s。ペーシングと 2 の遅延、一時停止 s、15 の 10 mM カフェイン灌流に急速に切り替える (機能的、SR 内の Ca 2 + ストレージをリリース) を s、NT ソリューションに切り替えてと</li>。
	<li>記録の最後に、個々 の細胞のバック グラウンド蛍光を検出します。クリックして、&#34; 一時停止 &#34; ミクロな視点を近く空白エリアに移動記録、ファイルを一時停止するボタンです。クリックして、&#34; レコード &#34; 秒の記録を再開するボタンをクリックし、バック グラウンド補正の数値 340 と 380 nm の強度値を記録します</li>。
	<li>オープン、&#34; 操作/定数 &#34; ダイアログ ボックスでに値を入力し、&#34; 背景 &#34;、それぞれを形成; ソフトウェアは、バック グラウンドを引いて Fura 2 比率値を修正できます</li>。
</ol> 7。データ分析 9 <ol><li>カルシウム トランジェントおよび基本的なペーシングの段階で短縮筋の測定、収縮パルスの平均値、カルシウム濃度、時定数などの動的パラメーターを分析します。カルシウム一時的な崩壊 (タウ 1 Hz)、自動的にソフトウェアを使用しています 。
	注: ソフトウェアの decay セグメントがうまく適合しない場合は、手動のモノラル指数曲線のあてはめの減少トレースをエクスポートします</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス カルシウム除去機能の解析のための急な波とパルスのみを選択します。信号障害、異常パルスまたはそれらの距離の中間を流れていたセルを除外します</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス (Ca-カフェイン、方式 2 + 予備のインデックス) の振幅を測定します</li>。
	<li>モノラル指数曲線あてはめ (10 時間) 手動でソフトウェア ( 図 2) からカフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の減衰時定数を取得します</li>。
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

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SR からリリースされたカルシウム変化は心臓の収縮の Ca2 +の主要な源です。程度、SR Ca2 +コンテンツの振幅および小数部の Ca2 + SR からリリース心筋収縮のため利用できる SR Ca2 +予備を反映します。その一方で、SR の Ca2 +予備は拡張期12,13,14の間に SR で SR Ca2 +再取り込み、Ca2 + SR のリークとそのバランスの能力に依存します。私たちの実験では 10 mM カフェインの急速なアプリケーションは総 Ca2 +リリースおよび RyR チャネルを開いて、SR 内の Ca2 +再取り込みを防ぐを誘導するために目指しています。このように、カフェイン誘発性 Ca2 +パルスの振幅は、SR ...

細胞内カルシウム ([Ca2 +]私) リサイクル1心筋細胞の収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ご存知のように、カルシウム誘発性 Ca2 +放出は収縮する電気信号に変換するカップリング、興奮収縮を開始します。膜の脱分極は、細胞膜の L 型 Ca2 +チャネル、Ca2 +を引き起こすはリアノジン受容体 2 (RyR2) を介した細胞質に SR からの解放をアクティブにします。一時的な上昇細胞質 Ca2 +筋原線維の収縮を開始します。期には, 細胞質 Ca2 +は SR Ca2 +による SR に reuptaken-atp アーゼ 2 (SERCA2) と、Na+-Ca2 +交換 (NCX)2を介して心筋のポンプ。このプロセスはリサイクル、心筋収縮緩和に します。
心臓の SR は収縮機械を囲む細胞内膜ネットワークです。それは収縮の Ca2 +貯水池として機能、それがリラクゼーションの中に細胞内 Ca2 + reabsorbs。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心収縮力の確定です。一方、心臓の拡張期の細胞内 Ca2 +の除去が欠かせません。いくつかの病態生理学的条件下で糖尿病、心不全、障害 Ca2 +クリアランス、落ち込んで SR Ca2 +など心筋に店が関与している心機能低下2,3 ,4。
SR Ca2 +放出と拡張期心筋細胞 Ca2 +除去を測定するために、広く使用されている方法の 2 種類があります: パッチ ・ クランプ5,6、およびカフェイン誘発性 Ca に基づいて NCX 電流の整合性2 + Ca2 +蛍光イメージング7,8,9に基づくパルス。前者のアプローチは、Ca2 + SR から解放主ポンプでくまれるセルから NCX によって事実に依存します。ただし、このアプローチは、高度な設備・熟練作業の条件によって制限されます。本研究では Ca2 +パルスのカフェイン誘発性の Ca2 +蛍光イメージング システムに基づく測定による SR Ca2 +リザーブと心筋細胞の Ca2 +除去を評価するための便利な方法をについて説明します。簡単に言えば、細胞内 Ca2 +蛍光はフラ 2 で示されます。連動した刺激システムと灌流システム、によって灌流の切り替えとシステムを自動的にペーシングのためのプログラムを提案します。10 mM カフェインを用いて急速に SR で総 Ca2 +放出を誘発します。カルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス指数関数的減衰時定数 (タウ) は、それに応じて拡張期の Ca2 +除去 SERCA と NCX の貢献を反映するモノ指数曲線の当てはめから得られました。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>アルファ Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>アルファ アエサル</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>アルファ アエサル</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>アルファ アエサル</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>アルファ アエサル</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>アルファ アエサル</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>ワージントン</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA ロシュ</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>カフェイン</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX 71</td><td></td></tr><tr><td>ランゲンドルフシステム</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>マーシャウ</td><td>ザーMM33リンク</td><td></td></tr><tr><td>灌流チャンバー</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>バルブ 制御重力灌流システム</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>バルブコマンダーソフトウェア</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>精密流量調整器</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>マルチバレルマニホールド 灌流ペンシル</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>ミクロンの取り外し可能な先端</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>蛍光測定および細胞寸法測定システム</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>記録ソフトウェア</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>刺激装置</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-dawley ラット</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。心筋の筋小胞体 (SR) は、reuptakes 細胞内 Ca2 +安静時の収縮の Ca2 +貯水池として機能します。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心筋収縮性の予測、細胞内 Ca2 +の除去は、心臓の拡張機能のために重大。糖尿病、心不全など、いくつかの病態生理学的条件下で障害カルシウム クリアランスと心筋細胞の Ca2 +ストアは、心機能低下の進行状況に関与する可能性があります。ここでは、方式2 +リザーブと拡張期の Ca2 +除去を評価するプロトコルについて述べる。簡単に言えば、単一心筋細胞が酵素によって分離され、フラ 2 で示された細胞内の Ca2 +蛍光カルシウム イメージング システムによって記録されました。合計 SR Ca2 +放出を誘発するためにカフェインを採用するには、連動した刺激システムと灌流システムによって自動灌流スイッチ プログラムをプリセットします。その後、モノラル指数曲線のあてはめカルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス減衰時定数を分析に用いる。したがって、SR の Ca2 +の貢献-ATPase (SERCA) と Na+-Ca2 +交換 (NCX) 拡張期のカルシウムの除去を行った。

ストレプトゾトシン (STZ) - 誘発糖尿病ラット (DM) と年齢をマッチさせたスプレイグ - を示すここで、ドーリー (SD) ラットの例。8 週齢雄 SD ラット (200 ± 20 g) は、管理グループのための DM グループまたはクエン酸バッファーの STZ (70 mg/kg, ip) の単一腹腔内注射を受けた。STZ 投与後 1 週間ラット血糖値と &#62; 16.7 ミリ モル/L が糖尿病と考えられていた。8 週間後左心室心筋細胞は酵素によって分離されました。カルシウム再導入後の生存状態のまま細胞の約 70-80% があります。ロッド形、明確な縞および安定した収縮の唯一の細胞は (図 1 b) を記録するために選ばれました。図 1 aのように、我々 は商工会議所の血流と細胞の針灌流を設定します。プリセット ・ プログラムされた自動的に灌流バルブとペーシング システムを切り替える図 2 a<...

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2 +リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

この手順の全体的な目的は、単離心筋細胞における筋小胞体カルシウム貯蔵量および細胞内拡張期カルシウム除去機能を評価することです。この手法は、糖尿病や心不全などの病態生理学的条件下における細胞内カルシウムハンドリングメカニズムに関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡便であり、技術や設備による制限が少ないことです。この手順を開始するために、Langendorff灌流システムをセットアップします。灌流システムにNT溶液を満たし、温度を36.5°Cに設定し、チューブ内の気泡をすべて除去します。次に、剣状突起の下から腹腔を開き、剣状突起を持ち上げて、鋏で胸腔を開きます。次に心膜を除去し、曲線鉗子で心臓を軽く持ち上げて大動脈弓を確認し、大動脈根部で心臓を切り離します。その後、心臓を60 mmのディッシュに移し、NT溶液で洗浄します。2本のマイクロ解剖用鉗子で大動脈を固定し、ランゲンドルフ灌流カニューレに装着します。次に、外科用縫合糸を用いて、大動脈をカニューレにしっかりと結紮します。続いて、冠動脈の循環を回復させるため、30 millilitersのNT溶液で心臓を灌流します。その後、灌流液を30 millilitersのカルシウムフリーTyrode溶液に切り替え、心拍を停止させます。その後、灌流液をコラゲナーゼA分離溶液に切り替えて酵素消化を行います。20～25分間消化した後、速やかに灌流液をカルシウムフリーTyrode溶液に変更し、それ以上の消化を停止させます。次に、ピンセットで心臓を保持してカニューレから切り離し、KB溶液を入れた35 mmディッシュに心臓を移します。次に、左心室領域を特定します。心房、右心室、および房室接合部領域を切り出します。その後、左心室をKB溶液を入れた新しい35 mmディッシュに移し、組織を細かく刻みます。フィルター付きプラスチックピペットを用いて、組織片を丁寧に回収します。次に、孔径150 µmのステンレス製フィルターで細胞をろ過し、15 mL遠心チューブに移します。その後、サンプルを150 ×gで30秒間遠心分離し、上清を捨てます。筋細胞を10 mLのKB溶液で再懸濁し、6分間静置します。その後、上清を除去し、ペレットを10 mLのKB溶液で20分間再懸濁します。KB溶液中で20分間静置した後、上清を除去し、筋細胞をカルシウム再導入溶液Aで再懸濁します。同様の手順をカルシウム導入溶液Bを用いて繰り返します。その後、利用可能な筋細胞を精製するために、NT溶液を用いて上記の手順を繰り返します。単離した LV 心筋細胞をこの溶液に保存し、4〜6時間以内に解析を行います。次に、ペンの各カラムに NT 溶液と 10 millimolar カフェイン溶液を加えます。気泡による閉塞を防ぐため、チューブ内の気泡を完全に除去してください。次に、チャンバー灌流用に流入チューブをNT溶液に接続します。標的心筋細胞のニードル灌流を行うには、マルチバレルマニホールドチップをバルブ制御灌流システムに接続してください。その後、ペンシル状のマイクロチップから10秒間に滴下する滴数を数え、流速がおよそ10秒間に3滴になるよう、流量調整器を手動で調整します。この手順では、心筋細胞懸濁液1 mLにfura-2-acetoxymethylストックを加え、最終濃度を2 µMにします。室温で20分間、暗所で保持します。その後、上清を捨て、NT溶液で心筋細胞を2回再懸濁します。次に、照明を消して細胞を暗所に保持します。心筋細胞を灌流チャンバーに配置し、NT溶液で灌流する前に15分間静置します。刺激装置を用いて、1 Hzの電場刺激で心筋細胞を5分間ペース刺激します。次に、10倍の顕微鏡対物レンズを用いて、形状が良好で刺激による収縮が安定している心筋細胞を選択します。「File」から「New File」をクリックし、新しい記録ファイルを作成します。続いて、顕微鏡の倍率を40倍に変更し、心筋細胞が水平な位置に保持されるようにCCDカメラの向きを回転させます。次に、細胞フレーミングアダプターを調整して単一の心筋細胞を枠内に収め、背景がクリアであることを確認します。続いて、340または380ナノメートルの波長の励起フィルターを備えたキセノンランプから放出される光を心筋細胞に照射し、40倍の対物レンズを通して心筋細胞を撮影します。510ナノメートルで蛍光信号を検出します。Startボタンをクリックし、二重励起蛍光光電子増倍管システムを用いて、蛍光とサルコメア長を同期して記録します。心筋細胞のサルコメア長の変化に注意し、同時にソフトエッジモジュールを用いて記録してください。この手順では、BNCケーブルを使用して、刺激装置のaux outポートとバルブ制御システムのアナログ入力端子を相互接続します。次に、バルブ制御ソフトウェアでパラメータをプリセットし、ダウンロードボタンをクリックしてプログラムにロードされたシーケンスをダウンロードし、トリガーボタンをクリックしてトリガー機能を有効にします。続いて、スティミュレーターをシーケンスモードにプリセットし、パラメータを設定します。その後、スティミュレーターをS1ステップに設定し、LV心筋細胞を1 Hzでペースします。NT溶液を用いて、1.5 milliliters per minuteの速度でニードル灌流を開始します。低倍率の顕微鏡視野で標的となる心筋細胞を選択し、ペンシルのマイクロチップが到達できることを確認します。その後、顕微鏡の倍率を400Xに変更します。CCDカメラの向きを回転させ、心筋細胞を水平方向に保持します。次に、セルフレーミングアダプターの下にある矩形開口部を調整し、心筋細胞が収まる適切なウィンドウに設定します。続いて、マイクロマニピュレーターに固定されたペンシル状の操作部の位置を調整し、マイクロチップを標的の心筋細胞から視野半径分だけ離れた位置に慎重に配置します。次に、ニードルストリームの範囲を調整して標的の心筋細胞の大部分をカバーし、心筋細胞がニードルの流れで押し流されないようにしてください。60秒間の基本ペーシング後、スティミュレーターのカーソルをD2ステップまで移動させます。残りのプロトコールは、スティミュレーターとバルブコントローラーによって自動的に実行されます。Pauseボタンをクリックしてファイルの録画を一時停止し、顕微鏡視野を付近の空白領域へ移動させます。次に、Recordボタンをクリックして数秒間録画を再開し、背景補正用の340 nmおよび380 nmの数値強度値を記録します。その後、Operation Constantダイアログボックスを開き、背景フォームに値を入力します。このソフトウェアは、バックグラウンドを差し引くことでfura-2の比率値を補正できます。ここでは、灌流バルブとペーシングシステムを自動的に切り替えるプロトコルの図解を示します。この図は、糖尿病群およびSprague Dawley群における、1 Hzで刺激した単収縮時の筋小胞体カルシウム貯蔵量および分画カルシウム放出量の統計値を示しています。糖尿病群は、Sprague Dawley群と比較して、SRカルシウムリザーブおよびSR分画カルシウム放出が有意に減少していました。ここでは、ソフトウェアパネルにより、カフェイン誘発カルシウムパルスの崩壊時定数に対する手動の単指数関数曲線フィッティングを示しています。これらの棒グラフは、糖尿病群とSprague Dawley群におけるTau-caffeineおよびTau-1Hz/Tau-caffeineを比較したものです。糖尿病群では、Sprague Dawley群と比較して、Tau-caffeineおよびTau-1Hz/Tau-caffeineの値が有意に増加していた。本手法は、心機能不全における細胞内カルシウムハンドリング機構を探索するための、実行可能かつ便利なツールとなる。本手法を実施する際は、心筋細胞のディッシュへの安定した接着、チャンネルスイッチの操作、針灌流の流速制御、および針先から標的心筋細胞までの適切な距離など、いくつかの重要な注意点がある。

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げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

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単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca2+ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

学ぶ分離心室心筋細胞における筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内カルシウム除去機能の評価法。Langendorff灌流系とカルシウムイメージングを用いて、糖尿病や心不全などの病態条件下でのカルシウム動態を解析する。

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

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