Name: 抵抗血管の細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学ぶ抵抗血管の細胞培養モデル。内皮細胞と平滑筋細胞を共培養し、筋内皮接合部を再現する手法です。タンパク質局在やシグナル伝達カスケードの解析に応用でき、心血管研究の新たなツールとなります。

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この作品は、各国用の中心によって支えられた、肺、血液研究所 R01088554、T32HL007284、アメリカの心臓協会の交わりを経て 14PRE20420024 を付与します。我々 は特に、聖ジュード細胞イメージング共有研究コア、ランドール ウェイク フィールドと電子顕微鏡画像のリンダ ・ ホーナー、アダム ストラウブについては代表的な蛍光画像彼女の地下鉄 Bagher などを感謝します。原稿プロトコルに関する貴重なフィードバック。

1.、VCCC のめっきセル <ol><li>文化大 225 cm 2 のフラスコ EC と SMC 70-90% 合流までの 37 ° C で滅菌条件の下で。SMC よりより多くの EC が使用されていることを確認します。プライマリ人間 EC と SMC、SMC の 1 大規模なフラスコに EC の通常 3 の大きなフラスコを使用して場合。
	<ol><li>下通路で一次電池を使用して、過去の 10 の通路を使用しないでください。共培養する細胞に基づく文化メディアを選択します。主なひと冠動脈 EC、EGM2 MV 成長因子と EBM 2 EC 基底メディアを使用します。プライマリのひと冠動脈 SMC SmGM 2 成長因子と SmBM SMC 基底メディアを使用します。培養細胞で使用する前に、メディアに成長因子を追加します</li>。
	</ol></li> <li>VCCC 日 1 の構築: 消毒剤 (例えば Cavicide) と大 (150 mm) ペトリ皿と蓋をスプレーし、ペーパー タオルや糸くずのおしりふきで拭いて。70% エタノール (エタノール) ペトリ皿をスプレーし、乾燥空気にフードにそれらを置く</li>。
	<li>は無菌条件下でフィルター挿入 (材料の表 を参照してください) のプレートを開き、フィブロネクチン溶液で挿入の SMC 側 (フィルターの底側) をコートします。提供 6 ウェル プレートの挿入を維持する、ピペット、フィブロネクチン溶液側フィルターの半分は下カバー (1 mL 以上) であることを確かめて、プレートの底にスリットします</li>。
	<li>細胞文化フードでは、室温でフィブロネクチン溶液の後 30 分は、過剰なソリューションや反転、きれいなペトリ皿の半分を下部に配置する真空プレートから挿入を取る。脇を設定します。余分な溶液を吸引するときにフィルター挿入膜を邪魔しないようにこれはプレートの傾斜および挿入の端からソリューションを掃除機をゆっくりによって回避できます</li>。
	SMC のセルが、プレートを持ち上げた後のあらかじめ加温の 2 X トリプシン-EDTA 溶液 3 ml Trypsinize 225 cm 2 フラスコを <li>は、トリプシン (3:1、メディア: トリプシン) を中和するために 9 mL SMC メディアを追加します。円錐管に転送、まあと携帯番号を確認する検定にピペット 10 μ L をミックスします。
	<ol><li>5 × 5 のセルの個数のカウント ボックス (すなわち 18)、掛けて 10,000 1 mL (180,000) 内のセルの数を取得します。12 mL (216 万 SMC 細胞懸濁液の容量) を乗算します。十分な SMC プレートに井戸の数があることを確認します 。
		注: たとえば、1 よくべきである 75,000 SMC を有し従って 18 井戸だろう 135 万合計 SMC。1 mL あたり 180,000 細胞によって必要な 135 万セルを分割してめっきに必要となる細胞の懸濁液の 7.5 mL でこの結果します。必要な最終巻を計算 (18 井戸 x 750 μ L = 13.5 mL)。したがって、細胞懸濁液の 7.5 mL を取る、ボリュームをもたらすに予め温めておいた SMC メディアとよく混ぜるまで 13.5 mL</li>。
	</ol></li> <li>セル ・ メディア ソリューションのいずれかをこぼさないように注意しながら各フィルターの下側に約 75,000 SMC を含む細胞懸濁液のプレート 750 μ L。上ふたを閉めて一晩 37 ° C の定温器に挿入でシャーレを慎重に転送します 。
	注: 他の細胞型の最適なセル密度が経験的に決定される必要があります</li>。
	<li>2 日目、2 ml の新鮮な予め温めておいた SMC メディアのきれいな 6 よく料理を埋めます。インキュベーターからプレートを削除します。1 つずつ挿入を取ると吸引、メディアを削除し、SMC メディア 6 よく皿に配置します</li>。
	<li>37 で少なくとも 30 分間 0.5% 牛ゼラチン溶液の 1 ml フィルター (EC 側) の反対側のコート ° C</li>
	<li>Trypsinize 3 ml に予め温めておいた 2 の EC の 225 cm 2 flask(s) X トリプシン-EDTA (10 倍希釈滅菌ダルベッコの &#39; s PBS) ソリューション、プレートから細胞を持ち上げるためにフラスコの穏やかなタップで 。
	注: 場合によっては、フラスコを 37 ° C で 1 〜 3 分のためのインキュベーターに配置する必要があります。
	トリプシン (3:1) を中和するために 9 mL EC メディアを追加 <ol><li>一度細胞が、プレートを持ち上げた。円錐管、プールに一緒に転送、まあと携帯番号を確認する検定にピペット 10 μ L をミックスします。
		<ol><li>5 × 5 のセルの個数のカウント ボックス (すなわち 60)、掛けて 10,000 1 mL (600,000) 内のセルの数を取得します。12 mL (720 万 EC 細胞懸濁液の容量) を乗算します。十分な EC プレートに井戸の希望の番号があることを確認します 。
			注: 約 360,000 EC は、ウェルあたり必要があります。たとえば、18 の井戸は 648 万理事会を必要と1 mL あたり 600,000 EC に必要な 648 万セルを分割し、10.8 mL めっきに必要となる細胞の懸濁液のこの結果します。必要な最終巻を計算 (18 の井戸 1 mL = 18 mL x)。したがって、細胞懸濁液の 10.8 mL を取る、最大ボリュームをもたらす 18 mL EC メディアで加温し、優しく再懸濁します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>1 mL 各挿入フィルターの上側に 360,000 EC のプレートします。4 日目に 24 時間交換媒体のための 37 ° C で邪魔されずインキュベート細胞ができます。5 日目で収穫</li>。
</ol> 2。収穫、VCCC から分数 <ol><li>4 ° C の部屋の分離を行い氷のすべての楽器を維持</li>
	<li>は隔離される個々 の挿入数を留意し、MEJ (分離フィルター) のラベル 50 mL チューブに換散バッファーを追加します。その後、ラベル 2 つの 10 mm の料理;EC と smc</li>。
	<li>調整方法集中ライセートする必要があります; 15 挿入によっては換散バッファーのボリューム、MEJ 管の換散バッファーを 500 μ l 添加し、シャーレあたり 250 μ L をお勧めします</li>。
	<li>作業時間での挿入 1 つ 6 ウェル プレートで。細胞文化フードとし、氷の冷たい部屋への輸送中に吸引 
	メモ: 次の手順は、1 挿入分離します</li>。
	<li>ピペット 10 μ L の挿入の SMC 側に 1 × PBS</li>。
	<li>こすりに挿入の一方の端のセルをセル リフターを使用し、換散バッファーの品詞がある SMC ペトリ皿にリフターからセルを転送</li>
	<li>セル リフターは、皿の中の換散バッファーに触れた後はそれまで完全に一掃し、ペーパー タオルで乾燥した挿入フィルターに触れることを許可しません。スクレイピング SMC フィルターの少なくとも 1 ~ 2 回残りの SMC 細胞の残骸を完全に削除するを繰り返します</li>。
	<li>は、挿入フィルターの上部/EC 側に上の挿入および 1x PBS のピペット 10 μ L を回します。2.6 および 2.7 細胞スクレーパーと EC のペトリ皿の手順を繰り返します</li>。
	<li>は、換散バッファーと EC ペトリ皿に、ピペットと転送フィルターの EC 側から残りのセルと PBS スラリーを収集します。MEJ 分数で EC/SMC 混入を最小限にしてフィルターの両側から細胞をこするの非常に徹底的な</li>。
	<li>は、メスを使って慎重にプラスチック製の挿入からフィルターをカットします。プラスチックからそれの切断 70-80% がこれを行うし、鉗子を使用して、プラスチック製の挿入構造完全にフィルターを引き出します。換散バッファー付け MEJ 50 mL の円錐管にフィルターをかけるし、それは換散バッファーに常駐し、ウェットのままを確認します</li>。
	<li>の挿入をすべてが処理されるまで、6 のグループで、分離手順を繰り返します</li>。
	<li>の個別のチューブや料理別の治療グループを維持します</li>。
	<li>渦 15 の完全な強さの 50 mL MEJ 円錐管 s またはよく混合されるまで。鉗子、管にタンパク質と液体の最大量を残す、チューブの側の壁に沿ってドラッグすることで円錐 MEJ からフィルターを削除します。このポイントの後、フィルターを破棄します</li>。
	<li>MEJ 円錐管からすべてのフィルターを取り外した後は、チューブの底にすべての液体とタンパク質をプルする遠心分離機のクイック スピン (最大速度 〜 16,000 x g で 10-15 秒)。独立した小さい遠心チューブに MEJ チューブと EC と SMC ペトリネットの料理の内容を転送します</li>。
	<li>オプション: MEJ/SMC/EC チューブの内容を超音波氷上 4 3 10 s のパルスを設定または手で優しくホモジナイズしてください</li>。
	<li>4時 15 分最大速度 (~ 16,000 x g) 遠心 ° C. ピペット上清しビシンコニン アッセイ法を用いたタンパク質含有のライセート アッセイします</li>。
</ol> 3。アン顔 蛍光の収穫をして、VCCC <ol><li>日 5 の VCCC の孵化はインキュベーターからドライブベイ カバーを取り外します。各 1 × PBS で 2 回すすぎ挿入フィルターの下の井戸から SMC メディア オフ吸引細胞文化フードで作業している。EC 側と繰り返し</li>。
	<li>穏やかなシェーカーでウォークイン 4 ° C の部屋で 10 ~ 20 分 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加そのままに、プレートの挿入を維持します。5 分の 1 × PBS で挿入フィルターの両側を洗って、2 回繰り返します 。
	注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります</li>。
	<li>プレート、抗体でフィルターの両方の側面を保つ + ソリューションをブロックでブロック、第一次および二次抗体の孵化を実行 (9 mL PBS、25 μ L トリトン X100、50 mg ウシ血清アルブミン、血清 500 μ L)</li>
	<li>メスとプラスチック製の挿入からフィルターをカット、スライドにフィルターをマウントするマウント ハンドルとメディアをマウントを顕微鏡スライド上の場所</li>。
</ol> 4。横の蛍光の収穫をして、VCCC <ol><li>日 5 の VCCC の孵化はインキュベーターからドライブベイ カバーを取り外します。細胞文化フード挿入フィルターの両側からメディアを吸引し、1x PBS で 2 回フィルターの各側面をすすいでください</li>。
	<li>そのまま 6 ウェル プレートの挿入を維持追加 4 %pfa 穏やかなシェーカーのウォークイン 4 ° C の部屋で一晩インキュベートと 。
	注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります</li>。
</ol> 5。埋め込み、VCCC 横の蛍光 <ol><li>フィルター後の挿入は、およそ 4% で 24 h のため修正されている PFA、70% への転送 EtOH、少なくとも 24 時間は数週間まで</li>。
	<li>は、自動化されたティッシュ プロセッサ上で実行 (一晩) 長い上フィルターを処理します。プログラムを使用して、次のように: 70% EtOH 30 分、85% エタノール 30 分、95% エタノール 30 分、100% エタノール 30 分、100% エタノール 45 分、100% エタノール 45 分、キシレン 30 分、キシレン 30 分、キシレン 45 分、60 ° C のパラフィン 30 分、60 ° C パラフィン 30 分、60 ° C パラフィン 45 分</li>
	<li>処理後、収穫されたフィルターを埋め込み駅流動パラフィン、カセット フィルターを維持するのに転送します</li>。
	<li>は、慎重に鉗子を使用して端にちょうどそれを保持するために、カセットからフィルターを削除します。ハサミで半分にカット フィルター 2 つの半円形の半分の形を形成します。液体パラフィンが付いて金型埋め込みを埋めるのに十分な長いだけ埋め込み駅のコールド プレート部分に 2 の半分の各レイアウトします</li>。
	こうと、断面、中に 1 つ切断されるエッジに向かってフィルターの中心から <li>一度流動パラフィンで満ちている非常に簡単にコールド プレートに埋め込み型に触れる、フィルターの各半分埋め込む埋め込み型 (側をカット);.</li>
	<li>埋め込み、中にパラフィンが単独でする彼らのために十分に涼しいまでお互いに落ちるから半分を防ぐためにフィルターを保持するために鉗子を使用します。完全に固化するまでのコールド プレートに埋め込み型に移動します 。
	注: 製氷皿上のブロックを冷却しわセクションを防ぐことができます</li>。
</ol> 6。区分および横の蛍光染色、VCCC <ol><li>パラフィン ブロックの区分およびマウント スライド: 5 μ m のセクションをカット、42 ° C の水浴にセクションを配置および正荷電を使用してセクションを拾うスライド。乾燥する 42 ° C のオーブンで一晩のスライドを維持します</li>。
	<li>復元手順を開始する前にパラフィンを溶かすための 60 ° C でスライドを焼くし、スライドの VCCC セクションの付着を助けます。簡単に言えば、冷却し、キシレン、100% の 2 つの変更をスライドを水分補給 95% エタノール エタノール、70% の 1 つの変更 EtOH との 2 つの変更蒸留水します</li>。
	<li>マイクロ波またはスライドの外セクションが落ちることがあります暖房を含む抗原検索方法を避けてください</li>。
	<li>実行は 4 ° C で一次抗体と一晩インキュベートし、常温で 1 h の標準ブロック常温洗浄の手順と 1 h の二次抗体が続きます。メディアをマウントと coverslip マウントします</li>。
</ol>

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<li>Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+protein+on+actin+bridges+between+endothelium+and+smooth+muscle+in+arterioles+demonstrates+heterogeneous+connexin+expression+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).</li>
<li>Biwer, L. A., Isakson, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mediated+signalling+in+cellular+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains.</a> Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).</li>
</ol>

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VCCC は MEJsの in vitro、さたの面で利点の数が特定のアプリケーションのため、VCCC を利用できるかどうかを決定する際の議論のポイントがあります。たとえば、異なる種類の細胞をこのモデルで使用される場合は、最適化するそれ必要があります。ひと初代細胞を用いてウシ大動脈24、または野生型やノックアウト マウスから細胞を分離し、VCCC1,5,14でそれらを使用することが可能です。
MEJ の分離のため、VCCC を使用して、マスターに最も重要な技術は MEJ 分数の純度が過剰な内皮細胞や平滑筋細胞によって変更されていないことを確認するフィルターの徹底的な削りです。私たち西部にしみが付くことであることを示したアルファ ヘモグロビン「純粋な」MEJ 分離13、最高のマーカー内皮...

小径抵抗血管の薄い内弾性板 (IEL) は、内皮細胞 (EC) と平滑筋細胞 (SMC) を分離します。セルはこの弾性マトリックスの穴を介して投影し、ギャップ結合チャネル1,2経由でダイレクトに細胞質接続できます。このユニークな構造は、myoendothelial のジャンクション (MEJ) と呼ばれます。MEJ です小 (血管床によって、0.5 μ m x 約 0.5 μ m)、細胞突起主に内皮細胞から成る3,4同様の平滑筋から発生させてよい。調査官の数はシグナル伝達 MEJ、内皮細胞と平滑筋5 間双方向のシグナル化を促進するため特に重要な場所、それはレンダリングに選択的に発生するネットワークの巨大な複雑さを示しています。 ,6,7,8,9,10。
ただし、そのまま動脈、MEJ のシグナル伝達経路の機構的郭清はむずかしい。MEJ から細胞の投影こそ体内MEJ 血管壁から分離することは現在はないです。このため、VCCC モデル1が開発されました。重要なは、VCCC 複製生理的血管内皮形態11 ・頂間の信号の偏波とセル12MEJ 部分。アルファのヘモグロビンは、血管内皮細胞、MEJ に偏光の発見を容易にするこのユニークなモデルだった。これはアルファのヘモグロビン13を表現しない従来培養内皮細胞とは対照的です。微小血管内皮細胞に興味がある研究者は、特に小径抵抗血管で発生するシグナル伝達経路を分析することが目的の場合、VCCC で培養した血管内皮細胞を使用するより適切な場合があります。
2 つ共培養細胞型に小径孔 (直径 0.4 μ m) を持つフィルターを含む頑丈なプラスチック製の挿入を使用すると、セルで層間の移行できなくなります。それはin vivoよりはるかに時間がまだ MEJs、蛋白質のローカリゼーション、シグナルの1二次メッセンジャーなどの生体内の特性の多くを複製セル間の 10 μ m 間隔の結果します。,14します。 さらに、、VCCC セル アゴニストまたは特定の細胞内コンパートメントに拮抗薬の追加を介して信号の種類に固有のターゲットにできます。たとえば、カルシウムをキレート化するためこれら AM で EC を読み込みとフェニレフリン14SMC を刺激します。これにより、共培養モデル15,16,17,18,19,20,21の他の記述と対照をなしてmRNA および蛋白質、分数を含む、異なる MEJ フィルター孔内の異なる画分を分離することについて説明します。この手法、VCCC を添加できます蛋白質活動12蛋白質のリン酸化の12,23, や転写22mRNA の局在の変化の具体的な調査。異なる立体構造11,18,242 つの細胞の種類の培養が可能だが、底部には、フィルターと SMC の上に EC のめっきが、この資料に記載されます。

<table><tbody><tr><td>直径24 mm、0.4 & マイクロ;m トランズウェル ポリエステル メンブレン フィルター インサート</td><td>コーニング</td><td>3450</td><td>これは、インサート</td></tr><tr><td>225 cm フラスコ</td>の 1 つの 6 ウェル プレートです <td>コーニング</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル プレート (フィルター インサートなし)</td><td>コーニング</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>一次ヒト冠状動脈内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2585</td><td></td></tr><tr><td>一次ヒト冠状動脈平滑筋細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2583</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 EC 基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EC 成長因子 (EGM2 MV シングルクォート)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4147</td><td>使用前に基礎培地に追加</td></tr><tr><td>SmBM SMC 基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3181</td><td></td></tr><tr><td>SMC 成長因子 (SmGM-2 SingleQuot)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4149</td><td>使用前に基礎培地に追加</td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA 10X</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>滅菌 dPBS</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>大型ペトリ皿 SMC メッキ用 (150mm)</td> <td>コーニング</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>ウシゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G-9382</td><td></td></tr><tr><td>ヒト フィブロネクチン</td><td>コーニング</td><td>356008</td><td>5&micro;g/ml of fibronectin and store at -20</td></tr><tr><td>10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>滅菌水で 1x に希釈</td></tr><tr><td>10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS)</td> <td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>滅菌水で 1x に希釈</td></tr><tr><td>ハンドル付き</td><td>Amazon</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Forceps Fisher</td><td>17-467-201</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>コーニング</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>BD ファルコン</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>10 mm シャーレ</td><td>ファルコン</td><td>35-1008</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNA 溶解試薬</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ158127</td><td></td><td>dPBSで4%溶液を作る</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>カビサイド消毒剤</td><td>フィッシャー</td><td>131000</td><td></td></tr><tr><td>RIPAタンパク質溶解バッファー</td><td>シグマ</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>ソニックディスメンブラネーター</td><td>フィッシャー</td><td>モデル50</td><td></td></tr><tr><td>EC/SMCの収穫のための1x PBS免疫細胞化学</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>無菌である必要はありません</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>包埋/切片作成/染色</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>自動ティッシュプロセッサー</td><td>エクセルシオール</td><td>ES</td><td></td></tr><tr><td>エンベディングステーション+コールドプレート</td><td>ライカ</td><td>HistoCore アルカディア</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテック アキュエッジ ミクロトームブレード</td><td>VWR</td><td>25608-961 または 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 埋込剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他のソリューション</td><td></td><td></td><td>**生細胞に溶液を使用する場合は、すべてのステップを無菌状態で実行してください</td></tr><tr><td>滅菌dPBS</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ水で滅菌します。滅菌水を使用してDPBS(450mL滅菌水:50mL 10X DPBS)を作成し、混合してろ過滅菌します(0.2μ;mフィルター). 最終濃度:滅菌する1X</td></tr><tr><td>滅菌HBSS</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ水。滅菌水を使用してHBSS(450mL滅菌水:50mL 10X HBSS)を作成し、混合してろ過滅菌します(0.2μ;><最終濃度:1X</td></tr><tr><td>フィブロネクチンストック溶液</td><td></td><td></td>フィ<td>ブロネクチンに50mLの滅菌水を使用して1mLのアリコートをストックし、必要になるまで凍結します 最終濃度:100&micro;g/mL</td></tr><tr><td>フィブロネクチンをVCCC</td><td></td><td></td>のSMC側にコーティングし、<td>1アリコートを解凍し、1mLのフィブロネクチン(100μ;g / mL)を19mLの1X HBSSに投与し、最終濃度5μに達します。g / mL. 最終濃度:5&micro;g/mL</td></tr><tr><td>2x トリプシン EDTA 溶液</td><td></td><td></td><td>10X 0.5% トリプシン-EDTA を 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X トリプシン) . 最終濃度: 2X</td></tr><tr><td>ブロッキング/抗体溶液</td><td></td><td></td> <td>(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg ウシ血清アルブミン, 500mL 正常血清)</td></tr> <tr><td>ウシゼラチンで EC VCCC</td><td></td><td></td> <td>をコーティング0.5gのウシゼラチンを100mLの蒸留水に混ぜます。初めて使用する前にオートクレーブを装着し、室温で保存してください。無菌状態で保管してください. 最終濃度:細胞</td></tr><tr><td></td><td></td>を採取するための0.50%<td>1x PBS</td><td>は無菌である必要はありません</td></tr></tbody></table>

抵抗血管の細胞培養モデル

A Cell Culture Model of Resistance Arteries 

Myoendothelial ジャンクション (MEJ) 小径抵抗血管でユニークなシグナリングの創製は、血管緊張や血圧を制御することができますシグナリング プロセス特定の蛋白質の局在を展示します。内皮細胞や平滑筋細胞からの投影は、その小型のためサイズ (〜 1 μ m2の面積平均)、上、MEJ と単独で勉強することは困難です。ただし、我々 は MEJ 形成体外、内皮細胞の極性形成とシグナル伝達タンパク質と抵抗の血管壁内のプロセスの郭清では、血管細胞共培養 (VCCC) と呼ばれる細胞培養モデルを開発しました。動脈。VCCC 多数のアプリケーションには、異なる種類の細胞に合わせて適応することができます。モデルは、0.4 μ m 孔体外でMEJs することができますフォームをフィルターの両側に成長して 2 種類の細胞で構成されています。ここでセルのめっきと内皮細胞の分離を介して VCCC を作成する方法について述べる MEJ、および蛋白質の隔離や活動のため使用することができます平滑筋分数の試金。埋め込み、および免疫蛍光分析用断面、そのまま細胞層でフィルターを固定できます。重要なは、このモデルからの発見の多くは生理学的な関連性を強調し、そのまま抵抗動脈を使用して確認されています。

VCCC 用フィルター挿入が小、0.4 μ m 穴。図 1 a、VCCC フィルター挿入の正面ビューは、毛穴、MEJ が生体外で形成できますを示しています。回路図は、一日前に、内皮細胞を反対側 (図 1 b) めっきフィルターの下側にメッキの平滑筋細胞を示しています。セルはメッキ後、EC、MEJ、および SMC の成分は分離の 3 日後にできます。図 2 a、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) が生体内でMEJs25見ても EC の残りの部分を基準にして MEJ 分数で表されます非常にこの例を示します。これらのデータは、そのままの細動脈の血管壁をさたに VCCC の有用性を示しています。
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抵抗血管の細胞培養モデルを説明することで、シグナル伝達経路の内皮細胞、平滑筋や内皮細胞と平滑筋 (myoendothelial ジャンクション) 間の解剖を可能にします。アゴニストまたは蛋白質の隔離、電子顕微鏡、蛍光抗体の選択的なアプリケーションは、この細胞培養モデルを使用して利用できます。

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

この手法の全般的な目的は、内皮細胞と平滑筋細胞をin-vitroで共培養し、小径の抵抗動脈に存在する筋内皮接合部を構築することです。この方法は、動脈壁におけるタンパク質の局在やシグナル伝達カスケードの活性化など、心血管分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、実際的な動脈では不可能である、内皮および平滑筋から筋内皮接合部画分を特異的に単離できる点にあります。パラフィン埋包の視覚的な実演は、工程を実際に見なければ習得が困難であるため、特に重要です。血管細胞共培養（VCCC）の構築を開始するために、150 mmのペトリ皿とその蓋に除菌剤をスプレーし、ペーパータオルまたはリントフリーワイプで拭き取ります。次に、ペトリ皿に70% ethanolをスプレーし、フード内で自然乾燥させます。滅菌条件下でフィルターインサートのプレートを開けます。プレートの側面のスリットからfiberactin溶液を最大1 mLピペッティングしてフィルターの底面に加え、フィルターの底面をコーティングします。フィルターの下半分が覆われていることを確認し、プレートのカバーをかけたまま、インサートをフード内に保持します。fiberaction溶液で30分間処理した後、フィルターインサートを乱さないようにして、余剰な溶液を吸引除去します。次に、プレートを反転させ、フィルターを清潔なペトリ皿の下半分に配置します。225 square centimeterのフラスコで培養した平滑筋細胞を、3 mLの予め加温したtrypsin EDTA溶液でトリプシン化します。細胞が剥離したら、トリプシンを中和するために9 mLのSMC培地を加えます。コニカルチューブに移してよく混合します。次に、細胞数を測定するため、ヘモサイトメーターに10 µLを分注します。細胞数をカウントした後、約75,000個の平滑筋細胞を含む細胞懸濁液750 µLを、各フィルターの底面に注意深く播種します。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。2日目に、清潔な6ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ温めておいた新鮮なSMC培地を2 mLずつ満たします。吸引によってインサートから培地を除去し、SMC培地が入った6ウェルプレートに移します。インサートの上側に0.5%牛ゼラチン溶液を1mL加え、37°Cで少なくとも30分間置きます。あらかじめ加温しておいたtrypsin EDTA溶液3mLを用いて、225cm²フラスコで培養した血管内皮細胞をトリプシン処理します。フラスコを軽く叩いて、細胞をプレートから剥離させます。細胞をEC培地で再懸濁し、細胞数をカウントした後、フィルターからゼラチンを除去します。次に、各フィルターインサートの上面に、1 mLの液量で360,000個のECを播種します。細胞を37 °Cで24時

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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抵抗血管の細胞培養モデル

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