抵抗血管の細胞培養モデル

抵抗血管の細胞培養モデルを説明することで、シグナル伝達経路の内皮細胞、平滑筋や内皮細胞と平滑筋 (myoendothelial ジャンクション) 間の解剖を可能にします。アゴニストまたは蛋白質の隔離、電子顕微鏡、蛍光抗体の選択的なアプリケーションは、この細胞培養モデルを使用して利用できます。

この技術の全体的な目標は、内皮細胞と平滑筋細胞をin vitroで一緒に培養し、小径抵抗動脈に発生する筋内皮接合部を作成することです。この方法は、タンパク質の局在化や動脈壁のシグナル伝達カスケードの活性化など、心血管領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実際の動脈を使用して行うことは不可能な、内皮と平滑筋から筋内皮接合部画分を特異的に分離できることです。

パラフィン包埋の視覚的なデモンストレーションは特に重要であり、包埋の手順はプロセスを見ないと習得が難しい場合があります。150ミリメートルのペトリ皿と蓋に消毒剤を噴霧し、ペーパータオルまたは糸くずの出ないワイプで拭くことにより、血管細胞共培養またはVCCCの構築を開始します。次に、シャーレに70%エタノールをスプレーし、フードに入れて風乾します。

無菌条件下でフィルターインサートのプレートを開きます。サイドスリットからプレートの底部に最大1ミリリットルのファイバーアクチン溶液をピペッティングすることにより、フィルターの底面をファイバーアクチン溶液でコーティングします。フィルターの下半分が覆われていることを確認し、インサートをフードに残し、プレートカバーを保ったままにします。

ファイバーアクション溶液で30分間処理した後、フィルターインサートを乱さずに余分な溶液を吸引します。次に、プレートを反転させ、フィルターをきれいなシャーレの下半分に置きます。平滑筋細胞の225平方センチメートルのフラスコを、3ミリリットルの予熱したトリプシンEDTA溶液でトリプシン化します。

細胞が浮き上がったら、トリプシンを中和するために9ミリリットルのSMC培地を追加します。円錐形のチューブに移し、よく混ぜます。次に、10マイクロリットルを血球計算盤にピペットで移し、細胞数を決定します。

細胞数を行った後、約75,000個の平滑筋細胞を含む細胞懸濁液750マイクロリットルを各フィルターの底面に慎重にプレートします。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。2日目に、清潔な6ウェルプレートの各ウェルに、あらかじめ温めた新鮮なSMC培地2ミリリットルを入れます。

インサートから培地を吸引して取り出し、SMC培地を入れた6ウェルプレートに移します。0.5%ウシゼラチン溶液1ミリリットルをインサートの上側に加え、摂氏37度で少なくとも30分間置きます。内皮細胞の225平方センチメートルのフラスコを、3ミリリットルの予熱したトリプシンEDTA溶液でトリプシン化します。

フラスコを軽くたたいて、細胞をプレートから持ち上げます。EC培地で細胞を再懸濁し、細胞数をカウントした後、ゼラチンをフィルターから取り出します。次に、各フィルターインサートの上面に1ミリリットルの容積で360,000ECをプレートします。

細胞を摂氏37度で24時間邪魔されずにインキュベートします。細胞培養フード内のインサートの1つの6ウェルプレートから培地を吸引して分画を開始し、次に氷上の冷蔵室に輸送します。冷蔵室で、10マイクロリットルのPBSをインサートのSMC側にピペットで移します。

セルリフターを使用して、SMCをこすり落とします。次に、細胞をスクレーパーから溶解バッファーを含む標識シャーレに移します。セルスクレーパーが溶解バッファーに触れたら、ペーパータオルで完全に拭いて乾かすまで、インサートフィルターに触れさせないでください。

SMCフィルターのスクラップをもう1〜2回繰り返して、残りのSMCセルの破片を完全に取り除きます。次に、10マイクロリットルのPBSをインサートフィルターの内皮細胞側にピペットで移します。ちょうど示したように、細胞を溶解緩衝液の適切に標識されたペトリ皿にこすり落とします。

ピペットでフィルターのEC側から細胞スラリーを回収し、適切にラベル付けされたペトリ皿に移します。フィルターの両側から細胞を徹底的に廃棄して、筋内皮接合部画分の細胞汚染を最小限に抑えてください。次に、メスを慎重に使用して、プラスチックインサートからフィルターを切り取ります。

これを行うには、プラスチックから70〜80%を切り取り、鉗子を使用してフィルターをプラスチックインサート構造から完全に引き抜きます。各フィルターを、溶解バッファーを含むラベル付きの50ミリリットルの円錐チューブにセットします。フィルターがバッファーに浸され、濡れたままであることを確認してください。

すべての細胞がフィルターから回収された後、50ミリリットルのMEJチューブを15秒間、またはよく混合されるまで全力でボルテックスします。鉗子を使用してMEJ円錐形からフィルターを取り外し、チューブの側壁に沿ってフィルターを引きずり、チューブ内に最大量のタンパク質と液体を残します。すべてのフィルターをMEJコニカルチューブから取り外したら、遠心分離機ですばやく回転させて、すべての液体とタンパク質をチューブの底に引き込みます。

スピン後、MEJチューブとSMCおよびECシャーレの内容物を別々の小さな遠心分離チューブに移します。次に、チューブを16, 000 x Gの近くで4°Cで15分間遠心分離します。上清を取り除きます。

次に、Byzinconeticアッセイを使用して細胞ライセートのタンパク質含有量をアッセイします。VCCCインキュベーションの5日目に、すすぎたフィルターインサートを含む各ウェルに4%PFAを添加し、摂氏4度で振とうしながら一晩インキュベートします。約24時間後、インサートを70%エタノールに少なくとも24時間移します。

フィルターを自動ティッシュプロセッサーで長時間処理します。実行後、鉗子を使用してカセットからフィルターを取り外してフィルターの端を保持し、はさみでフィルターを半分に切ります。2つの半分のそれぞれをコールドプレートに置き、埋め込み型に流動パラフィンを充填します。

充填された埋め込み型をコールドプレートに非常に短時間触れてから、フィルターの各半分を切断面を下にして埋め込み型に埋め込み埋め込み型に埋め込み、フィルターが中心から切断されていることを確認します。鉗子を使用してフィルターを所定の位置に保持し、パラフィンが十分に冷えて自立するまで、半分が互いに落ちるのを防ぎます。次に、埋込み型をコールドプレートに移し、完全に固まるまで動かします。

フィルターをかけたインサートを垂直方向に埋め込んで切断します。切片化後、VCCCを免疫染色して横行免疫蛍光染色を行うことができます。この免疫伝達電子顕微鏡の画像は、MEJでアルファグロビンが発現しているマウスの動脈を金色のビーズで標識したもので、黒い点として現れます。

このウェスタンブロットは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の1つの発現が、ECまたはSMC画分と比較してMEJ画分に濃縮されていることを示しています。プラスチックECとは、プラスチック皿上で成長したECで、MEJを形成しないECのことです。免疫染色により、VCCCモデルの緊密なコンパートメント化が明らかになります。

α-1アドレナリン受容体1つは平滑筋細胞層にのみ見られ、ブラジキニン受容体は内皮細胞層にのみ見られます。Fアクチン染色は、白矢印で示されているように、in vitro MEJで両方の細胞タイプにわたって行われます。この手順を試みるときは、収穫時まですべてを無菌に保ち、細胞を慎重にプレートし、フィルターを完全にこすり落とすことを忘れないでください。

この手順に続いて、ウェスタンブロッティングや免疫蛍光などの他の方法を実行して、タンパク質の局在、発現レベル、活性化などの追加の質問に答えることができます。