マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

このプロトコルの全体的な目標は、最先端の免疫組織化学を使用して、骨格筋線維の種類を正確かつ迅速に特定することです。この方法は、機能タンパク質の喪失によって繊維の種類の変化が引き起こされるかどうかなど、筋生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、筋肉疾患の多くのモデルに関する洞察を提供しますが、ノックインモデルやノックアウトモデルなどのシステムでも使用して、単一の分子が基本的な筋肉機能に与えるより大きな影響を明らかにすることもできます。

まず、マウスの筋肉の凍結切片を帯電したスライドで約30分間風乾します。乾燥したら、疎水性バリアPAPペンを使用して、各スライドのセクションの周りに境界線を描きます。次に、非特異的抗体の結合をブロックするために、描画された境界内にPBSに約250マイクロリットルの5%BSAをロードし、スライドを室温で1時間インキュベートします。

その間、一次抗体を5%BSA PBSで1〜50希釈分調製します。スライドあたり約250マイクロリットルを作り、希釈した抗体を氷上に保存します。ブロック期間終了後、スライドからブロック溶液を吸引し、抗体希釈液の250マイクロリットルアリコートを加えます。

ネガティブコントロールの場合は、一次抗体なしでPBSに5%BSAを塗布します。次に、ペトリ皿に湿らせた濾紙をロードし、インキュベーションチャンバー用のアルミホイルで覆います。次に、スライドを摂氏4度でチャンバー内または同じ湿度の同様の環境で24〜48時間インキュベー

一次抗体のインキュベーション後、スライドから溶液を吸引し、スライドを3回洗浄します。洗濯ごとに、PBSに約250マイクロリットルの5%BSAを約10分間塗布します。.スライドを洗浄しながら、精製した蛍光色素結合二次抗体を1〜200希釈液で調製します。

スライドあたり少なくとも250マイクロリットルを準備し、溶液を暗闇と氷の上に保ちます。3回目の洗浄後、希釈した二次抗体250μLをスライドに加えます。次に、スライドを暗湿環境下で室温で90分間インキュベートします。

インキュベーション後、抗体溶液を吸引し、前回と同様にスライドを3回洗浄します。余分な二次抗体をすべて洗い流した後、スライドをPBSですすぎ、10分間自然乾燥させます。最後に、非永久的な低粘度の水性封入剤を使用してスライドをマウントします。

ミディアムが乾いたら、カバースリップの端をマニキュアで密封し、スライドを不透明な収納ボックスに移します。スライドをイメージングする前に、70%エタノールでカバースリップを清掃します。次に、落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取得します。

低倍率で、1 平方ミリメートルの関心領域を選択します。Alexa 488標識抗体を表示するには、505ナノメートルのロングパスフィルターを使用します。Alexa 594標識抗体を表示するには、595ナノメートルのロングパスフィルターを使用します。

フィルターを適切に設定したら、デジタル画像の収集を開始します。その後の解析のために、縮尺記号を必ず含めてください。分析のために、この資料に付属のマクロに Fiji をインストールします。

マクロ ファイルは、簡単にアクセスできるディレクトリに格納します。次に、選択したセクションの明視野画像を読み込み、学習可能な weka セグメンテーション オプションに移動します。セクションのセルラー領域を規定するには、ファイバー上に線を引き、[クラス1に追加]をクリックします。

次に、細胞外ドメインをマークするには、ファイバー間のスペースに線を引き、[クラス 2 に追加] をクリックします。このプロセスを繰り返して、各クラスのラベルを 5 個から 10 個定義します。インタースティシャル境界をマークするのは難しい場合があります。

ズーム機能を使用すると、これらの境界をより正確にマークできます。次に、分類器の学習オプションを選択します。結果の赤と緑のオーバーレイで、自動プロセスによって誤ってセグメント化された画像の部分にラベルを手動で追加します。

赤でマークされた繊維が、緑でマークされた間にあるスペースから適切に分離されるまで、これを行います。次に、[確率の取得]をクリックして、画像を新しいファイルフォルダに保存します。次に、同じフィールドから取得した蛍光画像を使用して、プロセス全体を繰り返します。

免疫染色された繊維をクラス1とラベルし、すべての非蛍光領域をクラス2とラベル付けします。最終的には、結果の確率マップを、処理された明視野画像が保存されたのと同じフォルダに保存します。次に、以前にフィジーで保存した確率マップの1つを開きます。

イメージングソフトウェアが提供するスケールバーに直線を描きます。[スケールの設定] を選択し、スケール バーに基づいて正しい値を入力します。次に、グローバル オプションを切り替えて、スケールをすべての画像に標準化します。

次に、ファイバー定量化の Tyagi マクロを実行すると、ナビゲーション ウィンドウが表示されます。次に、画像ホストフォルダを開きます。関連付けられたダイアログ ボックスで、背景のドロップダウン値を light に変更します。

測定設定機能を使用して、測定するパラメーターを定義できます。CSAと足の直径は、繊維の形態を定量化するための最も適切な尺度です。マクロを実行すると、フォルダーにはファイバーのアウトラインの画像と、不十分な分析機能によって行われた測定値を含むスプレッドシートが格納されます。

前脛骨筋とヒラメ筋は、ほとんどが速筋線維または遅筋線維のいずれかで構成されているため、記載されている方法を使用して分析されました。特異的抗体を用いて、いくつかの異なるミオシン重鎖を同定した。ヒラメ筋線維のかなりの部分がタイプ1およびタイプ2のAミオシン重鎖を発現し、残りの繊維のかなりの量がタイプ2 X.By コントラストに対して陽性であり、タイプ2のB線維は事実上明らかではありませんでした。

これに対し、染色された脛骨筋前部の筋は、ほとんどがB型とX型Xの重鎖繊維で構成されており、2型A鎖を発現する繊維からの寄与は小さく、1型鎖で発現する繊維はほとんどなかった。2型Aミオシン重鎖に向けられたSC-71抗体でプローブされた前脛骨筋の形態測定分析により、確率マップの作成に使用されるいくつかの画像変換が提供されました。この簡単な自動分析により、データは、はるかに面倒な手動計算を使用して生成されたデータと完全に比較可能であることが証明されました。

全体として、分析により、約 6, 000 本の個々の繊維からデータが得られます。高いデータスループットにより、統計分析がはるかに実現可能になりました。このビデオを見れば、筋肉切片の免疫染色方法と、筋線維の種類と組成の分析を容易にするための半自動ソフトウェアの使用方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、筋肉が局所的に不均一である可能性があり、筋線維の種類と組成を厳密に評価するには多くの筋場の分析が必要であることを覚えておくことが重要です。この手順と組み合わせて、トリコーム染色のような他の方法を実行して、線維症が繊維タイプの組成の変化と並行して発症するかどうかなどの追加の質問に答えることができます。