Name: マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶマウス骨格筋の免疫組織化学染色と半自動解析アルゴリズムを用いた繊維型同定法。筋形態と繊維組成を迅速に評価し、筋生物学研究や疾患メカニズム解明に有用です。

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この研究の彼らのサポートのベッチャー財団と筋萎縮性側索硬化症協会 (#17-II-344) に感謝しております。

マウスを含むすべてのプロシージャは、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパス機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された (91813(05)1D)。
 1 です一日 1: プライマリ (1 °) ウシ血清アルブミン (BSA) ブロック染色 <ol><li>マウスの後肢筋 (例えば、前脛骨筋、ヒラメ筋) の空気乾燥凍結切片の荷電のスライドに取付けた ~ 30 分。 11. 疎水性障壁 PAP のペンを使用してセクションに境界線を描画します</li>。
	<li>場所 ~ 5 %bsa/リン酸緩衝生理食塩水 (BSA/PBS) 非特異抗体の結合をブロックする各スライド上を 250 μ l 添加します。スライド 1 のため室温で孵化させなさい</li>
	<li>ブロック中準備 1:50 5% 培養上清 1 ° 抗体の希釈 BSA/PBS (すべてはマウス モノクローナル抗体; 表 1 6 , 12 を参照してください); の 250 μ L を準備スライドごとのソリューションです。氷に 1 ° 抗体株式および希薄を維持</li>
</ol> <img alt="Table 1"src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg"/> テーブル 1: 一次抗体 MyHCs を区別するために使用します。
<ol start="4"> <li>5 %bsa/PBS ブロッキング液の吸引は、次の適切なスライドに 1 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。追加 250 μ L の 5 %bsa/PBS (2 °) 二次抗体だけネガティブ コントロールをスライドです</li>。
	4 ° C、湿度の高い環境で 24-48 h で <li>加温します 。
	注: 湿らせたろ紙をアルミ箔で覆われてペトリ皿は適切なインキュベーション室として役立つかもしれないです</li>。
</ol> 2。日 2:2 ° 蛍光抗体染色 <ol><li>1 ° 抗体溶液を吸引または 5 %bsa/PBS 溶液を制御します。洗ってすべてスライド 3 回、10 分の 5 %bsa</li>。
	<li>洗濯中準備 5% の精製、fluorophore 共役 2 ° 抗体の希薄を 1: 200 BSA/PBS (表 2 を参照してくださいすべてがヤギ抗マウス)。スライドごとに解決策の 250 μ L を準備します。氷で暗闇の中 2 ° 蛍光標識抗体を保持</li>
</ol> <img alt="Table 2"src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg"/> テーブル 2: 蛍光標識二次抗体を視覚化する一次抗体認識の MyHCs するために使用します。
<ol start="3"> <li>5 %bsa/PBS ブロック ソリューションの 3 番目のアプリケーションの吸引は、次のすべてのスライドに 2 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。暗く、湿気の多い環境で室温で 90 分間インキュベートします</li>。
	<li>吸引 2 ° 抗体溶液。洗ってすべてスライド 3 回 10 分 5% の BSA/PBS</li>。
	PBS の <li>リンス。10 分間乾燥</li>
	<li>マウント非常任理事、低粘度の水性取付中 coverglass</li>。
	<li>、乾燥時は、マニキュアとスライド エッジをシールします。乾燥し、暗い slidebox に格納します</li>。
</ol> 3。落射蛍光顕微鏡でスライドをイメージング <ol><li>きれいに拭きます小、70% エタノールに浸したラボ - スライドです</li>。
	<li>写真装置 (材料の表 を参照) を搭載した落射蛍光顕微鏡を使って immunostained 筋セクションのデジタル画像を取得します。
	<ol><li>約 1 mm 2 (10 × 対物、1.4 NA) の領域を選択します</li>。
		<li>ビューを介して、505 アレクサ 488 共役 2 ° 抗体蛍光 nm ロングパス ・ フィルター。595 nm ロングパス ・ フィルターを介して Alexa 594 共役 2 ° 抗体の励起による蛍光を表示します。互換性のあるイメージング ソフトウェアを搭載した PC のコンピューターで画像をデジタル化します。イメージング ソフトウェアを後で分析からスケール バーが含まれます</li>。
	</ol></li></ol> 4。フィジー画像の解析 注: 解析に進む、前にフィジー (健康の国民の協会、ベセスダ、MD から自由に利用可能) は、https://imagej.net/Fiji/Downloads 経由でインストールする必要があります。また、このプロセスで使用するマクロは、補足のファイル で提供されます。マクロ ファイルを簡単にアクセスできるディレクトリに配置します。
フィジーで選択したセクションの <ol><li>ロード、明視野イメージ。プラグインに移動 &#8594; 分割 &#8594; Trainable ウェカ ・ セグメンテーション</li>。
	、光ファイバーの線を描画し、セクションの細胞領域を規定するために <li>&#34; クラス 1 に追加 &#34;。繊維間空間に線を描画し、その後、&#34; クラス 2 に追加 &#34; 細胞外ドメインをマークします。各クラスで 5-10 ラベルがあるまでを繰り返します。
	<ol><li>クリック鉄道分類子。結果の赤と緑のオーバーレイで手動で複数のラベルを追加 (手順 4.2 参照)、必要な場合は、イメージの正しく分割部分に。繊維 (赤) は、繊維 (グリーン) 間のスペースから適切に分離されてまで繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>クリックして &#34; 取得確率 &#34; と新しくラベル付けされたフォルダーに画像を保存します</li>。
	<li>は、同じフィールドから撮影した蛍光画像と (手順 4.2 4.3) の上記の手順を繰り返します。ラベルの immunostained 繊維として &#34; クラス 1 &#34; とすべての非蛍光性領域として &#34; クラス 2 &#34;。結果の確率マップを加工し、明視野イメージが格納されている同じフォルダーに保存します</li>。
	<li>はフィジーで以前に保存した確率マップの 1 つを開きます。イメージング ソフトウェアによって提供されるスケール バーの直線を描画します。分析に行く &#8594; スケールを設定します。スケール バーで指定された適切な値 (すなわち、既知の距離、長さの単位) パラメーターを変更し、チェック、&#34; グローバル &#34; 各イメージの尺度を標準化します</li>。
	<li>のプラグインに移動 &#8594; マクロ &#8594; を実行 &#8594; Tyagi ら 繊維定量 macro.ijm (補足ファイル を参照してください)。すぐに、ナビゲーション ウィンドウが表示されます。画像を開く &#39; s ホスト フォルダー;ダイアログ ボックスが表示されます。各ダイアログ ボックスの変更、&#34; 背景 &#34; ドロップ ダウン値 &#34; 光 &#34; 注: フォルダーが繊維アウトラインの画像と (CSA ・ フェレー径に最も関連する結果のスプレッドシート ソフトウェア ファイルが表示されます繊維形態の定量化測定されたパラメーターで調整できます設定測定の分析)。フィジーの細孔解析関数によって生成された繊維形態データをスプレッドシート ソフトウェア両方の蛍光および明るいフィールド画像のファイルに自動的に転送されます</li>。
	<li>蛍光繊維分野で対応する明視野イメージで総繊維数の数を割ることによってフィールドで指定された MyHC を表現する繊維の割合を計算します</li>。
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

著者は開示する利害の対立があります。

ここでは、骨格筋線維の種類を識別するための有用な方向を提供しております。そうすることで、データの解析のための新たなアルゴリズムについて述べる.
我々 の結果は主前レポート5,8,10のものを確認して、私たち自身の手動測定を反映、アルゴリズムが正確に表示されます。まだ、アーティファクトを断面から生じる不透明繊維境界線を含むいくつかのまれな実験的落とし穴が発生しました。注意区分および分析の前に処理されたセクションの警戒の検討を通じてこれらの人工物の影響を最小化できます。特に、シャープなコントラストを達成するために同じ画像を再分類の複数回のラウンドをより少なくより最適な画像分割を回避する可能性があります。
我々 のプロトコルの最も重要なステップは 4.2 に定めるセクションの細胞および細胞外領域で特定の光ファイバー線を描画することによって「クラス ...

それは、骨格筋は多くのタイプ1の単繊維から成るいくつかの時間のために知られています。当初は、繊維の 2 つのグループがその収縮特性に基づく特徴付けられると名前は、適切に、遅筋 (タイプ I) と速筋 (タイプ II)。これらのカテゴリは、繊維の代謝に基づくさらに区別されていました。以来タイプ I 繊維はミトコンドリアで豊富であり、酸化的代謝に依存して、彼らを力強く肯定的なニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドテトラゾリウム還元酵素 (NADH-TR) のジアホラーゼ2またはコハク酸脱水素酵素 (SDH) の3で解明しました。染色。対照的に、タイプ II 線維展示低い NADH TR ジアホラーゼの SDH 可変度染色と速筋の 2 つのサブグループに分けられた (タイプ IIA、IIB 型) の相対的な酸化能力に基づいてややぞんざい。繊維のこれらの違いは、ミオシン ATPase 染色によるより効果的に可視化されている型、pH 4.0 で前培養後繊維染色暗いとタイプ IIB 線維はタイプ IIA 線維で pH 10.0 に沈殿物次中古インキュベーションを吸収します。4を染色中間。
最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維タイプ5の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA 型し、タイプ IIB 線維がすべて識別する精度の MyHC プロファイルに基づきます。さらに、別の速筋代謝中間体繊維の種類は識別された6されている IIX を入力します。1 つ以上の MyHC を表現するハイブリッド繊維また確認された5,7,8をされています。猫やヒヒなどいくつかの種は、エクスプレス タイプ IIB MyHCs6にない知られています。MyHC 免疫染色は筋組成の最新の評価では現在、この手法で得られたデータの解析は面倒で時間のかかる自動支援なし。このため、半自動化された方法でこれらのデータを分析する一握りは先進5,9,10をされています。ここでは、半自動化された小説と一緒に筋線維タイプ5,7,8,10,の免疫組織化学的同定のため比較的標準的なプロトコルを提案します。アルゴリズムの精度で光ファイバー型および繊維の形態の分析を加速します。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>疎水性バリア パップペン</td><td>科学機器研究所</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>グローブ サイエンティフィック</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>イミュマウント</td><td>サーモサイエンティフィック サイエンティフィ</td><td>ック 9990402</td><td></td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>ロレアル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス TE-200 倒立蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡</td><td></td><td>販売終了</td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 一次抗体</td><td>開発研究 アイオワ</td><td></td>大学のハイブリドーマバンク <td>モノクローナルマウス IgG2b;1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monclonal mouse IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td>, <td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td>, <td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗 IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>ヤギ抗マウス; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗 IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>ヤギ抗マウス;1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗 IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>ヤギ抗マウス;1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>冷却 liguid 窒素</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, 1x</td></tr><tr><td>に希釈 Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

長年、骨格筋線維のタイプ間の区別されたミオシン ATPase 染色による視覚化に最適。最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維型の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA、IIX を入力を入力し、タイプ IIB 線維は、MyHC プロファイルに基づく精度で今識別できます。ただし、これらのデータの手動解析が遅いと右下をすることができます退屈。この点では、繊維の種類組成と形態の迅速で正確な評価は非常に望ましいツールです。ここでは、最新の免疫組織化学染色繊維の種類や繊維の形態の分析を加速する新たな半自動アルゴリズムとのコンサートでマウスの後肢筋から得られた凍結切片における MyHCs のためのプロトコルを提案する.ヒラメ筋が表示されます染色タイプ I およびタイプ IIA 線維、予想通り、ではなく、IIX またはタイプ IIB 線維。その一方で、前脛骨筋 IIX とタイプ IIB 線維、タイプ IIA 線維のごく一部の主にで構成されていた、またはほとんどないタイプ I 線維。いくつかのイメージの変換は、繊維形態を (すなわち、断面積 (CSA)、極大値と極小のフェレー径) のさまざまな側面を測定する目的について確率マップを生成する使用されました。これらのパラメーターが手動で得られた値と比較し、得られた値。CSA、最大または最小のフェレー径に関して解析のいずれかのモード間に有意差は認められなかった (すべてp &#62; 0.05)、提案手法の精度を示します。したがって、私たちの免疫染色解析プロトコルは高齢化とミオパチーの多くのモデルで筋肉の組成に及ぼす影響の調査に適用できます。

後肢筋 (すなわち、前脛骨筋、ヒラメ筋) 年齢不詳の男性 c57bl/6 マウスから解剖されたフラッシュ 10 月に筋肉を含むプラスチック金型の沈没によって固定されている液体窒素冷却イソペンタン化合物。8-10 μ m の切片が、cryotome を使用して、-20 ° C でカットし、異なる荷電ガラス スライド12に転送します。
これらの筋肉が高速と低速筋線維、それぞれ13,14主にで構成されるので、我々 は前脛骨筋とヒラメ筋を選んだ。次の免疫組織化学的染色個々 のタイプ I、IIA、IIX および IIB MyHCs、明視野と蛍光イメージは捕獲されました。図 1の左のパネル表示型とヒラメ筋の immunost...

骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

このプロトコルの全体的な目標は、最先端の免疫組織化学を使用して、骨格筋線維の種類を正確かつ迅速に特定することです。この方法は、機能タンパク質の喪失によって繊維の種類の変化が引き起こされるかどうかなど、筋生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、筋肉疾患の多くのモデルに関する洞察を提供しますが、ノックインモデルやノックアウトモデルなどのシステムでも使用して、単一の分子が基本的な筋肉機能に与えるより大きな影響を明らかにすることもできます。まず、マウスの筋肉の凍結切片を帯電したスライドで約30分間風乾します。乾燥したら、疎水性バリアPAPペンを使用して、各スライドのセクションの周りに境界線を描きます。次に、非特異的抗体の結合をブロックするために、描画された境界内にPBSに約250マイクロリットルの5%BSAをロードし、スライドを室温で1時間インキュベートします。その間、一次抗体を5%BSA PBSで1〜50希釈分調製します。スライドあたり約250マイクロリットルを作り、希釈した抗体を氷上に保存します。ブロック期間終了後、スライドからブロック溶液を吸引し、抗体希釈液の250マイクロリットルアリコートを加えます。ネガティブコントロールの場合は、一次抗体なしでPBSに5%BSAを塗布します。次に、ペトリ皿に湿らせた濾紙をロードし、インキュベーションチャンバー用のアルミホイルで覆います。次に、スライドを摂氏4度でチャンバー内または同じ湿度の同様の環境で24〜48時間インキュベートします。一次抗体のインキュベーション後、スライドから溶液を吸引し、スライドを3回洗浄します。洗濯ごとに、PBSに約250マイクロリットルの5%BSAを約10分間塗布します。.スライドを洗浄しながら、精製した蛍光色素結合二次抗体を1〜200希釈液で調製します。スライドあたり少なくとも250マイクロリットルを準備し、溶液を暗闇と氷の上に保ちます。3回目の洗浄後、希釈した二次抗体250μLをスライドに加えます。次に、スライドを暗湿環境下で室温で90分間インキュベートします。インキュベーション後、抗体溶液を吸引し、前回と同様にスライドを3回洗浄します。余分な二次抗体をすべて洗い流した後、スライドをPBSですすぎ、10分間自然乾燥させます。最後に、非永久的な低粘度の水性封入剤を使用してスライドをマウントします。ミディアムが乾いたら、カバースリップの端をマニキュアで密封し、スライドを不透明な収納ボックスに移します。スライドをイメージングする前に、70%エタノールでカバースリップを清掃します。次に、落射蛍光顕微鏡を使用してデジタル画像を取得します。低倍率で、1 平方ミリメートルの関心領域を選択します。Alexa 488標識抗体を表示するには、505ナノメートルのロングパスフィルターを使用します。Alexa 594標識抗体を表示するには、595ナノメートルのロングパスフィルターを使用します。フィルターを適切に設定したら、デジタル画像の収集を開始します。その後の解析のために、縮尺記号を必ず含めてください。分析のために、この資料に付属のマクロに Fiji をインストールします。マクロ ファイルは、簡単にアクセスできるディレクトリに格納します。次に、選択したセクションの明視野画像を読み込み、学習可能な weka セグメンテーション オプションに移動します。セクションのセルラー領域を規定するには、ファイバー上に線を引き、[クラス1に追加]をクリックします。次に、細胞外ドメインをマークするには、ファイバー間のスペースに線を引き、[クラス 2 に追加] をクリックします。このプロセスを繰り返して、各クラスのラベルを 5 個から 10 個定義します。インタースティシャル境界をマークするのは難しい場合があります。ズーム機能を使用すると、これらの境界をより正確にマークできます。次に、分類器の学習オプションを選択します。結果の赤と緑のオーバーレイで、自動プロセスによって誤ってセグメント化された画像の部分にラベルを手動で追加します。赤でマークされた繊維が、緑でマークされた間にあるスペースから適切に分離されるまで、これを行います。次に、[確率の取得]をクリックして、画像を新しいファイルフォルダに保存します。次に、同じフィールドから取得した蛍光画像を使用して、プロセス全体を繰り返します。免疫染色された繊維をクラス1とラベルし、すべての非蛍光領域をクラス2とラベル付けします。最終的には、結果の確率マップを、処理された明視野画像が保存されたのと同じフォルダに保存します。次に、以前にフィジーで保存した確率マップの1つを開きます。イメージングソフトウェアが提供するスケールバーに直線を描きます。[スケールの設定] を選択し、スケール バーに基づいて正しい値を入力します。次に、グローバル オプションを切り替えて、スケールをすべての画像に標準化します。次に、ファイバー定量化の Tyagi マクロを実行すると、ナビゲーション ウィンドウが表示されます。次に、画像ホストフォルダを開きます。関連付けられたダイアログ ボックスで、背景のドロップダウン値を light に変更します。測定設定機能を使用して、測定するパラメーターを定義できます。CSAと足の直径は、繊維の形態を定量化するための最も適切な尺度です。マクロを実行すると、フォルダーにはファイバーのアウトラインの画像と、不十分な分析機能によって行われた測定値を含むスプレッドシートが格納されます。前脛骨筋とヒラメ筋は、ほとんどが速筋線維または遅筋線維のいずれかで構成されているため、記載されている方法を使用して分析されました。特異的抗体を用いて、いくつかの異なるミオシン重鎖を同定した。ヒラメ筋線維のかなりの部分がタイプ1およびタイプ2のAミオシン重鎖を発現し、残りの繊維のかなりの量がタイプ2 X.By コントラストに対して陽性であり、タイプ2のB線維は事実上明らかではありませんでした。これに対し、染色された脛骨筋前部の筋は、ほとんどがB型とX型Xの重鎖繊維で構成されており、2型A鎖を発現する繊維からの寄与は小さく、1型鎖で発現する繊維はほとんどなかった。2型Aミオシン重鎖に向けられたSC-71抗体でプローブされた前脛骨筋の形態測定分析により、確率マップの作成に使用されるいくつかの画像変換が提供されました。この簡単な自動分析により、データは、はるかに面倒な手動計算を使用して生成されたデータと完全に比較可能であることが証明されました。全体として、分析により、約 6, 000 本の個々の繊維からデータが得られます。高いデータスループットにより、統計分析がはるかに実現可能になりました。このビデオを見れば、筋肉切片の免疫染色方法と、筋線維の種類と組成の分析を容易にするための半自動ソフトウェアの使用方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、筋肉が局所的に不均一である可能性があり、筋線維の種類と組成を厳密に評価するには多くの筋場の分析が必要であることを覚えておくことが重要です。この手順と組み合わせて、トリコーム染色のような他の方法を実行して、線維症が繊維タイプの組成の変化と並行して発症するかどうかなどの追加の質問に答えることができます。

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医学

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。...

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。...

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。...

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

このプロトコルは、ドットブロッティング技術を使用して、ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームに従って、凍結乾燥したヒト骨格筋および繊維タイプの分類からの単一繊維の分離を示しています。同定されたMHC...

ヒト骨格筋の線維型同定

我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。...

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

ミトコンドリア染料標識の局所注射、シュワン細胞ミトコンドリアの生 体内...

マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法

分離して骨格筋に発現し、最も豊富なタンパク質の同一性を決定するための方法の直接的なセット。約800スポットが10...

プロテオミクスから骨格筋の性別二型

学ぶマウス骨格筋の免疫組織化学染色と半自動解析アルゴリズムを用いた繊維型同定法。筋形態と繊維組成を迅速に評価し、筋生物学研究や疾患メカニズム解明に有用です。

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

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