分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

この手順の全体的な目標は、孤立した抵抗性動脈を利用して、血管作用刺激に対する血管の反応性をテストすることです。また、平滑筋の制御メカニズムと受動的な機械的特性の変化を評価する方法も示します。この方法は、さまざまな条件下での小抵抗動脈の内皮および血管平滑筋制御メカニズムに関する血管生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、抵抗の小さい動脈を実質細胞環境から分離し、血管作用性刺激に対する応答がテストされている間、正常圧力に維持できることです。この技術の意味は、血管機能障害の治療と診断にまで及びます。この種の操作は生体内では不可能です。

この方法は末梢血管疾患についての洞察を提供することができますが、冠状動脈疾患にも適用できます。マイクロカニューレ挿入のステップは、手順の繊細さと動脈の損傷を避ける必要があるため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。実験当日は、2リットルの三角フラスコに2リットルの生理的塩溶液を調製します。

20Xバッファーストックを添加する際には、溶液がガス混合物と連続的に平衡化し、磁気攪拌バーで攪拌していることを確認してください。次に、混合物に0.28グラムのリン酸一ナトリウムを加えながらpHを観察します。必要に応じて、パスツールピペットから6つの正常塩酸または6.5の正常水酸化ナトリウム溶液のいずれかを滴下してpHをダストし、pHが7.4に留まるようにします。

次に、1.98グラムのグルコースを生理的塩溶液に加えます。次に、20倍のストック溶液を脱イオン水で希釈することにより、500ミリリットルのカルシウムを含まない生理学的塩溶液を調製します。次に、20Xバッファーストック25ミリリットルを三角フラスコに加え、溶液のpHをモニタリングおよび調整しながら、0.07グラムのリン酸ナトリウムを溶液に加えます。

テトラフルオロエチレンチューブを使用して、適切なガス混合物を含むガスタンクを臓器浴に接続します。容器チャンバーに流入する溶液の連続的な、しかし乱流の泡立ちを防ぐのに十分な速度で溶液を連続的に泡立てます。また、平衡化ガス混合物に接続された小さなエアストーンを容器チャンバーに配置して、生理学的塩溶液のガス組成を維持します。

生理的塩溶液を2リットルのマリオットボトルに入れます。ストッパーに中央のガラス管を追加して、生理的塩溶液を薬理学的臓器浴に連続的に供給するリザーバーとして機能し、溶液を血管チャンバーに供給します。マリオットボトルの中央ガラス管の開口部を、臓器浴の生理学的塩溶液の上部と同じレベルに置きます。

これにより、生理的塩溶液を臓器浴に送達するための一定の静水圧ヘッドが確保されます。J字型のガラス管に接続されたポリエチレンチューブを使用して、マリオットボトルから生理塩溶液を臓器浴に送り込みます。ルーメンナル増殖の場合は、ポリエチレンチューブを使用して、流入ピペットを、目的の流入圧力を維持する位置に上昇した66-CCプラスチックシリンジで構成される生理的塩溶液リザーバーに接続します。

ストップコックを介して圧力トランスデューサをシステムに接続して、圧力を監視します。次に、アウトフローピペットをポリエチレンチューブに接続し、インフローリザーバーと同様のリザーバーに接続して、圧力勾配に応じて生理塩溶液が容器内を流れるようにします。また、同様のストップコックと圧力トランスデューサー接続を使用して、流出圧力を監視します。

Sprague Dawleyラットの脳を取り出し、氷冷した生理学的塩溶液で満たされたガラスのペトリ皿に仰臥位に置きます。次に、皿をステレオスコープの下に置きます。ヴァンナスのハサミとデュモンの5番の細い先端の鉗子を使用して、脳から中大脳動脈を切除します。

次に、鉗子を使用して中大脳動脈から残っている脳組織を洗浄します。動脈を切除されたセグメントの端でそっと保持して血管チャンバーに移し、慎重にチャンバー内に配置します。.次に、先端が動脈の内腔に進むまで、大脳動脈をピペットベースに向かって引っ張ることにより、脳動脈を流入マイクロピペットにねじ込みます。

動脈の周りの10-0縫合糸から以前にからかわった一本鎖繊維から調製されたループを結ぶことにより、流入ピペットに動脈を固定します。次に、血管の周りの2番目の縫合ループを締めて、中大脳動脈の反対側の端を流出ピペットに固定し、流入ピペットホルダーに接続されたマイクロメーターを使用して動脈をその場の長さに伸ばします。動脈内の圧力を一定に保つために、10-0縫合糸からからかわれた一本鎖を使用して、すべての側枝を結びます。

次に、ビデオマイクロメータとテレビモニターに接続された解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラで構成されるビデオ顕微鏡をセットアップします。このセットアップを使用して、動脈の内径を測定します。実験前に動脈が適切なレベルの活性緊張を示すことを確認することにより、血管拡張薬刺激に対する筋形成緊張と血管反応を評価します。

通常は能動的安静時緊張を示さない小さな腸間膜動脈などの血管を除いて、安静時に能動的緊張を欠く動脈を廃棄します。.次に、血管チャンバーに濃度を上げるアセチルコリンを添加し、血管の直径を測定して、カニューレ挿入された抵抗動脈の内皮依存性反応性をテストします。この例では、動脈は、アセチルコリンに応答して拡張しないことによって示されるように、内皮機能障害を示します。

実験の最後に、カルシウムを含まない生理学的塩溶液を灌流液と超灌流液に加えて、動脈の最大直径を決定します。この測定値を使用して、アクティブな安静時音のパーセントを計算します。カルシウムを含まない生理的塩溶液の最大拡張の実証は、アセチルコリンに応答して動脈が拡張しなかったのは、血管の構造的リモデリングによる動脈の弛緩不能によるものではなく、内皮機能障害によるものであったことを検証しています。

この図は、3つの狭窄したコンジェニック株の雄のダール塩感受性ラットから分離された中大脳動脈における内皮依存性血管拡張薬アセチルコリンへの応答を示しています。.これは、アセチルコリンへの内皮依存性の拡張が、塩感受性の親株と塩感受性のレナン対立遺伝子を保持する両方のコンジェニック株に存在しなかったことを示しています。塩分感受性の遺伝的背景にある茶色のノルウェーレナン対立遺伝子を運ぶ同遺伝子株では、正常な拡張が回復し、SSラットの内皮機能障害がレナン遺伝子の調節障害によるものであるという仮説を支持しています。

この実験では、高塩分食がラットの特定の株における内皮依存性のアセチルコリンへの拡張を排除できなかったこと、食事性塩分摂取量の増加時の血管酸化ストレスと内皮機能障害の寄与に関する知見。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、3時間から3時間半で行うことができます。この手順を試みるときは、平滑筋、特に内皮への損傷を避けるために、孤立した動脈を非常に慎重に取り扱うことを忘れないでください。

この手順に続いて、血管収縮薬や血管拡張薬、受容体拮抗薬の追加などの他の方法を実行して、さまざまな物質に対する血管反応性に影響を与えるメカニズムや血管への薬物作用のメカニズムなどの質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、血管生物学と微小循環生理学の分野の研究者が、実験動物とヒトのさまざまな血管床からの抵抗動脈の平滑筋と内皮機能を探求する道を開きました。このビデオを見れば、この方法を使用して、さまざまな血管床からの小さな抵抗動脈の内皮および血管平滑筋の制御メカニズムを評価する方法について十分に理解できるはずです。