Name: 分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶラットの分離抵抗性動脈を用いたビデオ顕微鏡法による血管反応性評価。内皮細胞と平滑筋の制御機構を解析し、血管機能障害の診断と治療法開発への応用を示す。

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著者は表現、心からケイティ Fink とリン Dondlinger のおかげで、この原稿の準備のために貴重な援助。
助成: NIH #R21-OD018309;#R56-HL065289;#R01 HL128242。

著者は競合する金融興味を持ってないです。

述べる導入で説明した、ようテレビ顕微鏡を使用し、分離抵抗動脈だけでなく、標準ラットモデル (とビデオで採用)、血管機能評価へのアプローチがまたで専門性の高い遺伝子設計されたラット系統は、小説を示し、これらのアプローチを活用した得ることができる強力な洞察力。アクティブ トーンを評価するこれらの強力な技術の使用と受動的な機械的性質抵抗小動脈内皮依存性規制を含む血管制御メカニズムの広いスペクトルに関する重要な情報を提供できます。抵抗血管でアクティブなトーンの正常と病態生理学的条件、受動性動脈の血管平滑筋機能は血管リモデリングに関連し、血管壁の力学の変化します。内皮機能不全は心血管関連死63, を含む人間の複数の不利な心血管イベントの強力な予後指標が示されているし、● キャニュレイテッド抵抗動脈準備がで特に貴重なもの内皮機能不全により、内皮機能障害のメカニズムの私達の理解を高めることです。
分離抵抗血管を用いたビデオ顕微鏡技術の in vitroの有効性を示すためには、我々 は例を新規コンソミック、ダール食塩感受性 (SS)...

多くの利用動脈導管動脈における血管機能の初期の研究の場合、大動脈です。太い動脈の力発生一般的に動脈のリング セグメントを組織内の力覚センにアタッチすることにより検討しました。大動脈の場合ヘリカル切削によってストリップ容器の平滑筋線維間の接続点との収縮によって発生する力の最良推定値を提供するために、力覚セン縦方向に指向されたので、その縦軸に沿って平滑筋。大動脈のヘリカル ストリップを切断するための標準的な方法は、血管の内腔にガラス棒を置いて、希望の角度で血管壁に切れ込み、カットは全体を生成する拡張された血管壁の露出の端の端につかまって容器のヘリカル ストリップ。その時点では、血管の内皮側だった容器ストリップを合力トランスデューサーに接続して、酸素の準備を水没前に破片を削除する一般的に消された、温度制御組織バス。最終的には、アプローチが Furchgott、Zawadski1、すなわち内皮の役割によって生理学の歴史の中で最も有名で重要な発見の一つにつながった由来リラックス因子 (EDRF)、その後に窒素酸化物で識別されます。血管機能を調節します。その発見につながる重要なイベントは調査官が外部表面と動脈の内皮側との接触を避けることでそのまま血管内皮細胞を維持し、大動脈のストリップは予想される展示していないことに気づいた状況アセチルコリン (ACh) が、ACh の応答の代わりにリラックスに収縮します。その観察に基づいて、調査官大動脈の標準はすばのストリップを (しかし、収縮力を生成できません) そのまま内皮と大動脈セグメントを接続いる「サンドイッチ」準備を開発し、ACh による変換緩和に収縮します。
この分野で現在広く使用されている 2 つの主要な進歩は、小さな抵抗動脈2,3でアクティブな収縮力を測定する製剤の開発(小腸間膜3のものなど) と抵抗動脈準備4,5,6を cannulated。最も早いレポートのいずれか、Mulvany とハルパーン3は自然発症高血圧ラット (SHR) の小腸間膜から分離抵抗血管の収縮力を勉強するワイヤー第 1 報準備の使い方を説明し、正常血圧 WKY コントロール。ワイヤー第 1 報システムの開発後、● キャニュレイテッド抵抗動脈準備は生体内での条件4,5,6に近い血管の研究を許可するように開発されました。 両方のアプローチは、貴重な結果を提供する、効果的な動脈の本質的なアクティブな調子を維持以上の追加のメリットがあります ● キャニュレイテッド動脈準備経壁圧と容器のレスポンス流量と血管内皮のせん断応力の変化の変化に筋活動を研究する研究者を許可して (を参照してくださいハルパーンとケリー6レビュー)。
本稿の主要な目標は重要なこれらのアクティブなトーンを調節するメカニズムに関する正確な情報を得るために分離、● キャニュレイテッド抵抗血管を用いたビデオ顕微鏡の昔ながらの手法を採用する方法を説明します血管、神経、体液、または実質のセルの独立に影響します。この基本情報は、採用の標準ラット モデルとの私たちの研究から例を新しい遺伝子ラット系統を設計、テレビで得られる血管の機能に関する洞察力の種類の考えを読者に提供します顕微鏡のアプローチ、およびすべてのコントロールおよび治験責任医師の選択、選択的近親交配によって生成される強力な新しいラット実験的モデルを含むと新開発の遺伝の実験グループを含む研究を用いることができます。エンジニア リング技術。
テレビ顕微鏡アプローチの精度のおかげで準備 ● キャニュレイテッド動脈径変化の測定は、血管の内皮依存性および内皮非依存性のメカニズムに関する非常に貴重な情報を提供できます。リラクゼーションだけでなく、高血圧、塩分の高い食事やその他の実験的介入で発生している血管の制御機構に重要である (および時々 予期しない) 変更。さらに、圧径関係の測定が分離し、Ca2 +との処置で最大限にリラックスして抵抗血管を cannulated-無料のソリューションまたは薬理学的血管拡張薬、評価を使用できます動脈血管リモデリングにより、動脈機能に影響を与えることができます動脈の受動的な機械的性質の変化の重要な洞察を提供することができる受動的な応力-ひずみ関係7を計算するための構造変化アクティブな制御機構の独立の (またはに加えて) を変更します。また、分離抵抗血管の研究から得た情報をことができます LDF、個体レベルの8,9 組織灌流の評価のための実用的な方法を利用した得られた情報によって補われることに注意してくださいすることが重要です。 ,10GS1 の蛍光標識レクチンを用いた微小血管密度の評価から得た情報によっては、具体的には、小細動脈と毛細血管の11の基底膜の糖鎖に結合して,12します後者のメソッドは、船生体内で、たとえば非灌流を数えることで微小血管密度の推定に古典的な困難を受けにくい微小血管密度の非常に正確な見積もりを提供します。血管の細動脈のアクティブな閉鎖のための血流の停止場所。これらのアプローチが分離抵抗動脈微小循環レベルでの組織の血流の変化に与える機能的変化を関連付けるための重要な洞察力を提供できる一緒に使用する場合● キャニュレイテッド動脈技術と組み合わせてこれらの貴重なアプローチの使用のいくつかの例は、本稿も提供されます。
本稿はザイモグラムの Sprague-dawley ラットの動脈の血管の変化を評価するビデオ顕微鏡検査の技術の使用に焦点を当てください。ただし、これらのテクニックが非常に貴重な品種改良や遺伝子技術を使用して、編集によって作成された専門性の高い遺伝子組み換えラット系統の表現型の変化を解明する証明されていることに注意してくださいすることが重要です。本稿では、どのようにビデオ顕微鏡検査の技術の例は最も広くダール食塩感受性 (SS) ラットの近交系ラットの歪みを含むモデル数貴重なラットの血管機能に関する重要な情報を提供しているを提供します。塩の機密 hypertenson18,19,20,21,22,23; のメカニズムを研究するのに実験モデルを使用塩を区別しないブラウン ノルウェー (BN) ラット系統 SS ラットの選択的な育成によって作成されるコンソミック ラット。コンソミック ラット パネルでブラウンのドブネズミからすべての染色体は、ダール SS24,25,26遺伝的背景に個別に交雑をされています。コンソミック ラット パネルの使用は、血圧と血管反応性24,25,26 を含む他の表現型の塩の感受性に貢献する特定の染色体に関する貴重な手がかりを提供しています。 ,,2728。
SS ラットおよび個々 の BN の染色体を運ぶコンソミック ラットを用いた選択的な繁殖戦略もダール SS 遺伝的に個々 のブラウン ノルウェー染色体交雑の小さなセグメント狭窄コンジェニック系統の世代を有効にしています。背景22,29。これらは、非常に貴重な入力の特定の遺伝子を提供したり、血圧、腎障害、血管反応性22,29などの重要な生理学的変数に影響を与えることができる染色体の地域を絞り込みます。ラットの遺伝ツールボックスに別の強力な追加、編集テクニック ZFNs、転写活性化ようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENS) を含む高度な遺伝子を利用したラット遺伝子ノックアウト モデルの開発と最近 CRISPR Cas913 ,14,15,16,17。ラットをノックアウトする遺伝子を有効にこれらの強力な技術の出現は非常に重要な開発、遺伝子ノックアウト研究 (および使用し続ける) マウスを使用しているためほとんど専ら。本論文では実験的なコンポーネント別 ● キャニュレイテッド動脈技術とビデオ顕微鏡マスター抗酸化と細胞保護転写を欠けてノックアウト ラットの生理学的制御メカニズムを評価するための値を示します係数、核因子 (赤血球由来 2) - のような - 2 (NRF2)30,31, Sprague-dawley 遺伝的背景17TALEN 技術を使用して開発されました。NRF2 遺伝子の損失の機能検証を提供し、NRF2 を介した抗酸化物質の直接のアップレギュレーションに基づく可能性がある貴重な治療アプローチをテストに使用されたビデオ顕微鏡技術の in vitro実験、防御。NRF 2 は、ビタミン C や E32など抗酸化物質の直接投与を含む臨床試験の期待はずれの結果に照らして、人間の血管の酸化ストレスを闘う相当な治療の重要性の。

<table><tbody><tr><td>ウィスコンシン</td>州の<td>SSラット</td>医科大学<td>SS / JHs / Mcwi株</td><td>連絡先博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.5BN</td><td>ウィスコンシン</td>州のコンソミックラット医科大学<td>SS-Chr 5BN/Mcwi株</td><td>お問い合わせ博士アロンGeurts博士(ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.13BNウィスコンシン州のコンソミックラット</td><td>医科大学</td><td>SS-Chr 13BN/Mcwi株</td><td>お問い合わせDr.アロンGeurts(ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-BNウィ</td><td>スコンシンSSの</td>コンジェニックラット医科大学<td>。BN-(D13HMGC41-D13)hmgc23 / Mcwi株</td><td>連絡先博士Aron Geurts(ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSAウィ</td><td>スコンシンSSの</td>コンジェニックラット医科大学<td>。BN-(D13RAT77-D13RAT105 / MCWI株</td><td>連絡先博士アロンGeurts(ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>REN1-SSBウィ</td><td>スコンシンSSの</td>コンジェニックラット医科大学<td>。BN-(D13RAT124-D13RAT101/Mcwi株</td><td>連絡先博士アロンGeurts（ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2（-/-)ノックアウトラットと野生型同腹仔ウィ</td><td>スコンシン医科大学</td><td>SD-Nfe212em1Mcwi株</td><td>連絡先博士Aron Geurts（ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>低塩ラットチョウ）(0.4%NaCl)-AIN-76A</td><td>デエッツ株式会社</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>高塩ラットチョウ(4%NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>113756 コロラドビデオキャリパー</td><td>コロラドビデオ株式会社</td><td>モデル308</td><td></td></tr>ビデオ<tr><td>カメラ</td><td>日立</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>テレビモニター</td><td>パナソニック</td><td>WVBM1410</td><td></td></tr><tr><td>圧力トランスデューサー</td><td>ストールティング</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>血圧表示ユニット</td><td>ストールティング</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>カニューレ付き動脈チャンバー</td><td>リビングシステム計装</td><td>CH-1</td><td>一般用シングルチャンバー</td></tr>チャンバー <tr><td>シングルチャンバー用温度調節器</td><td>リビングシステム計装</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>ガス分散管、ミニチュア、ストレート</td><td>リビングシステム計装</td><td>GD-MS</td><td>容器バス内の曝気を提供</td></tr><tr><td>ガス交換酸素供給器、ミニチュア</td><td>リビングシステム計装</td><td>OX</td><td>灌流水とのガス交換が可能</td></tr><tr><td>レーザードップラー流量計</td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 Lectin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット用ガラスキャピラリーチューブ</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td><td>2 mm ODX1 mm</td></tr><tr><td>ID垂直ピペットプーラー</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 700C</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン縫合材料 (10/0)-3 PLY</td><td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td><td>114-ANM-10</td><td>血管で使用するためにからかわれた 3 層ナイロン縫合糸の 1 本鎖</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps-Inox</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>プロタンディム</td><td>プロタンディム</td><td></td><td>NRF2 インデューサー: ジョー・マッコード博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP358-212</td> にお問い合わせください。<td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td><td>S233-3</td><td></td></tr>デ<tr><td>キストロース(d-グルコース)無水フィ</td><td>ッシャーケミカル</td><td>D16-500</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>マグネシウム(MgSO4-7H2O)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2-2 H2O)</td><td>シグマ</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム-一塩基性(NaH2PO4)</td><td>シグマ</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA)</td><td>シグマ</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

このプロトコルの分離脳抵抗動脈 (と他の船舶) の血管機能を評価するための in vitroテレビ顕微鏡の使い方について説明し、レーザー ドップラー血流計 (LDF を使用して組織の血流を評価するための手法について説明します) と蛍光を用いた微小血管密度グリフォニア simplicifolia (GS1) レクチンをラベル付けします。現在の勉強方法貫圧力発生体内抵抗血管を分離、実質細胞の影響のない状態で生体内での研究と分子から得られる情報との間の重要なリンクを提供個体レベルでの統合的な応答に限られた洞察力を提供する還元主義的アプローチ。LDF とテクニックは、GS1 の蛍光標識レクチンと細動脈と毛細血管を選択的に識別するためには、分離抵抗血管の研究から得られた知識を拡張する捜査官を可能にする実用的なソリューションを提供します。本稿血管生理学一般実験モデルとしてラットの病理学の基礎的知識を得るためにこれらの技術の応用と専門の様々 な提供することができます「デザイナー」ラット系統遺伝子組み換え特定の遺伝子が重要な血管表現型に与える影響の重要な洞察力。ノックアウト マウス モデルで開発した科学的前提の厳しさを拡大する選択的な繁殖戦略と、ラットの遺伝子ノックアウト モデルを生産するための新しい技術によって開発されたラット系統でこれらの貴重な実験的アプローチを活用し、人の知識をよく理解の生理学的背景とサイズが大きいため生体への適合性、関連性の高い動物モデルを拡張します。

● キャニュレイテッド抵抗血管の培養顕微鏡は、小さな抵抗動脈 (および大きい細動脈) のアクティブなトーンに影響を及ぼす要因の検討経壁圧正常生体内で実質細胞の不在影響します。種々 の血管拡張薬と血管収縮薬の刺激に血管と通常 PSS、Ca2 +の経壁圧上昇に対する筋の反応性を評価するとともに-無料 PSS を出納し、superfusate の終わりに追加できます最大容器の径や壁の厚さを決定する実験。後者の測定が血管の改造は、すなわち血圧や薬理学的エージェントの管理の変更への応答で発生する壁/ルーメン比の変化を評価する上で非常に貴重です。Ca2 +で最大限に拡張した血管径の計測-無料 PSS が 100、x ((D最大の -D の残り)/Dmax) として本質的なトーンを計算する便利な Dmaxと D残りが最大 (Ca2 +-PSS を無料) 制御の...

本稿では、ラット脳の抵抗血管での血管の機能を評価するためのビデオ顕微鏡検査のプロトコル体外について説明します。原稿もレーザー レーザードップラー血流計を用いた蛍光に分類されたレクチンと組織潅流と微小血管密度を評価するための手法を説明します。

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

本手順の目的は、単離した抵抗動脈を用いて、血管作動性刺激に対する血管反応性を検証することです。また、平滑筋の制御メカニズムおよび受動的機械的特性の変化を評価する方法についても示します。この手法は、さまざまな条件下における小型抵抗動脈の内皮および血管平滑筋の制御メカニズムに関する、血管生物学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の最大の利点は、小抵抗動脈を実質細胞環境から単離し、通常の圧力を維持したまま血管活性刺激に対する反応を検証できることです。この手法の意味するところは、血管機能不全の治療および診断にまで及びます。このような操作をin vivoで行うことは不可能です。この手法は末梢血管疾患に関する知見を得るために利用できますが、冠動脈疾患にも適用可能です。この手順は非常に繊細であり、動脈への損傷を避ける必要があるため、マイクロカニュレーションのステップを習得するのは困難であり、視覚的な実演が極めて重要となります。実験当日、2リットルのエルレンマイヤーフラスコに2 Lの生理食塩水を準備します。20Xバッファーストックを添加する際は、溶液がガス混合気と常に平衡状態にあり、マグネチックスターラーで攪拌されていることを確認してください。次に、0.28gのリン酸一ナトリウムを混合液に添加しながら、pHを監視します。必要に応じて、パステールピペットを用いて6N塩酸または6.5N水酸化ナトリウム溶液を滴下し、pHを7.4に維持するように調整してください。次に、生理食塩水に1.98 gramsのグルコースを加えます。続いて、20Xストック溶液を脱イオン水で希釈し、カルシウムフリー生理食塩水を500 milliliters調製します。その後、エルレンマイヤーフラスコに20Xバッファストックを25 milliliters加え、溶液のpHを監視および調整しながら、0.07 gramsのリン酸一ナトリウムを溶液に加えます。テトラフルオロエチレンチューブを使用して、適切な混合ガスを含むガスタンクを器官浴に接続します。容器チャンバーに流入する溶液に、乱流にならない程度に連続的なバブリングが行われる十分な速度で、溶液にガスを絶えず通します。また、生理食塩水のガス組成を維持するため、平衡化用混合ガスに接続した小型のエアストーンを容器チャンバー内に設置します。生理食塩液を2リットルのマリオット瓶に入れます。ストッパーに中央ガラス管を取り付け、血管チャンバーに溶液を供給する薬理学的臓器浴へ生理食塩液を連続的に送り出すリザーバーとして機能させます。マリオット瓶内にある中央ガラス管の開口部を、臓器浴内の生理食塩液の液面と同じ高さに配置します。これにより、器官浴への生理食塩水の供給において、一定の静水圧ヘッドを確保できます。マリオット瓶から器官浴へ生理食塩液を供給するために、J字型ガラ

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Medicine

医学

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Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

このプロトコルは、マウスから単離された腸間膜動脈の貫壁性等角張力を評価するためのワイヤ myography...

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本プロトコールは、ラット冠状動脈の血管反応性を測定するためのワイヤー筋電計技術を記載する。...

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