Name: インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 学ぶインフルエンザ血球凝集素抗体によるFc介在エフェクター機能の評価法。HEK293細胞を用いたADCCアッセイで、24時間以内に抗体効能を測定し、ワクチン開発や免疫学研究に貢献します。

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このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 P01AI097092 04S1 (P.E.L.)。

本稿では前もって形成された実験は次 Icahn の医学の倫理と法規制の機関コードを行われました。
1. トランスフェクションや感染によるインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンの式
トランスフェクション:
<ol><li>2 x 10 の4細胞/ウェルの白い組織培養の密度で人間の萌芽期の腎臓 (HEK 293 t) 細胞は、96 ウェル プレートを扱われ、4 h (5% CO2) と 37 °C の定温器に座らせています。</li>
	<li>100 セルを transfect ウイルス血球凝集素とトランスフェクション試薬 50 μ L の総ボリュームの井戸あたりの 0.2 μ L の DNA のコーディングの ng。 注: 両方 Opti 最低不可欠なメディア (MEM) 減少血清中 × 1 でプラスミドと形質転換試薬が希釈されています。</li>
	<li>18 h の 5% CO2と 37 °C のインキュベーターでプレートをインキュベート後トランスフェクション メディアを削除します。</li>
</ol>2. 感染症
<ol><li>2 x 10 の4細胞/ウェルの白い組織培養の密度でプレート A549 またはマディン ダービーの犬の腎臓細胞は 96 ウェル プレートを扱われ、少なくとも 18 h 5% CO2と 37 °C の定温器のための成長します。</li>
	<li>1 希薄ウイルス MEM × 3、1、または 5% CO2と 37 °C の定温器で 1 時間 0.33 の感染症の多様性で細胞に感染します。容量は 100 μ L に等しくなります。 注: 10 x MEM は上記ウイルスの希釈の MEM 在庫 × 1 を作るために水で希釈しました。</li>
	<li>感染後接種を削除し、1 の 100 μ L を追加 MEM トリプシンの不在でプレートに x。</li>
	<li>5% CO2と 37 °C の定温器で 18 に 24 h の感染細胞を成長します。</li>
</ol>3. FcRg/NFAT を介した活性化モノクローナル抗体や血清によるルシフェラーゼ活性の評価
<ol><li>まず、アッセイ メディア (1 x RPMI 1640 4% (巻/巻) を添加した低 IgG 胎仔ウシ血清) の 25 μ L でトランスフェクトまたは感染した細胞の成長媒体を交換してください。</li>
	<li>別の 96 ウェル プレートで 30 μ g/mL アッセイのメディアを使用して始まる興味の抗体の 4 倍希釈液を実行します。トリプリケートで希釈を行い、プレート レイアウトの例は、図 1 aに示されています。バック グラウンド コントロール (アッセイバッファーだけ) だけでなく、抗体 (抗体コントロールなし) を含まないコントロールを含めるを確認します。 注: 両方、'ない抗体' のコントロールの背景、抗体ではなくアッセイバッファーの 25 μ L を追加。</li>
	<li>ステップ 3.2 から transfected セルまたは感染細胞プレート上の対応する井戸に希釈した抗体の 25 μ L を転送します。</li>
	<li>プレート 15 分 (5% CO2) と 37 °C のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>マウスの FcgRIV または人間 FcgRIIIa (細胞/ウェルの 75,000) を表現する適切な変更されたエフェクター Jurkat 細胞の 25 μ L を追加します。それぞれの総体積はまあ必要があります 75 μ L と抗体の開始の最終濃度は 10 μ G/ml (図 1 b)。 注: バック グラウンド コントロール エフェクター細胞の代わりにアッセイバッファーの 25 μ L を追加します。抗体依存性細胞媒介性細胞貪食を考察し、人間の FcgRIIa を表現する変更された Jurkat 細胞を使用できます。</li>
	<li>プレート 6 時間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>雪解けと暖かいルシフェラーゼ基質液を 37 °C の水のご使用前に約 1 時間で。 注: ルシフェラーゼ基板バッファーを作る提供するアッセイバッファー中凍結乾燥ルシフェラーゼ アッセイ基板を再構築します。再構成された基板バッファーは、最大 6 週間までの-30 °C-10 °C に格納できます。</li>
	<li>バック グラウンド コントロールを除くすべての井戸に 75 μ L/ウェル ルシフェラーゼ基板バッファーを追加します。</li>
	<li>ルミノに読まれます。</li>
	<li>次の方程式で倍誘導を計算: 誘導を折る = (誘導値バック グラウンド値)/(mAb 値バック グラウンド値なし)。</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScienceDirectAntibody-dependent+cellular+cytotoxicity+and+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus.</a> Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).</li>
<li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Dominant+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity+Epitopes+on+the+Hemagglutinin+Antigen+of+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus.</a> J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
<li>Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+activation+of+Fc-mediated+effector+functions+by+influenza+virus+hemagglutinin+antibodies+requires+two+points+of+contact%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact.</a> PNAS. , 201613225(2016).</li>
<li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li>
<li>Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-neutralization+of+influenza+A+viruses+mediated+by+a+single+antibody+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop.</a> Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
<li>de Vries, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus-specific+antibody+dependent+cellular+cytoxicity+induced+by+vaccination+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection.</a> Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで説明した方法では、マウス FcγRIV を従事する特定の HA 抗体の能力を測定することができます。ターゲット抗原、インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンは、細胞の表面に感染後ウイルスやプラスミド DNA トランスフェクションによって表されます。試金はさらに他の FcγRs (人間またはマウス) との組み合わせで異なる表面表現のウイルス蛋白質を使用してに従うです。さらに、我々 使用している血清サンプル Fc エフェクター機能 (データは示されていない) を誘発する抗体ポリクローナルのコンテキストでの能力を評価する感染による適応免疫応答を勉強するときより関連性の高い情報を提供する可能性がありますまたは予防接種。我々 はまた、可溶性タンパク質でプレートを直接コーティングすることにより内部のウイルス蛋白質を認識する抗体の誘導を測定するアッセイを変更できることを推測します。ただし、この方法論は厳しくテストされていません。
抗体依存性エフェクター分子として機能の誘導できますを含むいくつかの要因によって影響を受けるが目標比率をエフェクターに限らず (ウェルあたり追加エフェクター細胞数)...

季節性インフルエンザ ワクチンによる免疫が伝統的赤血球凝集抑制 (HI) 試験1ヘマグルチニンの受容体結合部位を対象とする抗体の存在を測定するによって評価されました。これらアクティブ HI 抗体殺菌免疫を与えることができるが、一般に選択数株のインフルエンザ ウイルスのみに耐性を提供する保護の彼らの幅狭い。分離とヘマグルチニン (HA) を認識するモノクローナル抗体が広く反応の万能インフルエンザ ワクチンの開発に、届く2,3,4,を提案します。5,6,7,8. インフルエンザ ウイルス9,10、11,12の保存領域に向かって強い抗体応答を誘導する万能インフルエンザ ワクチンの主要な目的の 1 つです,13,14,15,16. 広く中和と非中和抗体17,18, から成り、これらの保存されたエピトープを認識反応性抗体が Fc FcγR 相互作用を要求する示されている最適な生体内で保護しインフルエンザ ウイルス19,20全体的な免疫応答に Fc 免疫の貢献をハイライトします。
保護の相関は感染への耐性を評価する上で重要であります。これらのメトリックは、ワクチンの有効性、データの意義と治療の過程を推定するためには、科学者や臨床医に許可します。インフルエンザ ウイルス感染症に対する保護の唯一の確立された相関は赤血球凝集抑制法です。1:40 の力価は病気1,21 -のリスクが 50% 削減に関連付けられて、結合部位 HA の球状の頭の上にある受容体をターゲットによって凝集を阻害する抗体の存在を反映します。しかし、T 細胞応答を高齢者におけるインフルエンザ ウイルス感染に対する保護のより良く関連付けることに注意もする必要があります。興味深いことに、最近の報告書では、ノイラミニダーゼ阻害作用をインフルエンザ22への耐性をより良く予測される示唆しています。幸いにも、一般的な体外中和やノイラミニダーゼ阻害アッセイは、HA 茎やノイラミニダーゼ特異的抗体を測定できるよう試金します。しかし、これら従来の in vitroアッセイのほとんどは、のみ、抗体の抗原結合の領域の機能を考慮、Fc 領域の役割を測定しません。さらに、Fc 受容体の関与体内を介して保護非中和抗体の貢献は検出された17,18ではありません。抗体依存細胞性細胞傷害 (ADCC) など Fc 免疫を誘導する抗体によって与えられる保護を測定するために堅牢なの in vitroアッセイが必要です。
下記の方法は、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞ラインを使用して Fc 仲介機能を誘発するモノクローナル抗体の作製の能力を評価するマウス入力 1 FcR、FcγRIV。FcγR の抗体の関与は、細胞内シグナル伝達活性化 T 細胞を介したルシフェラーゼ活性のあるそのトリガーの核因子ペリプラズムします。アッセイ分離と主なエフェクター細胞の培養と Fc を介したエフェクター機能19,23,24 の活性化を検出するためのフローサイトメトリーの使用を必要とする従来の技法上のいくつかの利点があります。 ,25,26。最初に、ここで説明されているプロトコルは簡単にウイルスの異なるターゲット、FcγRs、および異なる種 (人間およびマウス) から抗体を組み込むに適応できます。第二に、変更された Jurkat 細胞の使用ラインによる発光測定プレート リーダーを使用して容易に分析することができます大規模な形式の試金のため核因子活性化 T 細胞 (NFAT) の下で、ルシフェラーゼ遺伝子を持つ FcγR により表現します。ここでは、主なエフェクター細胞の伝統的な活性化は、Jurkat 細胞の表面に FcγR の抗体婚約時 NFAT ルシフェラーゼの誘導に置き換えられます。この 96 ウェル プレート形式の試金 7 希釈-伝統的な技術を使用して面倒なことができるサンプル数でトリプリケートで最大 4 つの異なる試料の測定が可能です。実験の設計、データの解釈に影響を与える可能性がありますこのアッセイで考慮する点があります。ウイルスのターゲットは、抗体の認識のための順序で細胞表層に発現する必要があります。これを緩和するには、ターゲット抗原 (例えば内部のウイルス蛋白質) は、プレートの表面に直接コーティングがあります。しかし、これはまだテストされていません厳密。また、変更された Jurkat 細胞株 FcγR を活性化の 1 種類のみを表現、主細胞生理学的なコンテキストですべての受容体に表現の抑制の FcγRs を表現していません。
我々 は以前ポリクローナル コンテキストのエピトープ特異性が Fc を介したエフェクターの機能の調節に重要な役割を果たしていること、抗体依存性細胞媒介性応答の最適な活性化がの 2 つの点を必要とすることを示すためこの試金を使用しています。27,28にお問い合わせください。ここでは、従事し FcγRIV をアクティブにするマウスを有効に茎特異的モノクローナル抗体の能力を評価する手法について述べる。例外29,30が広く反応性抗体の数が多いヘマグルチニンの抗原に保存された茎地域をターゲットし、従って普遍的なインフルエンザの発展に重要な役割を果たすワクチン。

<table><tbody><tr><td>A549細胞&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞</td></tr><tr><td>HEK 293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>ヒト胚性腎臓細胞</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>White tissue culture treated 96-well plate</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>アッセイプレート</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 細胞発現マウス FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>キットには、細胞、Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMI および低 IgG 血清</td></tr><tr><td>Jurkat 細胞を発現するヒト FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>キットには、細胞、Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMI および低 IgG 血清が含まれています</td></tr><tr><td>Jurkat細胞は、ヒトFcgRIIa</td><td>Promega</td><td>G9901</td><td>キットは、細胞、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMIおよび低IgG血清</td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1マルチモードリーダー</td><td>発光プレートリーダー</td></tr><tr><td>Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>ルシフェラーゼアッセイバッファーとルシフェラーゼアッセイ基質</td></tr><tr><td>Madin Darby犬の腎臓細胞</td><td>が含まれていますATCC</td><td>CCL-34</td><td>イヌ腎臓細胞</td></tr></tbody></table>

インフルエンザ血球凝集素抗体による fc を介したエフェクター機能を評価する方法

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

抗体は結合の抗原結合ドメインと Fc 領域を介してウイルスの病原体に対する自然免疫と適応免疫応答に重要な役割を再生します。ここでは、活性化を測定する方法について述べる Fc のモノクローナル抗体、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞株を用いるインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンをターゲットによるエフェクター機能入力 1 Fc-FcγR このメソッドを使用して、。免疫グロブリンによって与えられた特定の Fc FcγR 相互作用の寄与は、生体外の試金を使用して決定できます。

実証した茎固有 mAb、6F12 がないヘッド固有の頭固有 mAb、PY102、骨折 CD107a とインターフェロン γ19主のナチュラル キラー細胞をアクティブにすることができた。茎固有 mAb、6F12、できます確実によってマウスの FcγRIV を表現する変更された Jurkat 細胞を活性化することを示すヒト NK 細胞を作動する茎特異抗体の機能をモデル化する 〜 14-fold。その一方で、ヘッド固有 mAb、PY102、コントロール IgG ありません (図 2)28を行います。
調べるため感染症 (MOI) の多様性はマウスの FcγRIV を発現する Jurkat 細胞の誘導に影響を与える場合、私たち感染 MDCK 細胞 X31 (リアソータント インフルエンザ A ウイルス ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの年香港/1/68 (H3N2) を表現すると内部セグメントの A/Puerto リコ/8/34 (H1...

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc 免疫を誘導するモノクローナル抗体やポリクローナル血清の他のウイルスの表面糖蛋白質をターゲットの能力を評価するために合わせることができます。

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

このプロトコルの全体的な目的は、抗体または血清サンプルがFc介在性エフェクター機能を活性化させる能力を評価することです。この手法は、抗体依存性Fc介在性免疫の活性化を測定することにより、免疫学およびワクチン学の分野における重要な課題を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、材料の準備からデータ解析までを24時間以内に完了できることです。この手順の実演を行うのは、Peter Paleseの研究室の大学院生、Mark Baileyです。トランスフェクションによりインフルエンザウイルスのヘマグルチニン発現を誘導するため、まずヒト胎児性腎臓293細胞を、組織培養処理済みの白色96ウェルプレートに 2×10⁴ cells/well の濃度で播種します。37°C、5% CO2 下で4時間後、ウイルスヘマグルチニンをコードするDNA 100 ngとトランスフェクション試薬 0.2 µLを、1X optimum-reduced serum medium 合計 50 µL の容量で、各ウェルの細胞にトランスフェクトします。各ウェルにDNAリポソーム複合体を添加してトランスフェクションを行い、プレートをインキュベーターに戻してさらに18時間培養します。感染によってインフルエンザウイルスのヘマグルチニン発現を誘導するには、A549細胞を、白色の組織培養処理済み96ウェルプレートに2×10⁴ cells/wellの濃度で播種し、37°C、5% CO2条件下で少なくとも18時間インキュベートします。インキュベーション終了後、インフルエンザウイルスを感染多重度3になるように1X MEM培地100 µL/wellで希釈し、A549細胞を細胞培養インキュベーター内で1時間感染させます。インキュベーション終了後、接種物をウイルスを含まない新鮮な1X MEM培地 100 µLに交換し、細胞をさらに18〜24時間インキュベーターに戻します。目的の特異的抗体がヘマグルチニン発現細胞を標的にする能力を評価するため、ウイルス感染させた細胞培養液の上清を、25 µLの抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ADCC）アッセイ培地に交換します。次に、別の96ウェルプレートを用いて、概略図に従い、背景コントロールおよび抗体なしコントロールを含めるように注意しながら、新鮮なADCC培地中で目的の抗体を 10 µg/mLから開始して3回ずつ4段階の全希釈を行います。抗体をすべて希釈した後、希釈した抗体25 µLを実験用細胞プレートの対応する各ウェルに分注し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。15分後、適切なFc受容体を発現する改変エフェクターJurkat細胞 7.5 × 10⁴個を25 µLのADCC培地で調製し、各ウェルに加えて、最終液量をウェルあたり75 µLのADCC培地とします。プレートを細胞培養インキュベーターに戻して6時間培養し、培養の最後の1時間にルシフェラーゼ基質緩衝液を37 °Cのウォーターバスで解凍します。バッファーの準備ができたら、バックグラウンドコントロールウェルを除くすべてのウェルにルシフェラーゼ基質バッファーを75 µLずつ加え、ルミノメーターでプレートを測定します。これにより、トランスフェクションまたは感染させた細胞培養における抗体依存性細胞傷害活性の誘導倍率を算出できます。本実験では、ストック特異的なモノクローナル抗体が、ヘッド特異的なモノクローナル抗体およびコントロールIgG抗体と比較して、マウスFc gamma受容体4を発現するJurkat細胞を約14倍強力に活性化および修飾しました。このビデオを視聴することで、特定の目的抗体がFc介在性免疫を活性化させる能力を評価するための実験セットアップ方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

シンプルなスロットブロット法は、バイオインフォマティクス解析によって同定された彼らの最も保存された配列を標的とする普遍的な抗体を用いてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量化のために開発されました。この革新的なアプローチは、すべてのウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量に有用な代替手段を提供することがあります。...

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

この方法は、高感度で感染マウスの気管支肺胞洗浄（BAL）液中のH1N1を検出するための赤外線染料ベースのイメージングシステムの使用方法について説明します。試験材料の&lt;10μlの体積を必要とし、複数の病原体の同時スクリーニングのための可能性を秘めている、または384ウェルプレート -...

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

このビデオは、特定の抗原に対する血清抗体を検出するための赤血球凝集阻害アッセイを示しています。テストウェルでの赤血球凝集阻害とコントロールウェルでの赤血球凝集の確認は、明確な視覚パターンによって達成されます。このアッセイは、免疫応答、ワクチンの有効性を評価し、ウイルス学および免疫学におけるウイルス感染の研究において重要な役割を果たします。...

標的抗原に対する血清抗体を検出するためのヘマググルチン化阻害アッセイ

このビデオでは、T細胞エフェクター機能の抗体を介した活性化を測定するアッセイを実演しています。HAを発現するトランスフェクションされた哺乳動物細胞にインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)特異的モノクローナル抗体を添加すると、HAとの免疫複合体が形成されます。Fc受容体を発現する遺伝子操作T細胞とルシフェラーゼレポーターを導入すると、T細胞は抗体-HA複合体によって活性化され、この活性化はルシフェラーゼ基質を添加して産生された生物発光を測定することによって検出されます。...

HA抗体によるFc媒介エフェクター機能の活性化の測定

このビデオは、血清サンプル中のインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)阻害抗体価を測定するアッセイを示しています。NAに対する抗体を含む血清サンプルをフェチュイン被覆マイクロウェルプレートに加えます。ウイルスを添加すると、抗体はウイルスNAがフェチュインを切断してガラクトース部分を露出するのを防ぎます。次に、ペルオキシダーゼ結合レクチンを添加し、露出したガラクトースに結合します。NA阻害抗体価は、ペルオキシダーゼ基質が固定化されたレクチン結合ペルオキシダーゼによって切断されて発色する比色試験を用いて決定されます。...

インフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価測定法

印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。...

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

血清中のインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)阻害抗体価を測定するための酵素結合レクチンアッセイ(ELLA)について説明します。このアッセイでは、ピーナッツ凝集素を使用して、フェチュインコーティングされた96ウェルプレートからNAがシアル酸を除去したときにアクセス可能になるガラクトース残基を定量します。...

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

示されたプロトコルでは、インフルエンザ ワクチン接種者の血清サンプルからインフルエンザ特異抗体価を定量化する赤血球凝集抑制法を実行する方法について説明します。最初のアッセイは、凝集によって最適なウイルス抗原濃度を決定します。2 番目の分析は,...

インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV...

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

我々は、異なるウイルス株から250以上の抗原に対して複数の抗体アイソタイプの血清を同時にプローブするために、ニトロセルロースコーティングされたスライドにインフルエンザ抗原を印刷することによって構築されたタンパク質マイクロアレイを使用するためのプロトコルを提示し、したがって、ウイルスサブタイプ間の血清抗体の幅の測定を可能にする。...

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC...

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

学ぶインフルエンザ血球凝集素抗体によるFc介在エフェクター機能の評価法。HEK293細胞を用いたADCCアッセイで、24時間以内に抗体効能を測定し、ワクチン開発や免疫学研究に貢献します。

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

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