Name: In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶデュオカラー2光子イメージング法による脊髄損傷後の血管動態変化のリアルタイム観察。Sprague-Dawleyラットを用いて損傷後の血管径変化と血流動態を定量化し、早期血管修復を目指す神経保護戦略の評価に応用可能です。

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この作品は、NIH の NS059622、NS073636、W81XWH 12-1 0562 国防総省 CDMRP、米国退役軍人局やクレイグ ・ H Neilsen 財団 296749、インディアナ州脊髄脳損傷研究財団 (からメリット レビュー賞 I01 BX002356 部分で支えられましたISCBIRF) インディアナ州保健省 (019919) のマリ ・ ハルマン ・ ジョージ基金の資金。

すべての手術と動物の取り扱い手順を行ったガイドの下世話と実験動物の使用 (国立研究評議会)、インディアナ大学学校の医学機関動物ケアと使用のガイドラインを承認しました。委員会。
1. 手術の準備
<ol>
	<li>背骨の安定剤を含むすべての手術器具を滅菌します。手術台と 70% エタノールを持つすべての周辺をきれい。非生存の手術の準備、37 ° C の加熱パッドの上にきれいな手術パッドを配置します。</li>
	<li>この研究のための 6 週齢の SD) ラットを使用します。重さし、ケタミン (87.7 mg/kg) とキシラジン (12.3 mg/kg) 混合物の腹腔内注入ラットを麻酔します。つま先ピンチ刺激に応答する動物を停止すると、麻酔の適切な段階を確認します。皮下注入 0.01 0.05 mg/kg ブプレノルフィンと手術前にカルプロフェンを 5 mg/kg。</li>
	<li>2 つのエリアでネズミを剃る: 背中と胸側に頸部領域に頚椎領域。手術時手洗い法 betadine と 70% アルコール綿で皮膚を綿棒します。手術中にドライアイを防ぐために眼軟膏を適用します。きれいな手術台の上に仰臥位に動物を配置します。</li>
</ol>
2. 外頚静脈カテーテル検査
<ol>
	<li>鎖骨近くのパルス ポイントを見つけることによって外頚静脈を見つけて、3 解剖学的ポイントのクロス ポイントであるスポットに縦切開をする小さな春はさみでカット: より大きい結節右側下顎部の尾側枝上腕骨と胸骨柄 (図 1 a)。春のはさみと微細鉗子を使用して船を分離します。1 生殖不能の外科縫合線 (図 1)20遠位端を結ぶ。</li>
	<li>生理食塩水で満たされ、21 g 針 (図 1 b) から作られた特殊なカテーテルを接続して 1 つの 1 mL シリンジを準備します。マイクロはさみのペアを使用して容器の小切開を行い、血管にカテーテルをスライドします。<ol>
		<li>両方近位および遠位終わり (図 1) を結ぶことによって針を固定します。特殊なカテーテルは、21 g 針から作られます。フラットの先端を挽くし、別の 21 g 針から切り離されて先端の 2 mm の部分を溶接します。これは外滑りからカテーテルを防ぐことができます。 
		注:針に流入する血液の量が少ないでは、針が血管を正常に入力されていることを示します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脊椎の安定化と C5 ・ C7 椎弓切除術
<ol>
	<li>腹臥位で動物を配置します。15 番のメス刃で目的の脊髄レベルで正中線に沿って皮膚を切った7番目の頚椎外側面 (図 2 a)21を公開する二国間 (C5 C7) に 5thからの筋層を解剖します。 
	注:肩甲骨の間スパイクを見つけることによって第 2 胸椎 (T2) を探します。T2 椎骨の C7 椎21,22,23,24を見つけるから、カウントします。</li>
	<li>変更された安定化装置を用いてラットの脊椎を安定させます。横の椎体骨の両側に切り込みを入れます。露出の横断プロセスの面の下にステンレス製アームをスライドさせ、安定性 (図 2 b) に固定するネジを締めます。</li>
	<li>C5 ・ C7 ラミナ (椎弓切除術、図 2) を慎重に取り外します。</li>
	<li>保湿成分 (図 2 D) 露出された硬膜の上に食塩水に浸した歳男の小片を置きます。</li>
</ol>
4. 2 光子 (2 P) 画像ウィンドウのインストール
<ol>
	<li>筋肉と脊椎骨の間のギャップに弁の原料小片も脊髄と脊椎骨の間の弁の細い線のものし、筋肉骨周辺を密封する組織接着剤を使用します。完全な乾燥 (図 2 e) のための 5 分を待ちます。 
	注:この手順は効果的にウィンドウと浸漬溶液の水漏れしたために将来の出血を防ぎます。</li>
	<li>DdH2電子レンジ O 4% 寒天培地を準備します。寒天が完全に解散した後は、触れることができる温度に戻るまでを待ちます。寒天液を 1 mL 滅菌注射器を入力し、(図 2 e) 壁を構築するウィンドウの端にパイプします。ソリューションはすぐに凝固し、レンズまたは目的を自由に移動できるようにする柔軟なままになります。</li>
	<li>画像の準備ができたら、2 P (図 2 f) をイメージングのウィンドウ内弁と場所の浸漬液を削除します。2 光子励起顕微鏡暗い室内安定した動物を転送し、レンズ直下 2 P 画像ウィンドウを配置します。画像ウィンドウに慎重にレンズを下げます。</li>
</ol>
5. 最初の蛍光染料とベースライン イメージングの注入
<ol>
	<li>ローダミン B イソチオ シアン酸デキストランの 0.5 ml (4 mg/mL 平均分子量 〜 70 kda) 生理食塩水で。ソリューションを 1 mL 滅菌注射器を入力し、以前にインストールされたカテーテルに注射器を接続します。 
	注:使用をお勧めする前に、蛍光色素溶液を準備しています。</li>
	<li>非常にゆっくりと注射器を押すことによって最初の染料を注入 (図 3 b)。まず、関心のある領域を識別するために接眼レンズを使用します。電荷結合素子 (CCD) カメラを使用してランドマークのイメージとして低倍率で表面の血管パターンの明視野画像を取得します。レーザー スキャン モードに切り替えると、イメージング ソフトウェア両方の画像を収集するための 2 P を開き、ライン スキャン データ。</li>
	<li>イメージを作成して、組織で使用されている fluorophores が付いている一致するように適切な 2 P レーザー励起波長、パワー、および蛍光チャネル (最初の染料の赤チャネル) を選択し、(図 3E)生体内イメージングを行います。全体のプロセスの間に加熱パッドで動物を飼います。</li>
</ol>
6 リサ デバイスを用いた C7 霊長類損傷
<ol>
	<li>以前に確立されたプロトコル25,26によるとルイビルの負傷システム装置 (リサ) デバイスを使用して C7 正中線挫傷の傷害を実行します。<ol>
		<li>簡単に言えば、キャリブレーション リサ段階に動物を配置します。</li></ol></li></ol>ゼロ点設定を選択して、組織の調整後は、変位 (この場合 0.800 mm) は、インパクターのリリースをトリガーし、傷害を作成するソフトウェアの「実験の実行」ボタンをクリックしてします。
		<li>傷害の後に、それはしっとり保つために露出された硬膜の上に食塩水に浸した弁の別の小さい部分を配置します。</li>
	
	
	<li>4.3 のステップを繰り返し、以前に挿入した赤い染料で表示される同じ領域の生体内イメージングを再実行 (図 3 &#38; F)。</li>
	<li>手術台に裏では動物を転送し、IACUC IUSM プロトコルに従う適切な麻酔と鎮静動物を飼います。</li>

7. 第 2 蛍光色素と受傷後イメージングの注入
<ol>
	<li>フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストラン (4 mg/mL、平均分子量 〜 70 kDa) の 0.5 mL を生理食塩水の準備 5.1 と同じ。1 mL 滅菌注射器でソリューションを入力し、以前にインストールされたカテーテルに接続します。</li>
	<li>2 P 顕微鏡暗い室内安定化の動物の背部を転送し、同じ地域で最初の染料の赤のチャンネルや 2 番目の染料のための緑のチャネルを再イメージ (図 3 D &#38; G)。</li>
	<li>画像の最後に、脊柱安定化デバイスからラットを解放し、寒天の壁をきれい。</li>
</ol>
8. 動物の犠牲
<ol>
	<li>イメージング後、次の transcardial 潅流プロトコル27ラットを犠牲に。脊髄のサンプルを収集し、4% でそれらを修正 PFA。</li>
</ol>
9. オフライン データ解析: 血管の定量化
<ol>
	<li>オフライン解析用ワークステーションに画像ファイルを転送します。</li>
	<li>ImageJ を開くと「ファイル」を選択、以前 raw データの保存選択し、関連付けられている単一のイメージ ファイル (図 4 b) を開きます。</li>
	<li>「スケールを設定」(図 4) に続いて「分析」を選択して、画像を調整します。ピクセル単位での「距離」に指定された値は、図 4 aに表示されている数式を使用して計算されます。2 光子光レンズのキャリブレーションでは、式の既定値を決定します。"OpticalZoom"の値が Excel 拡張可能マークアップ Languagefile (XML ファイル) を単一のイメージ ファイル (図 4 b) に関連付けられているであります。</li>
	<li>容器の長軸に垂直な線を引く (図 41 &#38; E1)「測定」に続いて「分析」を選択。血管径の計測は、結果ウィンドウに表示されます (図 42 &#38; E2)。平均値を取得する容器の間で 3 回を繰り返します。</li>
</ol>
10. オフライン データ解析: 赤い血の定量化細胞 (赤血球) 速度
<ol>
	<li>ライン スキャン ファイルを分析のためワークステーションに転送します。</li>
	<li>ImageJ ソフトウェアを起動「ファイル」を選択、以前 raw データの保存選択し、拡張子名".ome"のすべての関連付けられた行スキャン ファイルを開きます。</li>
	<li>「イメージ」を開き、「スタック画像」に続いて「スタック」を選択します。すべての青梅ファイルを 1 つの画像のスタックの TIFF ファイルに変換します。</li>
	<li>Matlab ソフトウェアを起動して「開く」をクリックして、"LSPIV_parallel.m"コード ファイルを選択します。注意: LS PIV の Matlab コードは https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18でダウンロードできます。</li>
	<li>次の注文を選択:「実行」&#62;「フォルダーの変更」&#62;「動脈」。10.3で生成された画像スタック TIFF ファイルを選択します。</li>
	<li>"Y"を入力し、Enter キーを押します。</li>
	<li>それぞれ、イメージの左右にカーソルを置き、プログラムがデータの処理を開始します。</li>
	<li>プログラムの終わりには、最後の読み取りを計算する 2 つの値を入力してください:「pixel_meter 変換値」と「スキャン時の変換値」。両方は、ライン スキャン データに関連付けられている XML ファイルで見つけることができます。最終的な値は、平均とミリ (mm/秒) 単位での速度の標準偏差で表されます。</li>
</ol>

<ol><li>National Spinal Cord Injury Statistical Center. <a target="_blank" href="https://www.nscisc.uab.edu/Public/Facts%20and%20Figures%20-%202017.pdf">Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance.</a> SCI Data Sheet 2016. , (2016).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

伝統的な技法が死後サンプルの血管構造の変化に主に制限されたために、SCI に続く血管の研究課題の 1 つは技術的制限です。この新規生体内イメージング法の上記の血流と関連するパラメーター (速度と血管径) 生きているラットに 2 P LSM の使用動的測定が可能。 にします。次の霊長類科学異なる時点で血管の同じセットで繰り返し検査ができます。前の 2 光子励起顕微鏡イメージング技術で単一トレーサーガス漏水後外傷の血管構造をキャプチャできませんでした。私たちデュオ カラー デザインは、外傷性モデルの動的血管イメージングをできます。さらに、このメソッドの柔軟性は次の大血管の急性の変化の時空間的-プロファイルを生成する機会を提供します
私たちの生体内デュオ カラー イメージング法にいくつかの重要な手順があります。まず、タイムラプス イメージング、特に呼吸モーションアーチファクトを削減する前に脊髄の物理的な安定性を確保するための基本です。安定の中に少し脊髄脊椎の高さを高めるために脊髄のクランプの形状を考案しました。このように脊髄呼吸動物に相関の動きをすることができます (図 1-F、 2 b) を大幅に削減します。各撮像セッションの開始前に脊髄の安定性をチェックすることをお勧めします。脊髄は、安定性を達成するために失敗した場合、調整を配置および脊髄の圧迫をすべきであります。第二に、末梢の組織 (骨、筋層と皮膚) ビューの汚染を恐れ画像ウィンドウに出血します。滑らかな撮像セッションの弁およびティッシュの接着剤は効果的な予防のため周囲の組織に適用ください。第三に、我々 は選択蛍光染料メイン高分子量血漿蛋白質であるアルブミン (66 kDa) として同じようなサイズがあります。恒常性の条件の下で染料は主としてアルブミン28と同様の容器内保持されました。傷害の後染料は混乱の内皮構造を通過、血管 (図 3FG) の周辺で蛍光強度の大幅な増加を引き起こす、実質上に流出します。また、外頸静脈カテーテルの選択理由 2 つの理由があります。まず、実験のいつでも配送の一貫してアクセス ルートを提供できます。第二に、将来治療注射用ルートとして使用することができます。
本体内のデュオ色手法は外傷性血管イメージング研究の新規会場を提供することが、この手法に関するいくつかの注意事項が対処しなければなりません。現在、この手法は 2 時間ポイント (ベースライン、1 受傷後時点) での血管の変化を評価するために設計されていますが、追加蛍光染料とチャンネルが使用可能な場合、複数の時間ポイントに切り替えることは不可能です。外傷19,29,30後、同じ容器の基準情報を提供それらのどれもが慢性的な生体イメージングの注入のガラス窓を使用していくつかの研究がある、 31,32。これらの研究とは異なり私たちの窓はないガラス ウィンドウです。これは前と受傷後のイメージングのため便利ですが、長期観察ウィンドウの再確立の困難なことがあります。私たちの今後の研究は、慢性的なイメージング技術の改善に取り組んでいます。(動脈、静脈、毛細血管) いくつかの船種の維管束系を構成、それぞれの形態と機能の面で異なっています。イメージ投射の間の船種間の分化は、血管の変化の明確なパターンを引き出す助けることができます。上記のプロトコルは形態および速度に基づいて船を識別するオブザーバーに依存します。ただし、容器の種類33間より決定的な分類を与える動脈固有色素を簡単に追加できます。
この技法は、霊長類での評価に限定、挫や放射線障害など、他の外傷性モデルのだけではなく、また研究 BSCB の破壊に焦点を当て、同様に血管透過性が変わります。SCI、ほか筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や多発性硬化症 (MS) などその他の神経変性疾患に伴う血管の変化を勉強に使えます。さらに、譲渡トランスジェニック動物モデルに動的神経血管の相互作用を研究することです。強力なスクリーニング ツールとして今後の研究は、脊髄損傷の治療の有効性を評価するためにここで説明したイメージング技術を利用できます。
結論としては、デュオ色法生体内では時空の血管分布の評価に最適なダイナミックな血管の変化を評価・ スクリーニングに治療のため信頼性が高く、リアルタイム体内のアプローチ ツール科学の二次損傷を減らす

外傷性脊髄損傷 (SCI) は、運動、感覚、および自律機能の障害につながる一般的な負傷です。よると、国立脊髄損傷統計センター (NSCISC) 2016 年に、約 282,000 人それらの 69% が交通事故のために主に影響を受けたまたは1に落ちる。これらの患者は往々 に集中ケア。ただし、現在使用可能な効果的な治療法はありません。したがって、SCI に向けた新しい効果的な戦略が急務します。
SCI は主に 2 つのフェーズに分けられる: 二次及び一次損傷。主な傷害に影響2炎症、細胞のアポトーシスと徐々 につながる残りの軸索の脱髄などの二次損傷のイベントのシリーズに続いてのサイトに出血性の壊死を引き起こす物理的な侮辱が装備されています。形態および機能欠損3,4,5,6の拡大。出血は傷害、SCI7,8の急性期における血管即時中断を示す最初の目に見えるサインです。早期の血管損傷を減らすことを目的とした神経保護戦略は、患者の回復を改善できるが、これは初期のポスト傷害血管イベントの病態生理学的メカニズムの理解を深める必要があります。
脊髄の血管系を研究するさまざまな方法を使用して前の研究にもかかわらず重要な制限が残っています。ほとんどの共有の欠点は死後サンプルだけ、たとえば、水素クリアランス9、放射線写真法10microangiogram8、血管腐食キャスト11、および免疫組織化学12 を勉強してください。 ,13。レーザードップラーで脊髄血流14の非侵襲的にリアルタイム モニタ リングは、血管のシステムの間で区別し、血管の形態学的変化を検出することができるはありません。ダイナミック造影 MRI (バン) は非侵襲的、またが、低解像度画像を生成し、高価なインフラストラクチャ15が必要です。
生体内でイメージ投射 2 光子レーザー顕微鏡 (2 P LSM) を開発した野16,17,18vasodynamics を勉強、研究の限られた数があります。大唐らに続く実証の血管の変化は、霊長類の損傷は 2 つの理由より困難後ヘミセクション モデル19でもイメージング病変サイトの端の血流の変更を示しています。まず、損傷部位に伝統的なガラス光学窓がない機械的衝撃を維持し、イメージング機能を維持します。第二に、ために実質にトレーサーのリーク出血は、受傷後のイメージングと難易度を作成します。
前と受傷後時点で同じ個々 の血管の撮像を可能にする新しいデュオ カラー イメージング法をご紹介します。さらに、それは次の霊長類の大血管のダイナミックな変化の時空プロファイルを提供します。それもポスト傷害の時間の複数のポイントでイメージングの可能性があります。このプロトコルは、神経血管の相互作用を研究するトランスジェニック動物に直接適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>皮膚滅菌</td></tr><tr><td>ケタミン (87.7 mg/kg)/キシラジン (12.3 mg/kg)</td><td>パターソン獣医&nbsp;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン(0.03mg/mL)&nbsp;</td><td>パターソン獣医&nbsp;</td><td>07-891-9756</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>・パターソン 獣医</td><td>07-844-7425</td><td>非ステロイド性抗炎症薬</td></tr><tr><td>デュカル ガーゼスポンジ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22-415-490</td><td>皮膚滅菌</td></tr><tr><td>デコンエタノール200プルーフ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-355-450</td><td>皮膚滅菌</td></tr><tr><td>人工涙液眼軟膏</td>ウェブ<td>スター獣医</td><td>07-870-5261&nbsp;</td><td>目の乾燥を防ぐ&nbsp;</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>1006015</tr><tr><td>ローダミンBイソチオシアネート&ndash;デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>平均分子量 70kDa</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート&ndash;デキストラン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>46945</td><td>平均モル重量 70kDa</td></tr><tr><td>器具滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-50</td><td>滅菌手術用ツール</td></tr><tr><td>脊椎スタビライザーセット</td><td>カスタム ノートン神経科学研究所</td><td></td>から製造 <td>詳細については Y. Ping Zhang にお問い合わせください. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M アニマルケア製品</td><td>1469SB</td><td>ティッシュ接着剤 Gelfoam</td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>Stop bleeding</td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps- Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>椎弓切除術</td></tr><tr><td>Surgical Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12&nbsp;</td><td>スキンカット</td></tr><tr><td>メスの刃 #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>スキンカット</td></tr><tr><td>マイクロアングルはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>500260</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>3-0 vicryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>シルクブラック編組非吸収性縫合糸、3-0、C-7、リバースカット、18インチ</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>ヘンケ・サス・ウルフ</td><td>4010.200.V0</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>21ゲージ針</td><td>BD</td><td>305165</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>どのベンダーからでも可能</td></tr><tr><td>2光子レーザー走査型顕微鏡</td><td>ブルカー蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LISAデバイス</td><td>ノートン神経科学研究所</td><td></td><td>からカスタム製造詳細については、Y. Ping Zhangにお問い合わせください. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>浜松製作所</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>二光子イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Matlab 統計ツールボックス</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

in vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

脊髄損傷 (SCI) 傷害のサイトで重要な血管の中断が発生します。血管病変は SCI の直後に発生します、外傷急性期フェーズを通して続行されます。実際には、血管内皮細胞は最初の霊長類理後に死ぬ、します。血液脊髄関門 (BSCB) の高められた透磁率を含む初期の血管イベント分子病態浮腫を誘導する複合体損傷メカニズムによって引き起こされる有害な二次傷害イベントに貢献します。理後の組織学的・機能的障害に貢献する二次傷害カスケードを減らすための重要な戦略ができるため、血管の破壊を対象と先行研究では、死後のサンプルに行った主と血管ネットワークの動的変化を捉えることができませんでした。本研究で、生体内でデュオ カラー 2 光子イメージング手法提案次の霊長類科学急性血管動的変更を監視するにはこの方法は、血流、血管径と同じラット前と受傷後の様々 なサイトで他の血管疾患を検出できます。全体的には、このメソッドは、血管動態を調査するための優れた会場を提供します。

方法は生体内のダイナミックな脊髄血管変化個々 の船舶を監視することが前およびポスト外傷性の科学まず、後続の蛍光色素を注射 (図 1 a-c図 3) へのアクセスを提供するために外頚静脈経由でカテーテルがインストールされます。2 番目のステップでは、特殊な装置を使用して、公開されている C5 ・ C7 (図 1-F図 2 aB) を安定させるために。この安定化の手順は、呼吸の不自然さをなくすし、安定した画像を提供できます。椎弓切除術 (図 2)、次のステップは C5 ・ C7 (図 2 Dの-F) でウィンドウをイメージング 2 P のインストール。末梢組織が脊髄の画像ウィンドウの周りに出血を最小限に抑えることは、血管撮影の成功にとって重要です。次の手順は、(図 3 aB, E) のベースラインとしてランドマーク、地図血管網に前述のカテーテルを介してローダミン デキストラン蛍光色素 (赤) を注入するためです。目的のポスト傷害の時間ポイントで C7 中等度と正中線霊長類の損傷後、FITC デキストラン (緑) を導入 (図 3 a &amp; D)。デュオ色法の美しさは、あの最初の染料が負傷 (図 3) 柔組織に流出して既に 2 番目の色素を用いた血管構造を検出できます。
イメージング セッション中には、麻酔導入後ボディコア温度を維持するために加熱パッドに動物を維持することをお勧めします。
デュオ色法を用いて、個々 の血管の直径、赤血球速度 (RBC 速度) することができます測定および計算。直径、1 つ ImageJ を使用して、キャリブレーション (図 4) 後 3 繰り返しの最大直径で船を測定できます。速度、ライン スキャン画像は、赤血球速度 (図 5)18を計算する Matlab プログラム (MATLAB R2013a) を使用して計測されます。形態、血流速度、血管径を基に、船は 2 つのカテゴリに分類できます: 動脈と静脈 (表 1 を参照してください)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
図 1.頚静脈カテーテルと脊椎の安定化。 (A)外頸静脈を検索するための図。(B) 21 g 針から作られた特殊なカテーテル。先端フラットと別の 21 g 針から切り離されて 2 ミリ先端の部分で溶接の地であった。(C)カテーテルの模式図。遠位端は、近位カテーテルの安定化、血管 (血管結紮、青い矢印) に沿って針を締結終了後にまず、結紮は。(D)変更された背骨の安定化のイメージ。椎弓切除術(E)前に、椎弓切除術と霊長類の SCI (F)後の C5 ・ C7 ウィンドウが表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
図 2.ウィンドウ光インストール ステップバイ ステップの模式図。 (A)手順 1: 切断肌と正中線に沿って筋によって椎骨を公開します。(B) ステップ 2: の背骨の安定化。(C)ステップ 3: 椎弓切除術。(D)ステップ 4: 弁の生理食塩水に浸したの作品を配置することによって脊髄の水分を維持します。(E)ステップ 5: 滅菌弁と vetbond とのギャップをシールします。乾燥後、寒天壁の層は、ウィンドウの端で造られます。(F)手順 6: 画像の準備ができたら、ウィンドウをイメージング 2 P 内弁と場所浸漬液を削除します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
図 3.体内デュオ色方法の手順を説明します。 全体の手順は、5 つのステップ(A)で構成されています。次のステップ 1、ステップ 2、サイズはおおよそ 70 デキストラン トレーサーのペア KDa が (前に脊髄血管をラベルするシーケンスに挿入されるBとC) と霊長類の SCI (D)の後。(E)-(G)代表的な 2 P 画像はステップ 3 からステップ 5 脊髄血管系を表示します。白い矢印ポイント最初波赤い染料 (FおよびG) の領域を漏れから、ターコイズ ブルーの矢印表示第 2 波緑色素漏出(G)。スケールバー = 50 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
図 4.買収と脊髄血管の定量化。 次の準備、補正値(B)の XML ファイルと一緒に、2 P の顕微鏡の下で単一のイメージ ファイルを取得します。(A)式には、"ミクロン単位"光学ズーム値に基づいてピクセルの計算が表示されます。ImageJ (C)でのキャリブレーション後の前に縦の軸で、血管を測定 3 ポイントで(D1)後(E1)傷害。(D2) ・ (E2)は、測定値を表示します。(F)ベースラインと受傷後 30 分で血管の定量化。スケールバー = 50 μ m の範囲データのとおり平均 ± SD * * * p &lt; 0.0001、両側ペア t テスト。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
図 5.買収と脊髄血管速度の定量化。 単一の容器の速度を計算する 2 P 顕微鏡下ライン スキャン画像ファイルを取得します。(A)選択した血管と血管赤血球速度を評価する方法の例です。(B)動脈ライン スキャン画像と速度の計算のための対応する印刷ファイルの例と同様、静脈(C)の例。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>動脈</td>
			<td>静脈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>形態</td>
			<td>まっすぐ、滑らかな、厚い血管壁</td>
			<td>枝、大まかなエッジ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血流速度</td>
			<td>高速します。</td>
			<td>遅いが異なります</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>直径</td>
			<td>30-80 μ m</td>
			<td>100-250 μ m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
容器の種類を識別するためのテーブル 1: 条件

生体内でイメージ投射 Sprague-dawley ラットの霊長類脊髄損傷脊髄血管変化を追跡する 2 つの異なる蛍光染料を使用してメソッドを紹介します。

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

このin vivoデュオカラー2光子イメージング法の全体的な目標は、挫傷性脊髄損傷後に発生する急性脊髄血管動態変化をモニターすることです。この方法は、これらの動的な血管の変化が病理学的進行と脊髄損傷後に発生する機能障害にどのように影響するかについての重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術が、プロモダンのサンプルを使用する従来の技術よりも優れている点は、生きた動物における脊髄損傷の急性血管動態の証拠が得られることです。この手法の意味は、早期の血管修復を目的とした潜在的な神経保護戦略を調べることができるため、脊髄損傷の治療にまで及びます。このデュオカラーイメージング法のアイデアを最初に思いついたのは、対照的な蛍光色を連続して注入することで、脊髄損傷後の破壊された血管を視覚化できることを発見したときでした。手順を開始する前に、6週齢の雌Sprague Dawleyラットのつま先つまみに対する反応の欠如と、続いて鎮痛剤と抗炎症剤の皮下注射により、適切な鎮静レベルを確認します。.ラットの頸椎領域と動物の乳房側の首の領域を剃り、露出した皮膚をベタジンサージカルスクラブと70%アルコールワイプで綿棒で拭きます。.動物の目に軟膏を塗布し、滅菌顕微鏡下の摂氏37度の加熱パッドの上に滅菌手術パッドの上にラットを仰臥位に置きます。.鎖骨の近くの脈拍点を見つけて外頸静脈を見つけ、小さな滅菌スプリングハサミを使用して、右下顎骨の尾枝、上腕骨の大結節、およびマヌブリウムの交点に垂直に切開します。スプリングハサミと細い鉗子を使用して頸静脈を分離し、滅菌外科用縫合線を使用して血管の遠位端を結紮します。次に、マイクロハサミを使って血管壁に小さな切開を行い、生理食塩水で満たされた1ミリリットルの注射器に取り付けられた21ゲージの針から作られた特殊なカテーテルを血管にスライドさせます。針に少量の血液が入れば、挿入は成功です。針を近位端と遠位端に固定します。背骨を安定させるために、動物を腹臥位に切り替え、15番のメスの刃を使用して、正中線に沿って目的の脊椎レベルで皮膚を切断します。肩甲骨の間のスパイクで2番目の胸椎を見つけ、T2から上に向かって数えてC7椎骨を見つけます。第5頸椎から第7頸椎までの筋層を両側に解剖して外側の面を露出させ、外側の椎骨の両側にスリットを入れます。改造された安定化装置のステンレス製アームを露出した横方向のプロセスファセットの下にスライドさせ、ネジを締めて脊椎を安定させます。次に、C5からC7の椎弓板を慎重に取り除き、露出した硬膜の上に生理食塩水に浸したジェルフォームの小片を置き、水分を保ちます。2光子イメージングウィンドウを作成するには、筋肉と椎骨の間の隙間にゲルフォームの小片を配置し、脊髄と椎骨の間にゲルフォームの細い線を配置します。次に、周囲の筋肉の骨領域を組織接着剤で密封します。イメージングウィンドウを成功させるための最も重要なステップは、ウィンドウ内に軽度の出血がないことを確認することです。接着剤を約5分間乾燥させた後、滅菌済みの1ミリリットルの注射器に温かい4%寒天を満たし、窓の端に沿って寒天の壁を分配します。寒天は柔軟性を保ちながら急速に固化します。ベースライン画像を取得するには、まずジェルフォームを取り外し、ウィンドウ内に浸漬液を追加します。安定化した動物を、低倍率対物レンズの真下にある2光子イメージングウィンドウを備えた2光子顕微鏡の暗室に入れ、レンズを慎重にウィンドウに下げます。1ミリリットルの滅菌シリンジに0.5ミリリットルの新たに調製したローダミンBイソチオシアネートデキストラン溶液を入れ、シリンジをカテーテルに接続します。.プランジャーを非常にゆっくりと押し下げて、接眼レンズを使用して色素を送達し、関心領域を特定し、電荷結合デバイスカメラを使用して表面血管パターンの画期的な明視野画像を取得します。次に、2光子イメージングソフトウェアを開いて電源を入れ、適切なレーザー励起波長を選択します。次に、注入された蛍光色素実験に対応する適切な2光子レーザー出力、HVレベル、および蛍光チャネルを選択し、イメージングウィンドウを通じて組織をイメージングして、画像とラインスキャンデータの両方を収集します。C7正中線挫傷を導入するには、ラットをルイビル傷害システム装置装置に置き、0ポイント設定を選択します。次に、組織の変位を調整し、[実験の実行]をクリックして、損傷を引き起こす衝撃または解放をトリガーします。次に、生理食塩水に浸したジェルフォームの小片を露出した硬膜の上に置き、水分を保ち、同じイメージングパラメータを使用してイメージングウィンドウを通じて新しい画像を開きます。動物を暗い部屋に戻し、新たに調製したフルオレセインイソチオシアネートデキストラン0.5ミリリットルをカテーテルに注入します。次に、動物を顕微鏡の暗室に戻し、両方の蛍光色素チャネルで画像を取得します。ローダミンデキストラン蛍光色素注射液は、ベースラインでの血管網のマッピングのためのランドマーク画像のキャプチャを可能にします。中等度の重度のC7正中線挫傷性損傷が発生した後、FITC-デキストランの導入により、損傷によって最初の色素が周囲の実質に漏れた後の血管構造の検出が容易になります。損傷前後の血管の画像化により、血管の直径と損傷に対する反応の変化を定量化できるだけでなく、血管を通る損傷前と損傷後の赤血球速度の変化を計算することもできます。まとめると、これらのデータを使用して、画像化された血管を静脈または動脈に分類できます。この手順を試行する際は、目立った呼吸アーチファクトを避け、画像ウィンドウ内の軽微な出血を制限することを覚えておくことが重要です。この手順は、脊髄損傷後に発生する神経血管相互作用に関する追加の質問に答えるために、トランスジェニック動物でも実行できます。このビデオを見れば、生きている動物の挫傷性脊髄損傷後の急性血管動態変化をモニターするために2光子顕微鏡を使用する方法についてよく理解できるはずです。

an-vivo-duo-color-method-for-imaging-vascular-dynamics-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル...

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

このビデオでは、我々は生きたマウスの背側脊髄の上に慢性光学イメージング室を移植するための手順を説明します。室、外科的手順、および慢性のイメージングを見直し、実証されている。...

縦断のために脊髄商工を移植するための手順インビボイメージング

二光子生体内イメージングは、背柱外傷性脊髄挫傷を負った骨髄キメラ動物の天然組織環境における脊髄の異なる細胞タイプ間の相互作用を調査するために使用することができます。...

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

実験的脊髄損傷における脊髄血流の評価のための強化された超音波画像コントラスト

マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。...

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

光血栓症は、脊髄に限局性虚血を誘発する低侵襲で再現性の高い手順であり、マウスの脊髄損傷のモデルとして機能します。...

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

ここでレーザー血流イメージング (LDPI) の組み合わせを提案して、脊髄を導入するための標準化された手順だけでなく、局所血流と酸素飽和度 (その2) をコード レーザー血流モニタリング脊髄を測定する...

レーザーのドップラー イメージングおよび監視を使用したラット脊髄の微小循環の分析

脊髄微小循環は脊髄損傷において極めて重要な役割を果たす。ほとんどの方法では、微小循環を標的とした治療法の開発に不可欠な脊髄微小循環のリアルタイム評価はできません。ここでは、虚血/再灌流の大型動物モデルでレーザードップラーフローニードルプローブを用いたプロトコルを提案する。...

イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

学ぶデュオカラー2光子イメージング法による脊髄損傷後の血管動態変化のリアルタイム観察。Sprague-Dawleyラットを用いて損傷後の血管径変化と血流動態を定量化し、早期血管修復を目指す神経保護戦略の評価に応用可能です。

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