Name: 多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ多重蛍光分析による腫瘍浸潤CD8+T細胞の自動計数法。PD-1+Tim-3+表現型を同定し、免疫療法の予後バイオマーカー解析を支援します。がん免疫学研究に応用可能です。

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この作品は、Institut 国立デュがん (インカ) (ET)、リーグ contre le がん (ET)、大学ソルボンヌ大学パリ ・ シテ (ET)、ANR (Selectimmunco) (ET)、Labex 免疫腫瘍 (ET)、SIRIC CARPEM (CG, ET) からの助成金によって支えられました。EdG 財団アークの交わりによって資金を供給されました。EV と CD APHP (bourse 極東凝った) の団体によって資金を供給されました。ChB 大学ソルボンヌ大学パリ シテ (契博士) の交わりによって資金を供給します。著者は、このプロジェクトの資金調達のためのブリストル マイヤーズ スクイブをありがとうございます。著者は、病理学の病院位置ジョルジュポンピドーとネッカー (Laurianne シャンボール、エロディ ミシェルとジゼル Legall) の部門をありがとうございます。著者は、PARCC 病院位置ジョルジュ ・ ポンピドゥー (コリーヌ クリスチアーネ) の組織のプラットフォームをありがとうございます。

<ol><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
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<li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
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<li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li>
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<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li>
<li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8%28%2B%29+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).</li>
<li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095(2017).</li>
</ol>

すべての著者は宣言する利害の対立があります。

変更とトラブルシューティング:
組織の品質は重要なパラメーターです。ヘマトキシリンとエオシンの着色によって簡単にチェックできます。
技術の利点の 1 つは多重染色の可能性が、fluorophore の波及を避けるためには、発振波長 10 nm 以上のデルタを選択することお勧めします。ここでは、4 染色 DAPI を含むので、我々 は波長を広げて選んだ (DAPI: 460 nm、AF488: 519 nm、シアニン 3:570 nm、シアニン 5:670 nm)。自動画像分析と組み合わせる混合発光信号から蛍光体の純粋なスペクトルを計算するソフトウェアを使用して様々 な fluorophores が付いてからの信号を重複の危険性は回避されます。モノラル染色スライドもスペクトル ライブラリのおかげで補償としてフルオロと行為間の重複の有無を確認します。
時々 1 つのセルに 1 つのマーカーの陽性は染色/蛍光が弱い場合かを判断することは困難する...

過去数年間の免疫療法は、RCC を含む癌の多くの種類のための非常に有望な治療法として浮上しています。特に、免疫抑制のチェックポイントの阻害に基づく PD 1 のような臨床的に効果的な1,2,3,4,5,報告された ctla の条項 46。 モノクローナル抗体 CTLA-4、いくつかのがんでは既に承認されて PD-1、またはプログラム死配位子 1 (PD L1) と患者7の 20% 以上の長期的な臨床反応をもたらします。それにもかかわらず、ないすべての患者が反応、治療費が高い、これらの治療法は、有毒である、潜在的な深刻な自己免疫性のような副作用に 。したがって、現在の課題は、これらの新しい免疫療法を予測するマーカーを識別するためにです。臨床応答と相関する腫瘍、PD L1 の式または+ T 細胞浸潤 cd8 陽性腫瘍のレベルでの突然変異率を報告されています。しかし、この協会は非小細胞肺癌 (NSCLC) 癌患者8 で Pembrolizumab の管理の前に PD L1 の仲間のテストを除いて臨床実習では臨床マーカーの使用をお勧めしますには弱すぎます。、9,1011,12。PD 1、ティム-3、ラグ-3 のように多くの抑制性受容体の共発現し、CTLA-4 誘導細胞枯渇表現療法13,14,15への抵抗、それは実証されています。末梢血は、腫瘍微小環境の代表ではない、原細胞の表現型の機能の分析に関心の高いのです。PD 1 とティム 3 の共同表現する T 細胞が、いくつかのコンテキスト13,16,17機能的障害の細胞として知られています。この研究で 2 つの抑制性受容体 PD 1 の共発現と CD8 のティム-3 の予後への影響+ T 細胞が評価されました。
腫瘍浸潤リンパ球 (TILs) で複数のマーカーの共発現を勉強して、今までは主に流れフローサイトメトリー解析、新鮮な腫瘍とそのため除外解析上で動作する必要があるサービスによって実行されました。従来その場で染色、一度に 1 つだけの染色を実行できますと共同マーカーを表現するセル型の評価は不可能します。たとえば、PD L1 は、PD L1 を発現する細胞相関研究より関連している従来の免疫組織学的解析による定義を難しく腫瘍微小環境の多くの細胞のタイプによって表されます。今回、我々 は腫瘍浸潤 CD8 PD 1 とティム-3 の共発現を関連付けるコンピューター カウントで革新的なその場で多重蛍光方法を開発+ RCC の臨床結果と T 細胞。このテクニックに制限された間隔をキャプチャすることができますマルチ スペクトル カメラを用いた同時に単一セルのレベルで複数のマーカーを分析する可能性を含むいくつかの利点は、> 10 nm ~ 液晶フィルター18。さらに、プロシージャは自動オペレーター間の再現性とマニュアルのテクニック19に比べて短縮分析ができます。がん分野でいくつかの研究報告、メルケル細胞癌、肺癌、頭頸部癌20,21,22, PD 1、PD L1、cd8 陽性など免疫の分子の複数の染色を説得23. 自動細胞数はユーザー (表現型解析ステップ) による訓練で可能です。蛍光は、別の細胞コンパートメント (核、細胞質と膜) で測定されます。
ここでは、腫瘍浸潤 CD8 の異なるサブセット+ T 細胞表現する PD 1 および/または RCC の大規模コホートでティム 3 は数えられ結果が臨床重力得点と生存率パラメーターと相関しました。また、フローサイトメトリーのような蛍光強度の意味 (MFI) データと携帯電話の解像度で膜の蛍光強度を分析することが可能だった。我々 の知る限り、これは最初の研究レポート予後結果に基づいてカウントするマルチ スペクトル イメージングの技術を使用して表します。

<table><tbody><tr><td>Vectra 3 自動定量病理イメージング&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS142338</td><td></td></tr><tr><td>inForm細胞解析 2.1.</td><td>パーキン エルマー</td><td>CLS135781</td><td></td></tr><tr><td>R ソフト</td><td>https://www.r-project.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダコペン</td><td></td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファー サリン TBS錠</td><td>タカラ、バイオ</td><td>TAKT9141Z</td><td>pH7.6 100錠</td></tr><tr><td>トリスバッファー サリン Tween 20 TBS(+Tween20)</td><td>株式会社タカラ</td><td>TAKT9142Z</td><td>pH 7.6 100錠</td></tr><tr><td>ビオチンブロッキングシステム</td><td>Dako</td><td>X0590</td><td>アビジン 0.1% および ビオチン 0.01%</td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-001</td><td>5% vol./vol. 濃度</td></tr><tr><td>フルオロシールド DAPI</td><td>Sigma-aldrich</td><td>F6057</td><td>1.5 &micro;g/mL 濃度</td></tr><tr><td>ニット ガラス カバースリップ</td><td>ニットテル Gl&auml;ser、</td><td>100039</td><td>24x60 mm 100カバースリップウサギ</td></tr><tr><td>抗CD8クローンP17-V</td><td>novus</td><td>NBP1-79055</td><td>4&microで使用;g/mL</td></tr><tr><td>マウス anti-PD-1 Clone NAT</td><td>abcam</td><td>ab52587</td><td>を 2 & micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>ヤギ抗 Tim-3</td><td>R&D</td><td>AF2365</td>は<td>3&マイクロで使用。g/mL</td></tr><tr><td>Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142</td><td>Roche</td><td>7309457001</td><td>1 & micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>マウス AF647 標識パンケラチンクローン C11</td><td>Cell Signalling</td><td>4528</td><td>を 0.5 &micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒト gal9</td><td>R&D</td><td>AF2045</td>は<td>0.3&microで使用。g / mL</td></tr>シ<tr><td>アン5結合ロバ抗ウサギ</td><td>ジャクソン免疫研究</td>711-175-15255-15255-15255-152555-1525555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555 <td></td><td>g/mL</td></tr><tr><td>ビオチン化 F(ab'2)ロバ抗マウスIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>715-066-150</td><td>は3&microで使用。g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 抱合型ロバ抗ヤギ IgG</td><td>abcam</td><td>ab150133</td><td>5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Cy3 標識ストレプトアビジン</td><td>アマシャム</td><td>PA43001</td><td>3 &micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>ネガティブコントロールマウスIgG1</td><td>Dako</td><td>X0931</td>を<td>2 & microで使用。</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I5256</td>由来のg/mL IgGを<td>3 & microで使用。</td></tr><tr><td>ウサギ血清</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I5006</td>由来のg / mL IgGは<td>4&microで使用します。グラム/mL</td></tr></tbody></table>

多重蛍光分析・数量化腫瘍 pd 1+ティム-3+ cd8 の+ t 細胞

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

免疫細胞は腫瘍微小環境の重要なコンポーネントであるし、発癌のすべての段階での腫瘍の成長と進化に影響を与えます。特に、それは今確立してひと腫瘍における免疫の浸潤が予後と治療への反応を関連付けることができます。腫瘍微小環境における免疫の浸潤の解析患者および治療に対する反応の分類の主要な課題となっています。
プログラム細胞死蛋白質 1 (PD1; として知られている CD279)、細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質の 4 (CTLA-4)、T 細胞免疫グロブリン、ムチンを含むタンパク質-3 (ティム 3; として知られている CD366)、リンパ球などの抑制性受容体の共発現アクティブ化の遺伝子 3 (ラグ 3; 別名 CD223) は、T 細胞の枯渇の特徴です。その場で多重蛍光染色、細胞レベルでこれらの抑制性受容体の共発現を定量化することを開発しました。腎細胞癌 (RCC) のフリーズされたティッシュのレトロスペクティブ シリーズでは、画像解析ソフトと相まって蛍光マルチ スペクトル イメージング技術を使用して、腫瘍浸潤 CD8 で PD 1 とティム-3 の共同式が見つかりました+ T 細胞RCC の予後と相関しています。我々 の知る限り、このを表します、この自動多重原・ テクノロジーを示す最初の研究いくつかの臨床的意義があります。

腫瘍 CD8 を定量化する上で説明した一般的なプロトコルを使用して、目的とする患者、RCC と臨床転帰25結果を関連付けることから凍結するティッシュでの PD 1 とティム 3 抑制性受容体の共発現細胞の+ T。
CD8/PD-1/ティム-3 染色の最適化:
抗体 (マウス、ウサギ、ヤギ、材料表を見る) の種は異なった抗体の交差反応を避けるために選ばれました。プロトコルは, 扁桃組織のリンパ組織であるに検証されました。PD 1 染色が見つかりませんでした (図 1)、胚中心内に対し CD8 とティム 3 染色が胚中心を取り巻く存在。この典...

勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T 細胞。この再現性と信頼性の高い技術は、大規模コホート解析に適しています。

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

このマルチプレックス免疫蛍光分析の全体的な目標は、表現型に基づいて細胞を自動的にカウントすることです。この方法により、多蛍光および自動細胞カウントにより、腫瘍微小環境内の腫瘍免疫細胞の表現型と機能を解析できます。この技術は、腫瘍微小環境から直接導き出されたマーカーによって予測される2種類の複合予後の生成を容易にしました。一般に、この方法に不慣れな人は、フェノタイピング手順が非常に長く、結果として得られる生データにさらなる処理が必要なため、苦労する可能性があります。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、アンホッジミランティ細胞の表現型と免疫学的相互作用を特徴付けようとしたときにでした。解凍後、ペーパータオルを使用して組織切片の周りのスライドを注意深く乾かし、疎水性バリアペンで組織を丸めます。バリアが乾いたら、サンプルを100%アセトンで5分間固定し、続いて2分間の自然乾燥を行い、次にスライドをTBSで10分間洗浄します。暗所で0.1%アビジンを3滴滴下して10分間スライドを前処理し、スライドをタップまたはフリックして組織をアビジン溶液で覆います。各サンプルに01%ビオチンを3滴加え、サンプル全体でビオチンをタップまたはフリックした後、先ほど示したようにTBS洗浄を行います。次に、TBS中の100マイクロリットルの5%正常血清で非特異的結合を室温で30分間ブロックします。.インキュベーションの終了時に、スライドを軽くたたいて余分な血清を取り除き、目的の一次抗体カクテル100マイクロリットルにスライドを加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。抗体標識スライドをTBSTで5分間洗浄します。乾燥後、目的の二次抗体カクテル100マイクロリットルで細胞を標識し、加湿チャンバー内で30分間、続いてTBSで10分間洗浄します。乾燥した二次抗体標識スライドを目的の三次抗体カクテル100マイクロリットルで30分間インキュベートした後、TBS洗浄で10分間インキュベートします。洗浄が終わったら、スライドを乾燥させ、dapiを添加した封入剤で組織をマウントします。次に、各スライドをカバースリップでクローバーし、封入剤を少なくとも2時間セットします。スライドをスキャンするには、顕微鏡ソフトウェアを開き、画像スキャンプロトコルをロードします。最初のスライドを顕微鏡ステージにロードします。次に、コントロールバーで[露出の設定]をクリックし、各フィルターの露出時間を調整して、十分な飽和していない信号が得られるまで調整します。上部パネルの[開始]をクリックして、LabIDフォルダを開きます。最初のスライドの ID を入力し、[次へ] をクリックします。4倍の倍率で明視野光の下でスライドの概要を取得するには、モノクロイメージングをクリックして標本を見つけます。スキャンする組織の配列を選択するには、コントロールキーを押し、カーソルを使用して、スキャンする関心領域を4倍の倍率で選択または選択解除します。各領域の蛍光赤/青/緑の画像を取得するには、[低電力の想像] をクリックします。高倍率のフィールド選択を行うには、コントロールキーを押して、20倍の倍率でスキャンする組織の領域に対応する関心のある領域を少なくとも5つ選択します。次に、各フィールドのマルチスペクトル画像取得を取得するには、[高倍率の想像]をクリックし、[データストレージ]をクリックして画像を適切なラボIDフォルダに保存します。ファイルメニューで新しいプロジェクトを作成するには、新しいプロジェクトを選択し、検索機能メニューでセルセグメンテーションを選択し、フェノタイピングメニューでフェノタイピングを選択してから、設定をクリックします。画像形式では、マルチスペクトルを選択します。サンプルフォーマットでは、蛍光を選択します。代表的な画像をプロジェクトに統合するには、ファイルメニューで[画像を開く]をクリックし、シリーズ全体の代表的な画像を10〜30個選択します。自動蛍光を除去するには、未染色のスライドを開き、ライブラリーソースと適切な蛍光色素を選択します。[自動蛍光]をクリックし、空白のスライドで自動蛍光の領域を選択します。合成画像を生成するには、[すべて準備]を選択して、蛍光ライブラリと自動蛍光スペクトルを統合します。目のアイコンをクリックしてビュー エディター パネルを開き、autoflourescence の選択を解除して autoflourescence 信号をトリミングします。各マーカーに適切な色を選択します。細胞をセグメント化するには、コンパートメントメニューで核と膜を選択します。nucleiメニューで、DAPIを核対比染色として設定します。セグメント化細胞をクリックし、細胞膜内の核のセグメンテーションを確認します。細胞を表現型にするには、表現型メニューで「追加」をクリックします。細胞表現型カテゴリを作成するには、Fluorophor と Fluorophor combination の代表を 5 つ以上選択し、分類器の学習をクリックします。分類器は、信頼区間を持つ各セルの表現型を属性化するアルゴリズムを作成しています。ズームして細胞の表現型を確認します。次に、表現型アルゴリズムと画像プロジェクトを保存するためにすべての表現型をクリックし、ファイルメニューでプロジェクトの保存を選択します。次に、プロジェクトに名前を付けて保存します。系列のバッチ分析を実行するには、バス分析を選択し、保存したプロジェクトを選択します。バッチ処理されたデータを保存するフォルダを選択します。分析する画像を追加し、[実行] をクリックします。解析の最後に、合成画像の品質を確認し、シリーズ内のすべての画像のフェノ型を確認します。透明な腎細胞癌標本上の腫瘍浸潤性CD8陽性T細胞を蛍光マルチスペクトルイメージングにより分析すると、CD8陽性T細胞の約半分がPD-1に対してシングル陽性であり、約1/3がPD-1およびTim-3に対してダブルポジティブであることが明らかになりました。これらの様々な細胞シグナルを組織切片に波形解析した後、PD-1陽性Tim-3陽性T細胞とPD-1陽性、Tim-3陰性CD8陽性T細胞のPD-1蛍光強度を測定したところ、Tim-3を共発現させるとPD-1 MFIが高くなり、Tim-3発現の機能的関連性が強化されることが明らかになりました。この代表的な実験では、腎腫瘍患者の66%がPD-1リガンド発現陽性であり、100%がTim-3リガンドGalactin-9陽性でした。腎細胞癌患者からの腫瘍組織の臨床スコアリングは、PD-1およびTim-3を発現するCD-8陽性T細胞浸潤腫瘍の数と割合と、Tim-3を発現しないPD-1陽性CD-8の予後スコアリングパラメータとの間に正の相関関係も示しました。興味深いことに、CD-8陽性T細胞がPD1とTim 3を共発現し、Tim 3が中央値を超える腎細胞がん患者は再発する可能性が高かったが、Tim-3 coを発現しないPD-1の発現は患者の再発と相関しないことがわかった。私はこの手順を試みましたが、可能であれば病理医を含む2人の別々の研究者と一緒に細胞の表現型を見直すことを忘れないでください。この手順に続いて、サイトメトリーなどの他の問題を実行して、x-vivo刺激後の自己表現型の機能的影響に関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、がん分野の研究者が影響を受けた臓器の免疫応答を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+...

免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。...

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。...

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

このプロトコルは、マルチプレックス免疫組織化学を用いた腫瘍微小環境の免疫細胞特性評価がどのように行われるかを詳細に説明しています。...

腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

この実験プロトコルは、主にシングルチャネル抗体のインキュベーション条件を最適化し、抗体とチャネルの設定を調整して、臨床起源の肺癌組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決することにより、マルチプレックス免疫組織化学(IHC)染色法を説明および最適化します。...

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ...

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

このプロトコールは、マウスFFPE黒色腫組織のDNAバーコードベースのイメージングのためのマルチプレックス免疫蛍光抗体パネルを設計するためのステップバイステップガイドを提供します。また、マウスの黒色腫腫瘍免疫微小環境に対する空間的プロテオミクスの洞察を生成するためのオープンソースツールを使用した画像解析パイプラインについても説明します。...

DNAバーコードを用いたマルチプレックス免疫蛍光イメージングによる、遺伝的に再プログラムされたマウス黒色腫のFFPE検体を解析

学ぶ多重蛍光分析による腫瘍浸潤CD8+T細胞の自動計数法。PD-1+Tim-3+表現型を同定し、免疫療法の予後バイオマーカー解析を支援します。がん免疫学研究に応用可能です。

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1⁺ティム-3⁺ CD8 の⁺ T 細胞

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