多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞
February 8th, 2018
勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T 細胞。この再現性と信頼性の高い技術は、大規模コホート解析に適しています。
このマルチプレックス免疫蛍光分析の全体的な目標は、表現型に基づいて細胞を自動的にカウントすることです。この方法により、多蛍光および自動細胞カウントにより、腫瘍微小環境内の腫瘍免疫細胞の表現型と機能を解析できます。この技術は、腫瘍微小環境から直接導き出されたマーカーによって予測される2種類の複合予後の生成を容易にしました。
一般に、この方法に不慣れな人は、フェノタイピング手順が非常に長く、結果として得られる生データにさらなる処理が必要なため、苦労する可能性があります。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、アンホッジミランティ細胞の表現型と免疫学的相互作用を特徴付けようとしたときにでした。解凍後、ペーパータオルを使用して組織切片の周りのスライドを注意深く乾かし、疎水性バリアペンで組織を丸めます。
バリアが乾いたら、サンプルを100%アセトンで5分間固定し、続いて2分間の自然乾燥を行い、次にスライドをTBSで10分間洗浄します。暗所で0.1%アビジンを3滴滴下して10分間スライドを前処理し、スライドをタップまたはフリックして組織をアビジン溶液で覆います。各サンプルに01%ビオチンを3滴加え、サンプル全体でビオチンをタップまたはフリックした後、先ほど示したようにTBS洗浄を行います。
次に、TBS中の100マイクロリットルの5%正常血清で非特異的結合を室温で30分間ブロックします。.インキュベーションの終了時に、スライドを軽くたたいて余分な血清を取り除き、目的の一次抗体カクテル100マイクロリットルにスライドを加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。抗体標識スライドをTBSTで5分間洗浄します。
乾燥後、目的の二次抗体カクテル100マイクロリットルで細胞を標識し、加湿チャンバー内で30分間、続いてTBSで10分間洗浄します。乾燥した二次抗体標識スライドを目的の三次抗体カクテル100マイクロリットルで30分間インキュベートした後、TBS洗浄で10分間インキュベートします。洗浄が終わったら、スライドを乾燥させ、dapiを添加した封入剤で組織をマウントします。
次に、各スライドをカバースリップでクローバーし、封入剤を少なくとも2時間セットします。スライドをスキャンするには、顕微鏡ソフトウェアを開き、画像スキャンプロトコルをロードします。最初のスライドを顕微鏡ステージにロードします。
次に、コントロールバーで[露出の設定]をクリックし、各フィルターの露出時間を調整して、十分な飽和していない信号が得られるまで調整します。上部パネルの[開始]をクリックして、LabIDフォルダを開きます。最初のスライドの ID を入力し、[次へ] をクリックします。
4倍の倍率で明視野光の下でスライドの概要を取得するには、モノクロイメージングをクリックして標本を見つけます。スキャンする組織の配列を選択するには、コントロールキーを押し、カーソルを使用して、スキャンする関心領域を4倍の倍率で選択または選択解除します。各領域の蛍光赤/青/緑の画像を取得するには、[低電力の想像] をクリックします。
高倍率のフィールド選択を行うには、コントロールキーを押して、20倍の倍率でスキャンする組織の領域に対応する関心のある領域を少なくとも5つ選択します。次に、各フィールドのマルチスペクトル画像取得を取得するには、[高倍率の想像]をクリックし、[データストレージ]をクリックして画像を適切なラボIDフォルダに保存します。ファイルメニューで新しいプロジェクトを作成するには、新しいプロジェクトを選択し、検索機能メニューでセルセグメンテーションを選択し、フェノタイピングメニューでフェノタイピングを選択してから、設定をクリックします。
画像形式では、マルチスペクトルを選択します。サンプルフォーマットでは、蛍光を選択します。代表的な画像をプロジェクトに統合するには、ファイルメニューで[画像を開く]をクリックし、シリーズ全体の代表的な画像を10〜30個選択します。
自動蛍光を除去するには、未染色のスライドを開き、ライブラリーソースと適切な蛍光色素を選択します。[自動蛍光]をクリックし、空白のスライドで自動蛍光の領域を選択します。合成画像を生成するには、[すべて準備]を選択して、蛍光ライブラリと自動蛍光スペクトルを統合します。
目のアイコンをクリックしてビュー エディター パネルを開き、autoflourescence の選択を解除して autoflourescence 信号をトリミングします。各マーカーに適切な色を選択します。細胞をセグメント化するには、コンパートメントメニューで核と膜を選択します。
nucleiメニューで、DAPIを核対比染色として設定します。セグメント化細胞をクリックし、細胞膜内の核のセグメンテーションを確認します。細胞を表現型にするには、表現型メニューで「追加」をクリックします。
細胞表現型カテゴリを作成するには、Fluorophor と Fluorophor combination の代表を 5 つ以上選択し、分類器の学習をクリックします。分類器は、信頼区間を持つ各セルの表現型を属性化するアルゴリズムを作成しています。ズームして細胞の表現型を確認します。
次に、表現型アルゴリズムと画像プロジェクトを保存するためにすべての表現型をクリックし、ファイルメニューでプロジェクトの保存を選択します。次に、プロジェクトに名前を付けて保存します。系列のバッチ分析を実行するには、バス分析を選択し、保存したプロジェクトを選択します。
バッチ処理されたデータを保存するフォルダを選択します。分析する画像を追加し、[実行] をクリックします。解析の最後に、合成画像の品質を確認し、シリーズ内のすべての画像のフェノ型を確認します。
透明な腎細胞癌標本上の腫瘍浸潤性CD8陽性T細胞を蛍光マルチスペクトルイメージングにより分析すると、CD8陽性T細胞の約半分がPD-1に対してシングル陽性であり、約1/3がPD-1およびTim-3に対してダブルポジティブであることが明らかになりました。これらの様々な細胞シグナルを組織切片に波形解析した後、PD-1陽性Tim-3陽性T細胞とPD-1陽性、Tim-3陰性CD8陽性T細胞のPD-1蛍光強度を測定したところ、Tim-3を共発現させるとPD-1 MFIが高くなり、Tim-3発現の機能的関連性が強化されることが明らかになりました。この代表的な実験では、腎腫瘍患者の66%がPD-1リガンド発現陽性であり、100%がTim-3リガンドGalactin-9陽性でした。
腎細胞癌患者からの腫瘍組織の臨床スコアリングは、PD-1およびTim-3を発現するCD-8陽性T細胞浸潤腫瘍の数と割合と、Tim-3を発現しないPD-1陽性CD-8の予後スコアリングパラメータとの間に正の相関関係も示しました。興味深いことに、CD-8陽性T細胞がPD1とTim 3を共発現し、Tim 3が中央値を超える腎細胞がん患者は再発する可能性が高かったが、Tim-3 coを発現しないPD-1の発現は患者の再発と相関しないことがわかった。私はこの手順を試みましたが、可能であれば病理医を含む2人の別々の研究者と一緒に細胞の表現型を見直すことを忘れないでください。
この手順に続いて、サイトメトリーなどの他の問題を実行して、x-vivo刺激後の自己表現型の機能的影響に関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、がん分野の研究者が影響を受けた臓器の免疫応答を探求する道を開きました。
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概要
この研究は、腫瘍免疫細胞をその表現型に基づいて自動的に数えるための革新的な多重免疫蛍光分析法を提示します。この技術は、腫瘍微小環境を分析し、免疫療法の反応に対する予後バイオマーカーを特定するために設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 腫瘍学
- 細胞生物学
背景
- 腫瘍微小環境は、がんの進行と治療反応に重要な役割を果たします。
- CD8 + T細胞は腫瘍における免疫反応に重要です。
- 既存の細胞数え方の方法は時間がかかり、広範なデータ処理を必要とします。
- この研究は、免疫細胞表現型の分析を効率化することを目的としています。
研究目的
- 腫瘍サンプルにおける免疫細胞の自動カウントのための信頼できる方法を開発すること。
- がん研究における大規模コホート分析を容易にすること。
- 腫瘍微小環境内の免疫相互作用についての理解を深めること。
使用方法
- 細胞表現型分析のための多重免疫蛍光。
- 自動カウントのためのin situ蛍光多重光画像。
- 画像用に疎水性バリアを用いた組織切片の準備。
- 細胞集団を分析するためのデータ処理技術。
主要な結果
- この方法はCD8 + T細胞サブ集団の効率的なカウントを可能にします。
- 結果は、腫瘍微小環境から派生した潜在的な予後マーカーを示しています。
- この技術は再現可能で、大規模研究に適しています。
- 腫瘍における免疫細胞ダイナミクスの理解が向上しました。
結論
- この革新的な方法は、腫瘍免疫細胞の分析を強化します。
- 免疫療法のバイオマーカーを特定するための枠組みを提供します。
- このアプローチは、腫瘍学における様々な研究応用に適応させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence analysis enables automated quantification of immune cell phenotypes in the tumor microenvironment, supporting target validation and biomarker discovery in immuno-oncology. By measuring co-expression of inhibitory receptors such as PD-1 and Tim-3 on CD8+ T cells, the method provides predictive confidence for patient stratification and therapeutic response. This approach addresses a key discovery-stage challenge: translating spatial immune profiling into actionable insights for portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying PD-1 and Tim-3 co-expression patterns on tumor-infiltrating CD8+ T cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional target validation of exhaustion markers in renal cell carcinoma.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by linking PD-1+/Tim-3+ T-cell frequency to poor prognosis and relapse risk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized multispectral imaging and phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs through automated cell counting and segmentation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by integrating fluorescence library preparation and autofluorescence removal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through correlation of PD-1+/Tim-3+ CD8+ T cells with prognostic scoring in renal cell carcinoma.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery to preclinical validation via composite imaging and phenotype algorithm training.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying Tim-3 co-expression as a functionally relevant biomarker independent of PD-1 alone.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling immune profiling that informs target confidence and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PD-1 and Tim-3 co-expression on CD8+ T cells in the tumor microenvironment.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multispectral imaging and standardized phenotyping workflows.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as PD-1 MFI and double-positive cell percentages to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via prognostic correlation in renal cell carcinoma specimens, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune profiling across tumor types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell exhaustion pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed immunofluorescence for immune cell quantification.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early biomarker identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on PD-1+/Tim-3+ T-cell thresholds linked to relapse.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, multispectral imaging, and image analysis software for phenotyping.
- Dependent on instrumentation including fluorescence microscopes with multispectral capabilities and environmental controls for slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, exposure settings, and phenotyping algorithms across sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types, fixation methods, and antigen retrieval protocols.
- Includes practical limitations such as lengthy phenotyping procedures and complex raw data processing requiring post-acquisition quality checks.
