Name: マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶマウス骨髄マクロファージと腹腔マクロファージを用いた抗体薬剤の抗炎症活性化効果評価法。in vitroおよびin vivoでIL-10産生を指標に薬剤応答を測定し、免疫学研究に有用な実験系を提供します。

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L.K. は、ブリティッシュ ・ コロンビアの大学 4 年間奨学金 (4YF) 大学院学生の身分賞の受信者です。L.M.S. は消化器のカナダの協会の受信者/クローン病、大腸炎カナダされて新しい調査官給与賞/健康研究、生物医学学者マイケル ・ スミス財団。この作品は、(# CIHR2016 LS を付与) 健康研究のカナダの協会と共同でカナダの血サービスからプロジェクトの助成金によって支えられました。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ブリティッシュ ・ コロンビアの大学のによって承認されています。
1. 骨髄マクロファージ導出と抗体で活性化
<ol>
	<li>CO2窒息を使用して安楽死を実行します。<ol>
		<li>誘導チャンバー内にマウスを置く。不動と呼吸はゆっくりと深くまで、60-90 s のための 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させます。</li>
		<li>イソフルラン麻酔を切りマウスが呼吸を停止するまで 6 ~ 8 リットル/分の CO2を管理します。マウスを残す CO2に、少なくともあと 5 分確認心拍か呼吸が不要になったこと。死を確保するための頚部転位を実行します。 注: 8-12 週古いマウスのマクロファージの最高収量を提供します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>70% エタノール スプレー マウス足と腕と発泡ボードの上に仰臥位で伸ばして脚を固定します。はさみと皮膚を保持するための鉗子で、後脚のそれぞれの面から皮膚や毛を削除する浅いカット (0.2 cm) を作る。 注: は、無菌フードでこのプロシージャとすべての培養操作を実行します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨を表示する筋肉をトリムします。脛骨と大腿骨を骨と足首から股関節のすぐ下の筋肉を切断することによって削除します。可能な限りとして多くの筋肉を切り落とします。</li>
	<li>70% エタノールで骨をスプレーし、蒸発、その後骨フラッシュ媒体 (Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 10% 牛胎児血清 (FBS)) の 6 ウェル プレートに配置するために 1 分を待ちます。</li>
	<li>骨空洞を露出するように 0.1 cm 足首や大腿骨の一番上の骨を切断することによって骨の両端をトリミングします。骨髄が表示されて 26 ゲージの針は骨の空洞に配置できることを確認します。</li>
	<li>骨と脛骨と大腿骨、膝関節から分離する筋肉をカットします。空洞に 10 mL の注射器に接続されている 26 ゲージの針を挿入します。フラッシュ中骨の 5 mL と 50 mL の円錐管に骨髄をフラッシュします。各 50 mL チューブに 2 つの脛骨と 1 つのマウスからの 2 つの大腿骨をフラッシュします。</li>
	<li>上下にいくつかの時間または渦塊を優しく分散する低速で骨髄をピペットします。骨髄の文字列は、骨髄の小型 (0.5 mm 以下) の斑点に分割する必要があります。フラッシュ中の骨付きを 50 mL の円錐管を埋めます。75 cm2組織培養に円錐形の管のピペット内容はフラスコを扱われ、37 ° c、5% CO2 1 時間孵化させなさい。 注: 成熟マクロファージ、間葉系細胞になるフラスコに付着し必要な造血前駆細胞の懸濁液のまま破棄します。</li>
	<li>造血前駆細胞と培地の 50 mL の円錐管にピペットします。常温 5 分破棄 300 x g でチューブに上清を遠心し、マクロファージコロニー刺激因子 (MCSF) 培養液 5 mL にペレットを再懸濁します (IMDM、10 %fbs、5 ng/mL MCSF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、および 150 μ Mmonothioglycerol (MTG))。</li>
	<li>検定18を使用してセルをカウントします。中長期 0.5 106セル/mL、30 ml 中の 10 の7セル/フラスコ × 1.5 倍の濃度に細胞を再懸濁し、優しく上下にピペットを追加します。新 75 cm2処理培養フラスコに懸濁液 30 mL のピペットします。</li>
	<li>1.9 のステップで初期培養後 7 日目の 4 日目、細胞が付着し少し分岐逆相明視野顕微鏡を使用することを確認します。非付着性細胞を含む培地を破棄します。IMDM とセルを洗浄して 1 回、MCSF 培養液 30 mL を追加します。</li>
	<li>セルが 10 日で成熟した (&#62; F4/80 の Mac 1 肯定的な 95%)、再度セルがあることを確認付着とわずかに。</li>
	<li>刺激のための細胞をプレート、フラスコから培養液を削除し 8 mL の酵素無料、EDTA を用いた細胞解離バッファー (資材表) を追加します。セル 5% CO2、37 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>無菌細胞スクレーパーを使用して、圧力の量が少ない細胞を優しくこすり。細胞がフラスコ表面から切断した顕微鏡で確認します。50 mL の円錐管にピペットの解離細胞。3 回 IMDM の 5 mL のフラスコを洗い、収穫された細胞と洗浄液をプールします。5 分間室温で 300 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>MCSF 培地 50 mL の円錐管あたりの 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。検定18を使用して実行可能なセルを数える。96 ウェル組織文化、底が平らなプレートのウェルあたり 1 x 10 の6セル/mL とプレート 100 μ 細胞懸濁液 (1 x 105細胞/ウェル) の濃度で細胞を再懸濁します。 注: 1 つのマウスの骨 100 基の井戸に十分なセルが生成されます。必要な場合は、6 ウェル プレート (組織培養処理、フラット下) でセルの 1 mL をめっきすることが。セル (1 x 10 の6セル) の大きい数は西部のしみの分析の役に立つかもしれません。</li>
	<li>一度付着、帳票の写し井戸各 10 ng/ml の IMDM、IVIg、または IVIg + 組合の 30 mg/mL LP を刺激します。LPS や IVIg の投与量は、応答を最適化する滴定することができます。些細コントロールとして帳票の写しの井戸を残します。24 時間 (37 ° C、5% CO2) それらを孵化させなさい。 注: 再めっきされたセルは、1 時間以内の組織培養井戸に従う必要があります。</li>
	<li>個々 の 1.7 mL 遠心チューブに各ウェルから細胞培養上清を収集し、5 分 10,000 x g で回して任意の粒子状物質を削除します。</li>
	<li>細胞培養上清を取り外して、ペレットを妨害しません。滅菌遠心チューブに上清明らかにセルを配置します。 注: 細胞培養上清がサイトカイン、IL-10、およびサイトカイン サブユニット、IL-12/23 p 40 の酵素免疫測定法 (ELISA)、すぐにによって試金または長期的に-80 ° C で保存します。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。その他の炎症性サイトカインが試金する、il-6, TNF など IVIg 共同処理による低減 + LPS 刺激と比較すると、単独で LPS 刺激。刺激後、西部にしみが付くことや量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR-Q) 19,20技術の付着性のセルを用意できます。</li>
</ol>
2. マウスIn Vivo IVIg と腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。</li></ol>IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 各マウスの体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg の 500 μ L 必要です。
	<li>IVIg の必要量を 1 mL の滅菌注射器に滅菌 26 装備描画ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、IVIg ではなく pH 7.4 の等価線量ボリュームを管理します。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>右下の象限に、マウスの腹部を基準にして 30-40 ° の角度で針を配置、ベベル、1.5 cm の針を挿入します。IVIg または PBS を腹腔内に挿入します。1 時間を待ちます。</li>
	<li>6-8 L/分 CO2窒息に続いて 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させる (1.1.1 - 1.1.2 の手順を参照)、または機関の倫理的なガイドラインによると。</li>
	<li>四肢が広げ、発泡ボードにマウスを固定します。70% のエタノールの部分をスプレーします。 注: は、無菌フードの手順を実行します。</li>
	<li>腹腔内の切断を避けるために、マウスの正中線に沿ってはさみで皮膚 0.2 cm の浅いカットを作る。そのまま腹腔壁のライニングが表示されるので、鉗子を使用してマウスの腹の腹部皮を引き出します。</li>
	<li>滅菌 PBS (pH 7.4) の 5 mL と 5 mL のシリンジを入力します。25 または 27 ゲージの針のベベルとマウスの中心に向かって右側または左側のいずれかからのキャビティの上部に針をします。 注: 置き針慎重にマウスで、臓器が腹膜腔にではなく、PBS を挿入しません。</li>
	<li>液を腹腔内に押し込みます。針を抜く空洞と 10 の腹膜をマッサージいずれかのセルを除去する s。空洞の上部に針を挿入し、臓器を避けてください。収集し、氷の上の 15 mL の円錐管に復元された洗浄液を配置します。 注: 流体注入毎の 5 Ml、約 3.75 mL がリカバリされます。</li>
	<li>注入および回復 (2.8 2.9 の手順) を繰り返して合計で洗浄液 15 mL を回復する (20 mL の総注入量)、回以上 3。それぞれのマウスから別の 15 mL の円錐管に洗浄を収集します。 メモ: 最終的な投与後があります簡単液が蓄積してきたマウスのところ左と右の側面から流体を抽出すること。臓器はこの位置に針が少なくをなります。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。500 μ L のめっき中で細胞を再懸濁します (IMDM、10 %fbs と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン) フラッシュ マウスあたり。検定18を使用して実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合は、製造元の指示に従って 1 x 赤血球細胞の換散バッファーを使用して、それらを削除する溶解手順を実行します。</li>
	<li>播種で 1 × 106マクロファージ/mL の培地で細胞を再懸濁します、96 ウェル平底処理組織培養プレートのウェルあたり 100 μ L をプレートします。 注: プールが必要になる場合がありますトリプリケート井戸や覚醒剤の滴定の実験を使用して場合の 1 つ以上のマウスから細胞。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。5 井戸または 1 実験 1 LPS 投与で、重複での十分なセルがあります。</li>
	<li>細胞大食細胞になることを許可するように 5% CO2 37 ° C で 1 時間インキュベート付着。付着性のセルは、腹腔マクロファージです。細胞培養上清、非付着性のセルを削除します。200 μ L IMDM (37 ° C に加温) で 2 回井戸を洗い流し、10 を待つ s プレートをゆっくりと傾ける。メッキ媒体を交換してください。37 ° C、5% CO2刺激前に 30 分で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>10 ng/ml の IMDM、LP のマクロファージを刺激するかコントロールとして、安静のまま。24 時間インキュベートを収集し、明確に elisa 法による IL 10 サイトカイン解析のためのセル清 (1.16 1.17 の手順を参照してください)。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。 注: 刺激後付着性のセルは西部のしみや PCR などの手法を用意できます。</li>

3. マウスin Vivo IVIg + LPS および腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。0.2 μ g/g の体重の最終的な投与量を提供するために必要な LP (IMDM ストック濃度 100 μ g/mL) の量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg 原液を 500 μ l 添加し、LPS の 100 μ g/mL 溶液 40 μ L 必要です。</li>
	<li>IVIg の必要量を描画し、1 mL の滅菌注射器滅菌 26 装備に LPS ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌 PBS pH 7.4 の IVIg の相当量を交換してください。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>針マウスの腹部、右下の象限を基準にして 30-40 ° の角度で、ベベルし 1.5 cm。 挿入、IVIg + LP、または PBS + LP を挿入、腹腔と手順で 2.4 の場所。</li>
	<li>1 時間後 2.5 2.10 の手順を実行することによって腹腔マクロファージを収穫します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。回復された洗浄液の 1 mL を削除製造元の指示に従って IL-10 と IL-12/23 p 40 elisa 法による解析に使用したり、将来分析-80 ° C で凍結します。 注意: 洗浄液サイトカイン解析する試験治療間の比較を正確にするにはに、腹腔内の 5 mL flushs が 15 mL の最終巻の 4 回実行します。すべての流体は、各フラッシュから回復されます。</li>
	<li>2.11 の手順を再懸濁しますそして実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。</li></ol>典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合ステップ 2.11 のように、それらを削除するための製造元の指示に従って溶解手順を実行します。
	<li>2.12 の手順、再播種培地で細胞を中断します。 注: 実験の 1 つ以上のマウスからプールのセルに必要になる可能性があります。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。</li>
	<li>2.13 のように細胞にマクロファージを許可する 37 ° C 5% CO2で 1 時間インキュベート付着。</li>
	<li>収集し、すべての腹腔細胞から 1.14 1.15、手順に従って、馴化培地を明らかにします。 注: サンプルすぐに使用または凍結し、elisa 法によるサイトカイン解析-80 ° C で保存します。</li>
	<li>2.11、手順を実行が、24 h 物質の細胞を孵化させなさい。収集し、ELISA によるサイトカイン解析のための手順、1.16 1.17 に従って細胞の培養上清を明らかにします。 注: 手順 1.16 1.17 と 2.14 のように西部のしみや PCR など技術のセルを用意できます。</li>

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

マクロファージ活性化状態は、恒常性と疾患22を組織と両方で重要な役割を果たします。マクロファージはその微小環境3の手掛かりによって、アクティブ化の状態の重複だけでなく、個別に持つことができます。炎症性応答のすべての段階に個別の役割がある: 病原体に対する防衛、創傷治癒と組織の反発、また炎症性応答2 をオフにすることが重要です明確な抗炎症活性化状態にあります。.抗炎症マクロファージ活性化には、抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカイン IL 1223などの少量の大量に生産する大食細胞の 2 つの外部刺激が必要です。抗体 Fc のガンマの受容体を介して作用から来る 1 つの信号と 2 つ目の信号、LPS や肝腎などのプロ炎症性刺激24,25。マクロファージ8,<...

大食細胞は自然免疫系細胞、感染症やけがに免疫応答における複数の役割を果たすです。マクロファージは、感染、組織の損傷に免疫応答を開始する、炎症性応答を停止、治癒反応1を推進します。3 つの最適勉強マクロファージ活性化状態の例としては、: 1) マクロファージがインターフェロン γ (肝腎) と細菌リポポリサッカライド (LPS)、炎症性応答に貢献する M (肝腎 + LP) を指定2) マクロファージ インターロイキン 4 (IL-4)、M(IL-4)、刺激治療の応答に関連付けられています。3) マクロファージ免疫複合体 (IC) で刺激や LP、M (IC + LP)、炎症性応答の2,3を無効にする能力を持っています。M (IC + LP) M(IL-4) 治癒マクロファージ、異なっているし、酵素アルギナーゼ (Arg-1) または FIZZ14を表現しないでください。これらの抗炎症マクロファージの最高のマーカーは、そのサイトカイン生産5です。マクロファージは、健康を維持するために複数のロールを持つが、炎症性疾患やがん3にも貢献。このため、マクロファージが様々 な疾患の治療のためキーの治療上のターゲットです。抗体マクロファージによる疾患治療法の開発に、活性化状態を検討することが重要です。
本稿の焦点はマウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) とマクロファージ炎症性応答体外と体内に抗体医薬の効果をテストするための使用です。最近、マクロファージ活性化6,7,8抗体の効果を示す複数の調査がずっとあります。共同のマクロファージ免疫複合体、抗体抗原および LP、通常炎症性刺激との複合体であると抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカインの非常に低レベルの非常に高いレベルを生成します。インターロイキン 12 (IL-12)9。また、インフリキシマブ、tnf α、抗体、一部、そのフラグメント結晶 (Fc) 地域7を介して抗炎症大食細胞を誘導することによって動作するように発見されています。我々 は IVIg + LP が m (IC + LP)、共同誘導マクロファージが大量の IL-10 およびプロ炎症性サイトカイン サブユニット インターロイキン 12 の 23 p40 (少量を生成する前記のような抗炎症マクロファージの活性化を誘導することを報告しています。IL-12/23p40)、インターロイキン-6 (IL-6)、および TNF8。IVIg は、1,000 以上のドナー10の血からプールされて主に IgG ポリクローナル抗体から成る薬です。さまざまな慢性的な脱髄性多発性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫疾患の治療に使用されますが、その作用メカニズムは完全に理解11ではないです。マクロファージ活性化に基づく抗体医薬の効果は、ここに説明する方法を使用して評価できます。
BMDMs と腹腔マクロファージ マクロファージ活性化の特定の生物学的製剤の効果をテストできます。これらのマクロファージのソースを使用すると、一次電池の評価ができます。培養細胞における抗体の予備的なテストより少ない時間と他の時間がかかり、高価な疾患モデルよりも金銭的投資が必要です。健康なマウス生体内で薬を注入すると細胞を分離する前のヴィヴォそれらを分析、研究、生物学的製剤による治療疾患モデルにおけるマクロファージ活性化に影響を与えるかどうかを評価するために保証されているを決定できます。
マクロファージ活性化in vitroとin vivoでの生物学的製剤の効果を直接テストいくつかの研究は、当社の技術は代替技術上の優位性を提供します。現在の技術を含む混合細胞集団の in vitro、ひと末梢血単核細胞、マクロファージにリンパ球混合培養反応 (MLR) や IVIg におけるインフリキシマブの効果などに対するテストの生物学的薬剤の効果、効果特定のセル型7,12に起因することはできません。炎症性サイトカインを生成しない、RAW264.7 細胞など細胞株を使用してで有利である BMDMs および腹腔マクロファージを用いた IL-12 組合8,13に対応。血清サイトカイン レベル14 を測定することによって大食細胞の応答を推定のではなく、サイトカインは、マクロファージに直接帰することができるので利点がありますマクロファージ反応前のヴィヴォにおよぼす抗体創をテスト.BMDMs と腹腔マクロファージを派生し、抗炎症のマクロファージ活性化におけるタンパク質の特定の役割を決定する遺伝子組み換えマウスから分離できます。たとえば、 Il10欠乏を使いました(-/-) BMDMs IVIg がプロ炎症性サイトカイン産生の還元反応は IL-108に部分的に依存します。薬の作用機序は、ウェスタンブロット、特定の蛋白質のシグナル伝達における役割を決定ことができますを使用して調べることができます。BMDMs または腹腔マクロファージ活性化抗体に起因する遺伝子発現のパターンを表示するには、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を実行できます。マウスの病態モデルは炎症性腸疾患、関節リウマチ、癌15,16,のような病気のモデルで抗体を用いた生物学的治療の潜在的な有効性に関する情報を提供できます。17します。 ただし、ここで説明する方法に関する情報を提供これらのバイオ医薬品の作用機序彼らは抗炎症マクロファージ活性を誘導するかどうかを決定することによって。

<table><tbody><tr><td>イスコーブの修正ダルベッコ's medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスマクロファージコロニー刺激因子 (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X 赤血球溶解バッファー</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞解離バッファー</td><td>ライフサイエンス</td>テクノロジー <td>13150016</td><td>酵素フリー、ハンクスベース、EDTA</td></tr><tr><td>リポ多糖 (LPS)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L 4516</td><td>大腸菌由来 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>BC小児病院、輸血医学</td><td></td></tr><tr><td>から受領IVIg(ガンマガード液)</td><td>バクスター・ヘルスケア・コーポレーション</td><td>BC小児病院より、輸血医学</td><td></td></tr><tr><td>IVIg(オクタガム)</td>オ<td>クタファーマ</td><td>BC小児病院より受領、輸血医学</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(無菌)、pH 7.4</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>抗 Erk1/2 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗 pp38 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>フィッツジェラルド工業</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g 針</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mLシリンジ</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>BD biosciences 352096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>ファインチップ、解剖&nbsp;</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>VWR82027-582</td><td>デリケート、41/2"</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>逆位相差</td></tr><tr><td>スケール&nbsp;</td><td>メトラー&nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

マクロファージは、食細胞の自然免疫系の細胞、病原体に対する免疫応答を開始し、癒しと組織の反発に貢献。マクロファージは炎症性応答をオフにする均等に重要であります。マクロファージの免疫グロブリン (IVIg) で刺激が (IL-10)、抗炎症サイトカイン、インターロイキン 10 の多量、細菌リポ多糖 (応答のプロ炎症性サイトカインの低レベルを作り出すことができることを示したLPS)。IVIg は多価抗体は、主に免疫グロブリン (Igg)、Gs は以上 1,000 の献血者のプラズマからプールです。免疫不全症患者における抗体を補完する、または自己免疫・炎症性疾患患者の免疫応答を抑制するものです。インフリキシマブ治療抗腫瘍の壊死の要因アルファ (tnf α) 抗体は、マクロファージ炎症性の刺激への応答の IL-10 を生成するアクティブにも示されています。IVIg と他の抗体を用いた生物は、マクロファージ活性化に及ぼす影響を確認するテストできます。本稿では、派生、刺激との in vitro抗体によるマウス骨髄マクロファージと抗体の生体内で活性化マウス腹腔マクロファージの評価法について説明します。最後に、我々 は特定の細胞シグナル伝達に抗炎症マクロファージ活性経路の寄与を決定する西部にしみが付く使用を示します。これらのプロトコルは、特定の蛋白の抗炎症マクロファージ活性化に及ぼす影響を決定する遺伝子改変マウスを使用できます。これらのテクニックは、特定生物製剤は大食細胞を炎症反応で生体を減らす IL 10 生産抗炎症活性化状態に変更することにより行動できるかどうかを評価するためにも使用できます。これはマウスの病態モデルの中に生物学的製剤の有効性のマクロファージ活性化の役割に関する情報を提供し、人々 の行動の潜在的な新しいメカニズムへの洞察力を提供できます。逆に、これに警告するかもしれない特定抗体を用いた生物学的製剤の使用に対して感染症を治療するためにマクロファージがその感染に対する宿主防御において重要な役割を果たす場合に特に。

マウス骨骨髄由来マクロファージは、骨髄の造血細胞前駆体から培養することができます。骨髄吸引から大腿骨および脛骨 1 つ c57bl/6 マウスの通常プールをもたらす 107骨髄由来マクロファージ、それらにマクロファージ実験のための便利なソースを作るします。BMDMs は、ベース抗体薬物反応を炎症性刺激体外挑戦されたときをテストする使用できます。図 1に示す Gammunex (GX) + LP 増加抗炎症サイトカインの生産、IVIg ブランド IL-10, LPS 刺激だけで (図 1A) と比較して、生産の IL-12/23 p 40 (図 1 を減少させます B)。図 1はまた異なる IVIg 製剤、動作が異なることを示します...

抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

これらの実験の全体的な目標は、マウスの骨髄と腹膜マクロファージを使用して、抗炎症性マクロファージの活性化状態に対する抗体ベースの薬物の効果を決定することです。この方法は、マクロファージをIL-10産生抗炎症活性化状態に変化させることで特異的抗体薬が作用するのかなど、免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vitroで骨髄から、in vivoで腹腔からマウスマクロファージの初代マクロファージの応答を測定することです。この手順は滅菌フードで行ってください。安楽死させたマウスを仰臥位にして、手足を広げて発泡スチロールボードに固定します。次に、70%エタノールで脚を清掃します。次に、約2ミリメートルの深さに浅い切り込みを入れて、各後ろ足の表面から皮膚と毛皮を取り除きます。次に、組織を解剖して脛骨と大腿骨にアクセスします。脛骨と大腿骨を取り除くには、股関節のすぐ下、足首の上の骨と筋肉を切断します。次に、骨からできるだけ多くの筋肉組織を取り除きます。次に、70%エタノールで骨をきれいにし、1分間蒸発させます。次に、骨肉メディウムで満たされた6ウェルプレートに骨を置きます。プレートで、大腿骨の両端から1ミリメートルトリミングして、内側の空洞が露出するようにします。26ゲージの針が空洞にアクセスできることを確認してください。次に、脛骨と大腿骨を膝関節から分離します。その後、10ミリリットルの注射器に取り付けた針を骨腔に挿入し、骨髄を採取します。4つの骨すべてから骨髄を50ミリリットルの円錐管に引き込み、5ミリリットルの骨肉ミディアムを入れます。中盤と骨髄を数回上下にパイプで送ります。または、低速で渦巻いて、懸濁液内の塊を穏やかに分散させます。骨髄のひもは、長さが半ミリメートル未満の骨髄の小さな斑点に分割する必要があります。次に、骨肉培地でチューブを50ミリリットルに膨らませ、75平方センチメートルの組織培養フラスコに移します。骨髄を1時間インキュベートします。インキュベーション中、成熟した細胞はフラスコに付着し、所望の造血前駆細胞は懸濁液のままになります。懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をスピンダウンしてペレットにします。次に、上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルのMCSF培地に再懸濁します。次に、セル密度をミリリットルあたり500, 000に調整し、新しい75平方センチメートルのフラスコに30ミリリットルをロードします。細胞の培養を続け、4日目、7日目、10日目に、逆位相コントラストブレークフィールド顕微鏡を使用して、細胞が付着し、わずかに分岐していることを確認します。細胞を確認するときは、非接着細胞を含む培地を廃棄してください。次に、接着細胞をIMDMで1回洗浄し、30ミリリットルの新鮮なMCSF培地をフラスコに戻します。10日目に、培地を8ミリリットルの酵素を含まないEDTAベースの細胞解離バッファーと交換して、細胞を回収します。細胞を短時間インキュベートした後、細胞をやさしく掻き取り、顕微鏡で細胞が放出されたことを確認します。細胞が放出されたら、細胞とともにバッファーを50ミリリットルの円錐管に移します。次に、フラスコを5ミリリットルのIMDMで3回すすぎ、さらに細胞を収集します。すべてのコレクションを引き出し、遠心分離機にかけ、ペレットを3ミリリットルのMCSFに再懸濁します。次に、細胞を数え、その濃度を1ミリリットルあたり100万個に調整します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルの平底プレートにプレートします。プレート全体が充填可能である必要があります。細胞が接着するまで約1時間培養します。次に、IMDMで調製した異なる濃度のLPSまたは静脈内免疫グロブリン、あるいはその両方でそれらを刺激します。すべての操作を重複または三重に実行し、未処理のコントロールを保持するようにしてください。その後、細胞を24時間インキュベートし、上清を分析します。必要量の免疫グロブリンとLPSを1ミリリットルの注射器に用意し、26ゲージの針を取り付けます。コントロールには、代わりに PBS と LPS を使用します。マウスの首筋をつかみ、片手で後肢と尻尾を固定します。腹部の右下腹部を狙い、斜角を上にして針を30〜40度の角度で挿入し、約1.5センチ挿入します。次に、ボーラスを注入します。1時間後、マウスを安楽死させた後、腹膜マクロファージを採取します。滅菌フードで、安楽死させたマウスを手足を広げた発泡スチロールボードに固定し、腹部を70%エタノールで滅菌します。次に、正中線に沿って2ミリメートルの浅い切開を行い、腹部の皮膚を引き抜きます。腹膜壁に穴を開けないでください。次に、pH 7.4の滅菌PBSを含む5ミリリットルの注射器を完全にロードし、25ゲージまたは27ゲージの針を使用して、腹腔の上部に、針の斜角を上にして、両側から正中線に向かってマウスを注入します。針を引き抜いた後、腹膜を10秒間マッサージして細胞を取り除きます。次に、針を再度挿入してキャビティに戻し、約3.75ミリリットルの洗浄液を収集します。洗液を氷上の15ミリリットルの円錐管に移します。注射、マッサージ、洗濯液の収集をさらに3回繰り返し、すべてのコレクションを同じチューブに引き込みます。最終的な収集中に、マウスの反対側から洗浄液を引き出す方が簡単な場合があります。次に、細胞をスピンダウンし、500マイクロリットルのめっき培地に再懸濁します。次に、生存可能なマクロファージを数え、1ミリリットルあたり100万個で再懸濁します。次に、100マイクロリットルの懸濁液を96ウェルの平底プレートのウェルにプレートします。次に、細胞を1時間インキュベートします。腹膜マクロファージがプレートに付着します。次に、非接着性細胞を除去し、200マイクロリットルの温かいIMDMで各ウェルを2回すすぎます。各洗浄後、10秒待ってから、プレートをゆっくりと傾けてすすぎ液を引っ張ります。洗浄後、100マイクロリットルのめっき培地を戻し、プレートをインキュベーターに入れます。ELISAの場合、刺激なしで細胞を24時間インキュベートし続けます。次に、サイトカイン分析のために馴染ませた培地を収集し、清澄化します。BMDMは、in vitroで炎症刺激を受けた場合の抗体ベースの薬物反応の試験に使用できます。LPSによる免疫グロブリンの静脈内投与は、LPS刺激単独と比較して、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を7倍に増加させます。そして、IL-12/23p40の産生を減少させます。さらに、免疫グロブリンの単独またはLPSによる静脈内刺激は、MAPキナーゼERK1/2の活性化を増加させ、早期および長期のリン酸化を伴いました。P-38の活性化もより早く行われました。さらに、腹膜マクロファージは、PBS注射マウスと比較して、in vitroでの刺激によりIL-10産生を有意に増加させました。次に、サイトカイン産生を洗浄液およびex vivo刺激腹膜マクロファージからの上清で評価しました。IL-10は、マウスに免疫グロブリンとLPSを静脈内投与すると、洗浄液、腹膜細胞、および腹膜マクロファージで増加しました。これに対し、炎症性サイトカインサブユニットIL-12/23p40の産生は、培養された腹膜マクロファージでは有意に減少しましたが、洗浄液では減少しませんでした。このビデオを見れば、マウスの骨髄と腹膜マクロファージを使用して、in vitroおよびin vivoでマクロファージの活性化状態に対する抗体ベースの薬剤の効果をテストする方法について十分に理解できるはずです。

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します...

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抗体に応答したマウス骨髄由来マクロファージの活性化

このビデオは、免疫グロブリンと細菌のリポ多糖類を静脈内投与してマウスの腹膜マクロファージを活性化する様子を実演しています。この共刺激により、腹膜マクロファージが活性化され、免疫調節活性を有する抗炎症性マクロファージが活性化されます。...

マウスモデルにおける抗体に応答した腹膜マクロファージのin vivo活性化

このビデオでは、破骨細胞の祖先から破骨細胞が形成されるプロセスである破骨細胞形成に対する、異なる抗c-fms抗体濃度の影響を示しています。...

In vitroでのマウス骨髄細胞の破骨細胞形成に対する抗C-fms抗体の効果

マクロファージは、長い自然免疫と獲得免疫応答の重要な構成要素として認識されている。マクロファージや微生物間の相互作用の進化遺伝的、および生化学的な側面に関する知識の最近の爆発はマクロファージへの科学的関心をリニューアルしました。この記事では、マウスの骨髄からマクロファージを差別化する方法を説明している。...

骨髄由来マクロファージの生産

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T...

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

このプロトコルにはマウス長管骨および骨髄分離、骨髄のマクロファージを生成し、破骨細胞マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化剤を使用するが含まれていますか腫瘍壊死因子 α (TNF-α) と M-CSF 受容体抗体抗 c fms...

破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。...

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

樹状細胞の取り込み抗原およびT細胞に処理された抗原を提示する免疫器官に向かって移動する。 Qdot...

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

学ぶマウス骨髄マクロファージと腹腔マクロファージを用いた抗体薬剤の抗炎症活性化効果評価法。in vitroおよびin vivoでIL-10産生を指標に薬剤応答を測定し、免疫学研究に有用な実験系を提供します。

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

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