マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

これらの実験の全体的な目標は、マウスの骨髄と腹膜マクロファージを使用して、抗炎症性マクロファージの活性化状態に対する抗体ベースの薬物の効果を決定することです。この方法は、マクロファージをIL-10産生抗炎症活性化状態に変化させることで特異的抗体薬が作用するのかなど、免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vitroで骨髄から、in vivoで腹腔からマウスマクロファージの初代マクロファージの応答を測定することです。

この手順は滅菌フードで行ってください。安楽死させたマウスを仰臥位にして、手足を広げて発泡スチロールボードに固定します。次に、70%エタノールで脚を清掃します。

次に、約2ミリメートルの深さに浅い切り込みを入れて、各後ろ足の表面から皮膚と毛皮を取り除きます。次に、組織を解剖して脛骨と大腿骨にアクセスします。脛骨と大腿骨を取り除くには、股関節のすぐ下、足首の上の骨と筋肉を切断します。

次に、骨からできるだけ多くの筋肉組織を取り除きます。次に、70%エタノールで骨をきれいにし、1分間蒸発させます。次に、骨肉メディウムで満たされた6ウェルプレートに骨を置きます。

プレートで、大腿骨の両端から1ミリメートルトリミングして、内側の空洞が露出するようにします。26ゲージの針が空洞にアクセスできることを確認してください。次に、脛骨と大腿骨を膝関節から分離します。

その後、10ミリリットルの注射器に取り付けた針を骨腔に挿入し、骨髄を採取します。4つの骨すべてから骨髄を50ミリリットルの円錐管に引き込み、5ミリリットルの骨肉ミディアムを入れます。中盤と骨髄を数回上下にパイプで送ります。

または、低速で渦巻いて、懸濁液内の塊を穏やかに分散させます。骨髄のひもは、長さが半ミリメートル未満の骨髄の小さな斑点に分割する必要があります。次に、骨肉培地でチューブを50ミリリットルに膨らませ、75平方センチメートルの組織培養フラスコに移します。

骨髄を1時間インキュベートします。インキュベーション中、成熟した細胞はフラスコに付着し、所望の造血前駆細胞は懸濁液のままになります。懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をスピンダウンしてペレットにします。

次に、上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルのMCSF培地に再懸濁します。次に、セル密度をミリリットルあたり500, 000に調整し、新しい75平方センチメートルのフラスコに30ミリリットルをロードします。細胞の培養を続け、4日目、7日目、10日目に、逆位相コントラストブレークフィールド顕微鏡を使用して、細胞が付着し、わずかに分岐していることを確認します。

細胞を確認するときは、非接着細胞を含む培地を廃棄してください。次に、接着細胞をIMDMで1回洗浄し、30ミリリットルの新鮮なMCSF培地をフラスコに戻します。10日目に、培地を8ミリリットルの酵素を含まないEDTAベースの細胞解離バッファーと交換して、細胞を回収します。

細胞を短時間インキュベートした後、細胞をやさしく掻き取り、顕微鏡で細胞が放出されたことを確認します。細胞が放出されたら、細胞とともにバッファーを50ミリリットルの円錐管に移します。次に、フラスコを5ミリリットルのIMDMで3回すすぎ、さらに細胞を収集します。

すべてのコレクションを引き出し、遠心分離機にかけ、ペレットを3ミリリットルのMCSFに再懸濁します。次に、細胞を数え、その濃度を1ミリリットルあたり100万個に調整します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルの平底プレートにプレートします。

プレート全体が充填可能である必要があります。細胞が接着するまで約1時間培養します。次に、IMDMで調製した異なる濃度のLPSまたは静脈内免疫グロブリン、あるいはその両方でそれらを刺激します。

すべての操作を重複または三重に実行し、未処理のコントロールを保持するようにしてください。その後、細胞を24時間インキュベートし、上清を分析します。必要量の免疫グロブリンとLPSを1ミリリットルの注射器に用意し、26ゲージの針を取り付けます。

コントロールには、代わりに PBS と LPS を使用します。マウスの首筋をつかみ、片手で後肢と尻尾を固定します。腹部の右下腹部を狙い、斜角を上にして針を30〜40度の角度で挿入し、約1.5センチ

次に、ボーラスを注入します。1時間後、マウスを安楽死させた後、腹膜マクロファージを採取します。滅菌フードで、安楽死させたマウスを手足を広げた発泡スチロールボードに固定し、腹部を70%エタノールで滅菌します。

次に、正中線に沿って2ミリメートルの浅い切開を行い、腹部の皮膚を引き抜きます。腹膜壁に穴を開けないでください。次に、pH 7.4の滅菌PBSを含む5ミリリットルの注射器を完全にロードし、25ゲージまたは27ゲージの針を使用して、腹腔の上部に、針の斜角を上にして、両側から正中線に向かってマウスを注入します。

針を引き抜いた後、腹膜を10秒間マッサージして細胞を取り除きます。次に、針を再度挿入してキャビティに戻し、約3.75ミリリットルの洗浄液を収集します。洗液を氷上の15ミリリットルの円錐管に移します。

注射、マッサージ、洗濯液の収集をさらに3回繰り返し、すべてのコレクションを同じチューブに引き込みます。最終的な収集中に、マウスの反対側から洗浄液を引き出す方が簡単な場合があります。次に、細胞をスピンダウンし、500マイクロリットルのめっき培地に再懸濁します。

次に、生存可能なマクロファージを数え、1ミリリットルあたり100万個で再懸濁します。次に、100マイクロリットルの懸濁液を96ウェルの平底プレートのウェルにプレートします。次に、細胞を1時間インキュベートします。

腹膜マクロファージがプレートに付着します。次に、非接着性細胞を除去し、200マイクロリットルの温かいIMDMで各ウェルを2回すすぎます。各洗浄後、10秒待ってから、プレートをゆっくりと傾けてすすぎ液を引っ張ります。

洗浄後、100マイクロリットルのめっき培地を戻し、プレートをインキュベーターに入れます。ELISAの場合、刺激なしで細胞を24時間インキュベートし続けます。次に、サイトカイン分析のために馴染ませた培地を収集し、清澄化します。

BMDMは、in vitroで炎症刺激を受けた場合の抗体ベースの薬物反応の試験に使用できます。LPSによる免疫グロブリンの静脈内投与は、LPS刺激単独と比較して、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を7倍に増加させます。そして、IL-12/23p40の産生を減少させます。

さらに、免疫グロブリンの単独またはLPSによる静脈内刺激は、MAPキナーゼERK1/2の活性化を増加させ、早期および長期のリン酸化を伴いました。P-38の活性化もより早く行われました。さらに、腹膜マクロファージは、PBS注射マウスと比較して、in vitroでの刺激によりIL-10産生を有意に増加させました。

次に、サイトカイン産生を洗浄液およびex vivo刺激腹膜マクロファージからの上清で評価しました。IL-10は、マウスに免疫グロブリンとLPSを静脈内投与すると、洗浄液、腹膜細胞、および腹膜マクロファージで増加しました。これに対し、炎症性サイトカインサブユニットIL-12/23p40の産生は、培養された腹膜マクロファージでは有意に減少しましたが、洗浄液では減少しませんでした。

このビデオを見れば、マウスの骨髄と腹膜マクロファージを使用して、in vitroおよびin vivoでマクロファージの活性化状態に対する抗体ベースの薬剤の効果をテストする方法について十分に理解できるはずです。